一种曲霉菌分生孢子悬液的制备方法与流程

本发明涉及一种曲霉菌分生孢子悬液的制备方法，尤其适于用作菌种诱变或用于抑菌物质活性验证实验的材料。

背景技术：

曲霉菌是一类在自然界中广泛分布的霉菌，其菌丝体十分发达，有隔膜，多分枝，主要通过分生孢子进行繁殖。常见的曲霉菌主要有黑曲霉、黄曲霉、米曲霉、烟曲霉等种类，这些曲霉菌在酿造及食品加工等产业中具有重要的作用。在食品工业中，曲霉菌具有举足轻重的作用，部分菌种已用于多种食品原辅料的生产，如柠檬酸、葡萄糖酸、曲酸、红色素及淀粉酶、纤维素酶等多种酶类。在工业生产中，为了充分发挥曲霉菌的作用，常常需要通过诱变的方式改造菌种，以提高有机酸、酶等有益产物的产量；但曲霉菌为多细胞的丝状微生物，不可将菌丝作为诱变出发材料，只能以分散均匀的孢子悬液作为诱变材料，以提高诱变的成功率。

曲霉菌也是造成工农业产品腐败、人及动物患病的重要原因。曲霉菌除了能造成工农业产品腐败变质外，其产生的黄曲霉毒素、烟曲霉毒素等毒素严重威胁着人类健康，并造成动物养殖业的巨大损失。为了开发新的抑霉物质，越来越多的天然或合成物质将进行抑霉活性测定，以评价其在工农业生产中的应用潜力。在测定天然或合成物质抑制霉菌活性时，也需要将霉菌孢子制成均匀分散的悬液后，才可用于测定该种物质抑制孢子萌发的抑制率、最小抑菌浓度和最小杀菌浓度等指标。

霉菌孢子具有较高的疏水性，容易聚集，不易在水中充分分散。到目前为止，曲霉菌分生孢子悬液的制备方法存在较大缺陷：在布满孢子的培养皿中加蒸馏水或吐温80水溶液，然后用接种环刮取孢子，因培养皿开口较大，很容易染菌，且会将较多的菌丝刮到孢子悬液中；用脱脂棉或3-6层脱脂纱布过滤孢子悬液除菌丝，易造成大量孢子吸附在脱脂棉或纱布上，降低了孢子收率；用移液器枪头吹吸或在孢子液中加玻璃珠振荡的方法进行分散孢子，孢子分散不充分，往往还有大量的双孢子、三孢子甚至孢子团存在。采用分散不充分的孢子进行诱变获得假阳性正向突变的概率较高，严重影响诱变的效率，同样也不适于活性物质对孢子萌发抑制率的测定实验。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种曲霉菌分生孢子悬液的制备方法，用该方法制备的孢子悬液孢子分散均匀、无聚集，适用于菌种诱变实验和活性物质的抑菌实验。

本发明的技术解决方案是：一种曲霉菌分生孢子悬液的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

（1）曲霉菌菌种活化：将低温保藏的曲霉菌菌种接种到pda试管斜面活化；

（2）培养分生孢子：活化后转接至大号pda试管斜面上，培养至斜面布满分生孢子；

（3）洗脱分生孢子：将洗脱液加入布满分生孢子的试管中，振荡使分生孢子脱离菌丝；

（4）洗脱液过滤：将振荡后富含分生孢子的洗脱液进行过滤；

（5）滤液酶处理：滤液中加入蛋白酶进行处理；

（6）洗涤分生孢子：酶处理完毕后进行洗涤，获得分生孢子沉淀；

（7）分生孢子重悬：在分生孢子沉淀中加入重悬液重悬，并超声振荡混匀；

（8）计数、稀释：超声振荡混匀后，经计数、稀释，即得分生孢子分散均匀的悬液。

步骤（1）中，所述的曲霉菌菌种活化是：取4℃保藏的曲霉菌菌种斜面，用接种铲挖取带菌丝菌块，将菌块接种至普通pda试管斜面上，带菌丝面紧贴培养基，塞好塞子后置于30℃培养箱避光培养3-5天，直至长出分生孢子。

步骤（2）中，所述的培养分生孢子是：采用接种环刮取步骤（1）所培养的分生孢子，划线接种于32×200mm的pda试管斜面上，塞好塞子后30℃避光培养3-5天，直至试管斜面布满分生孢子。

步骤（3）中，所述的洗脱分生孢子是：步骤（2）所培养的布满分生孢子的曲霉菌试管斜面，加入10-15ml预灭菌洗脱液，倾斜试管使布满分生孢子的固体斜面向上，置于旋涡混合器上，300~500rpm振荡20-30s，将曲霉菌菌丝上的分生孢子充分洗脱下来。

其中，所述的预灭菌洗脱液是：质量浓度0.03-0.05%吐温80的50mmol/ltris-hcl、ph7.5。

步骤（4）中，所述的洗脱液过滤是：将步骤（3）获得的分生孢子洗脱液采用灭菌的10cm×15cm四层叠加的显微镜擦镜纸进行过滤，滤除洗脱液中的菌丝片段，含分生孢子的滤液收集入50ml的无菌三角瓶中。

步骤（5）中，所述的滤液酶处理是：步骤（4）过滤后分生孢子滤液中加入过滤除菌的20mg/ml蛋白酶k溶液，至酶终浓度为0.2-0.5mg/ml，37℃恒温水浴振荡器60-100rpm酶处理20-40min，去除分生孢子表面疏水蛋白。

步骤（6）中，所述的洗涤分生孢子是：步骤（5）酶处理后的分生孢子滤液置于冷冻离心机中4℃、6000-8000rpm条件下离心6-10min，沉淀中加入灭菌的20ml的质量浓度0.03-0.05%吐温80水溶液洗涤分生孢子，再用上述冷冻离心条件离心6-10min，得到无杂质的分生孢子沉淀。

步骤（7）中，所述的分生孢子重悬是：步骤（6）所得的分生孢子沉淀中加入已灭菌的20ml无菌的质量浓度0.03-0.05%吐温80和20-30mmol/l尿素的重悬液重悬孢子，将孢子悬液转移至无菌的50ml三角瓶后，放入超声波清洗器中，室温30khz-50khz超声振荡20-30s，使孢子充分分散。

步骤（8）中，所述的计数、稀释是：用光学显微镜观察并计数步骤（7）所得的分生孢子重悬液，用无菌水将悬液的分生孢子浓度稀释至10⁶-10⁷cfu/ml，放入4℃冰箱中保存备用。

本发明与现有技术相比的优点在于：

一、用32×200mm试管斜面培养霉菌孢子，因培养基斜面面积较大，可培养足够量的孢子；又因试管口较培养皿开口小，在洗脱孢子时不易染菌；

二、在布满孢子的试管中加入洗脱液，通过旋涡混合器振荡的方式洗脱孢子，既能较彻底的将分生孢子洗脱至洗脱液中，又可避免将霉菌菌丝带入到洗脱液中；

三、用四层显微镜擦镜纸过滤分生孢子悬液，既可除去带入到孢子悬液中的少量菌丝，又可避免用脱脂棉或脱脂纱布过滤造成大量孢子损失、孢子收率低的问题；

四、用蛋白酶k处理分生孢子悬液，可除去分生孢子表面的部分疏水蛋白，避免因孢子表面疏水蛋白的存在引起的孢子间的聚集；

五、应用超声波清洗仪在低频率下振荡分生孢子悬液，可使悬液中聚集的双孢子、三孢子或多孢子团分散开；

六、悬液中的吐温80能使分生孢子在悬液中较好的分散，同时悬液中的尿素能够避免孢子间因孢壁多糖分子形成氢键而引起聚集，在吐温80和尿素的双重作用下，分生孢子悬液更加稳定。

附图说明

图1为用传统方法制备的黄曲霉分生孢子悬液中分生孢子的分散状态；

图2为用本发明方法制备的黄曲霉分生孢子悬液中分生孢子的分散状态。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术方案的限制。

实例1：黑曲霉分生孢子悬液制备

（1）曲霉菌菌种活化：取4℃保藏的黑曲霉as3.939菌种斜面，用接种铲挖取带菌丝菌块，将菌块接种至普通pda试管斜面上，带菌丝面紧贴培养基，塞好塞子后置于30℃培养箱避光培养3天，直至长出分生孢子；

（2）培养分生孢子：采用接种环刮取步骤（1）所培养的黑曲霉as3.939分生孢子，划线接种于32×200mm的pda试管斜面上，塞好塞子后30℃避光培养3天，直至试管斜面布满分生孢子；

（3）洗脱分生孢子：步骤（2）所培养的布满分生孢子的黑曲霉as3.939试管斜面，加入10ml预灭菌洗脱液，倾斜试管使布满分生孢子的固体斜面向上，置于旋涡混合器上，300rpm振荡30s，将菌丝上的分生孢子充分洗脱下来；其中，所述的预灭菌洗脱液是：质量浓度0.03%吐温80的50mmol/ltris-hcl、ph7.5；

（4）洗脱液过滤：将步骤（3）获得的分生孢子洗脱液采用灭菌的10cm×15cm四层叠加的显微镜擦镜纸进行过滤，滤除洗脱液中的菌丝片段，含分生孢子的滤液收集入50ml的无菌三角瓶中；

（5）滤液酶处理：步骤（4）过滤后分生孢子滤液中加入过滤除菌的20mg/ml蛋白酶k溶液，至酶终浓度为0.2mg/ml，37℃恒温水浴振荡器60rpm酶处理40min，去除分生孢子表面疏水蛋白；

（6）洗涤分生孢子：步骤（5）酶处理后的分生孢子滤液置于冷冻离心机中4℃、6000rpm条件下离心10min，沉淀中加入灭菌的20ml的质量浓度0.03%吐温80水溶液洗涤分生孢子，再用上述冷冻离心条件离心10min，得到无杂质的分生孢子沉淀；

（7）分生孢子重悬：步骤（6）所得的分生孢子沉淀中加入已灭菌的20ml无菌的质量浓度0.03%吐温80和20mmol/l尿素的重悬液重悬孢子，将孢子悬液转移至无菌的50ml三角瓶后，放入超声波清洗器中，室温30khz超声振荡30s，使孢子充分分散；

（8）计数、稀释：用光学显微镜观察并计数步骤（7）所得的分生孢子重悬液，用无菌水将悬液的分生孢子浓度稀释至10⁶-10⁷cfu/ml，放入4℃冰箱中保存，用于黑曲霉as3.939菌种诱变以提高柠檬酸产量。

实例2：米曲霉分生孢子悬液制备

（1）曲霉菌菌种活化：取4℃保藏的米曲霉as3.863菌种斜面，用接种铲挖取带菌丝菌块，将菌块接种至普通pda试管斜面上，带菌丝面紧贴培养基，塞好塞子后置于30℃培养箱避光培养4天，直至长出分生孢子；

（2）培养分生孢子：采用接种环刮取步骤（1）所培养的米曲霉as3.863分生孢子，划线接种于32×200mm的pda试管斜面上，塞好塞子后30℃避光培养4天，直至试管斜面布满分生孢子；

（3）洗脱分生孢子：步骤（2）所培养的布满分生孢子的试管斜面，加入12.5ml预灭菌洗脱液，倾斜试管使布满分生孢子的固体斜面向上，置于旋涡混合器上，400rpm振荡25s，将菌丝上的分生孢子充分洗脱下来；其中，所述的预灭菌洗脱液是：质量浓度0.04%吐温80的50mmol/ltris-hcl、ph7.5；

（4）洗脱液过滤：将步骤（3）获得的分生孢子洗脱液采用灭菌的10cm×15cm四层叠加的显微镜擦镜纸进行过滤，滤除洗脱液中的菌丝片段，含分生孢子的滤液收集入50ml的无菌三角瓶中；

（5）滤液酶处理：步骤（4）过滤后分生孢子滤液中加入过滤除菌的20mg/ml蛋白酶k溶液，至酶终浓度为0.35mg/ml，37℃恒温水浴振荡器80rpm酶处理30min，去除分生孢子表面疏水蛋白；

（6）洗涤分生孢子：步骤（5）酶处理后的分生孢子滤液置于冷冻离心机中4℃、7000rpm条件下离心8min，沉淀中加入灭菌的20ml的质量浓度0.04%吐温80水溶液洗涤分生孢子，再用上述冷冻离心条件离心8min，得到无杂质的分生孢子沉淀；

（7）分生孢子重悬：步骤（6）所得的分生孢子沉淀中加入已灭菌的20ml无菌的质量浓度0.04%吐温80和25mmol/l尿素的重悬液重悬孢子，将孢子悬液转移至无菌的50ml三角瓶后，放入超声波清洗器中，室温40khz超声振荡25s，使孢子充分分散；

（8）计数、稀释：用光学显微镜观察并计数步骤（7）所得的分生孢子重悬液，用无菌水将悬液的分生孢子浓度稀释至10⁶-10⁷cfu/ml，放入4℃冰箱中保存，用于米曲霉as3.863菌种诱变以提高蛋白酶产量。

实例3：黄曲霉分生孢子悬液制备

（1）曲霉菌菌种活化：取4℃保藏的黄曲霉as3.3950菌种斜面，用接种铲挖取带菌丝菌块，将菌块接种至普通pda试管斜面上，带菌丝面紧贴培养基，塞好塞子后置于30℃培养箱避光培养5天，直至长出分生孢子；

（2）培养分生孢子：采用接种环刮取步骤（1）所培养的黄曲霉as3.3950分生孢子，划线接种于32×200mm的pda试管斜面上，塞好塞子后30℃避光培养5天，直至试管斜面布满分生孢子；

（3）洗脱分生孢子：步骤（2）所培养的布满分生孢子的试管斜面，加入15ml预灭菌洗脱液，倾斜试管使布满分生孢子的固体斜面向上，置于旋涡混合器上，500rpm振荡20s，将菌丝上的分生孢子充分洗脱下来；其中，所述的预灭菌洗脱液是：质量浓度0.05%吐温80的50mmol/ltris-hcl、ph7.5；

（4）洗脱液过滤：将步骤（3）获得的分生孢子洗脱液采用灭菌的10cm×15cm四层叠加的显微镜擦镜纸进行过滤，滤除洗脱液中的菌丝片段，含分生孢子的滤液收集入50ml的无菌三角瓶中；

（5）滤液酶处理：步骤（4）过滤后分生孢子滤液中加入过滤除菌的20mg/ml蛋白酶k溶液，至酶终浓度为0.5mg/ml，37℃恒温水浴振荡器100rpm酶处理20min，去除分生孢子表面疏水蛋白；

（6）洗涤分生孢子：步骤（5）酶处理后的分生孢子滤液置于冷冻离心机中4℃、8000rpm条件下离心6min，沉淀中加入灭菌的20ml的质量浓度0.05%吐温80水溶液洗涤分生孢子，再用上述冷冻离心条件离心6min，得到无杂质的分生孢子沉淀；

（7）分生孢子重悬：步骤（6）所得的分生孢子沉淀中加入已灭菌的20ml无菌的质量浓度0.05%吐温80和30mmol/l尿素的重悬液重悬孢子，将孢子悬液转移至无菌的50ml三角瓶后，放入超声波清洗器中，室温50khz超声振荡20s，使孢子充分分散；

（8）计数、稀释：用光学显微镜观察并计数步骤（7）所得的分生孢子重悬液，用无菌水将悬液的分生孢子浓度稀释至10⁶-10⁷cfu/ml，放入4℃冰箱中保存，用于抑制黄曲霉as3.3950活性实验。