一种HEK293细胞无血清培养基的制作方法

本发明涉及细胞培养技术领域，更具体地说，尤其涉及一种hek293细胞无血清培养基及应用。

背景技术：

hek293细胞是抗体和重组蛋白表达的重要平台。根据表达的时间不同，可将基因产物表达分为瞬时表达与稳定表达。稳定表达是抗体药物生产系统的金标准，不过其过程耗费时间长，费用高，不利于大通量、高效率地筛选新的抗体药物。瞬时基因表达技术是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合至染色体，较短时间内就可获得目的基因的表达产物，但随着细胞的分裂增殖，这种外源基因最终会消失，表达持续时间为几天到两周。此技术大大缩短了微量至中等量重组抗体的生产过程，从而为抗体药物的快速生产、早期筛选和功能、毒理分析提供有效的手段。

瞬时基因表达技术常用的宿主细胞有hek293细胞、cho细胞等，hek293细胞具有生长速度快，易于转染等优点，在抗体药物的快速高效表达和功能分析时，具有很好的优势。因而hek293的瞬时表达已成为生物制药企业常用技术平台之一。不过瞬时表达虽然具有快速、简便、易操作的特点，但是蛋白产量有时却不太理想。另外，目前hek293培养基市场为sigma、invitrogen、hyclone和lonza等国际知名培养基占领，价格昂贵，每升高达上千元，不利于企业降低成本。

无血清培养二用不含血清的培养基培养动物细胞的方法。无血清培养基一般是由基础培养基和替代血清的补充因子组成的。无血清培养技术是细胞培养研究中的一个里程碑。由于无血清培养基全部是由已知成分组成的，不仅为研究和阂明细胞生长、增殖和分化的机制这一生命科学中的根本间题提供了有力的工具，而且为现代生物技术如基因工程、蛋白质工程、细胞工程和单克隆抗体等的应用奠定了基础。

目前，缺乏一种可明显提高蛋白表达量、可以在更短的时间获得更多蛋白，更有利于抗体快速生产的hek293细胞无血清培养基。

技术实现要素：

本发明提供了一种低成本的、高效瞬时表达抗体药物的hek293细胞无血清培养基及其应用。

为了解决现有技术的问题，一方面，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种hek293细胞无血清培养基，所述的hek293细胞无血清培养基由如下组分组成或包含如下组分：

在一个实施方式中，所述的hek293细胞无血清培养基由如下组分组成或包括如下组分：

氯化铝6.91e-06

乙酸钡6.28e-06

生物素1.38e-04

氯化镉3.58e-05

泛酸钙7.68e-03

氯化胆碱1.35e-02

氯化钴6.75e-06

氯化铜3.22e-04

葡萄糖4.00e+00

乙醇胺4.84e-03

硝酸铁5.33e-04

叶酸2.59e-02

谷胱甘肽6.00e-03

4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.04e+00

肌醇9.13e-03

精氨酸6.55e-01

天冬酰胺6.78e-01

天冬氨酸1.55e-01

半胱氨酸3.52e-02

谷氨酸4.24e-01

组氨酸8.28e-02

羟脯胺酸1.01e-02

异亮氨酸3.95e-01

亮氨酸6.08e-01

赖氨酸4.03e-01

蛋氨酸6.05e-02

苯丙氨酸9.07e-03

脯氨酸2.34e-01

丝氨酸4.91e-01

苏氨酸2.42e-01

色氨酸3.63e-01

络氨酸2.49e-01

缬氨酸3.63e-01

氯化镁6.08e-02

氯化锰3.26e-06

烟酰胺3.53e-03

苯丙氨酸1.03e-02

pluronicf686.00e-01

氯化钾2.64e-01

碘化钾3.15e-06

腐胺2.31e-02

硫胺素6.98e-03

维生素b21.81e-04

氯化铷2.44e-05

氯化钠3.92e+00

氟化钠6.16e-06

偏硅酸钠4.59e-03

磷酸氢二钠2.35e-01

丙酮酸钠2.17e-01

精胺3.40e-03

维生素b17.20e-03

维生素b128.64e-03

氯化锌7.74e-04

氯化锆6.53e-06。

在另一个实施方式中，所述的hek293细胞无血清培养基由如下组分组成或包括如下组分：

氯化铝4.61e-06

乙酸钡6.07e-06

生物素9.84e-05

氯化镉3.58e-05

泛酸钙8.64e-03

氯化胆碱1.58e-02

氯化钴4.22e-06

氯化铜3.22e-04

葡萄糖4.80e+00

乙醇胺4.84e-03

硝酸铁6.09e-04

叶酸3.24e-02

谷胱甘肽9.60e-03

4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.04e+00

肌醇7.82e-03

精氨酸5.62e-01

天冬酰胺5.65e-01

天冬氨酸1.24e-01

半胱氨酸7.04e-02

谷氨酸4.84e-01

组氨酸1.66e-01

羟脯胺酸8.06e-03

异亮氨酸3.95e-01

亮氨酸6.84e-01

赖氨酸5.64e-01

蛋氨酸6.05e-02

苯丙氨酸1.59e-02

脯氨酸2.93e-01

丝氨酸2.73e-01

苏氨酸4.24e-01

色氨酸3.03e-01

络氨酸3.49e-01

缬氨酸3.63e-01

氯化镁6.08e-02

氯化锰4.89e-06

烟酰胺7.06e-03

苯丙氨酸1.03e-02

pluronicf688.01e-01

氯化钾4.62e-01

碘化钾3.15e-06

腐胺1.32e-02

硫胺素5.98e-03

维生素b21.29e-04

氯化铷1.52e-05

氯化钠3.92e+00

氟化钠1.11e-05

偏硅酸钠5.91e-03

磷酸氢二钠3.29e-01

丙酮酸钠2.17e-01

精胺4.76e-03

维生素b11.44e-02

维生素b124.80e-03

氯化锌7.74e-04

氯化锆5.45e-06。

在又一个实施方式中，所述的hek293细胞无血清培养基由如下组分组成或包括如下组分：

氯化铝6.71e-06

乙酸钡3.59e-06

生物素1.77e-04

氯化镉4.48e-05

泛酸钙4.80e-03

氯化胆碱1.13e-02

氯化钴4.22e-06

氯化铜3.68e-04

葡萄糖5.40e+00

乙醇胺8.47e-03

硝酸铁3.80e-04

叶酸5.18e-02

谷胱甘肽9.60e-03

4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.04e+00

肌醇1.17e-02

精氨酸7.49e-01

天冬酰胺4.52e-01

天冬氨酸1.55e-01

半胱氨酸3.52e-02

谷氨酸5.45e-01

组氨酸1.66e-01

羟脯胺酸1.21e-02

异亮氨酸5.27e-01

亮氨酸3.04e-01

赖氨酸3.22e-01

蛋氨酸4.84e-02

苯丙氨酸1.36e-02

脯氨酸4.68e-01

丝氨酸4.36e-01

苏氨酸5.45e-01

色氨酸5.45e-01

络氨酸4.49e-01

缬氨酸3.63e-01

氯化镁7.30e-02

氯化锰4.89e-06

烟酰胺5.29e-03

苯丙氨酸6.86e-03

pluronicf686.00e-01

氯化钾2.64e-01

碘化钾2.45e-06

腐胺2.31e-02

硫胺素6.98e-03

维生素b21.55e-04

氯化铷1.83e-05

氯化钠3.92e+00

氟化钠8.62e-06

偏硅酸钠2.63e-03

磷酸氢二钠2.82e-01

丙酮酸钠4.35e-01

精胺2.72e-03

维生素b11.08e-02

维生素b126.72e-03

氯化锌1.35e-03

氯化锆4.36e-06。

应该理解，本领域技术人员根据需要，可以加入任何其他一种或多种合适的组分，而不超出本发明的保护范围。

在另一方面，本发明提供了hek293细胞无血清培养基在制备抗体或重组蛋白中的应用。

优选地，所述抗体选自cd20单抗、pd-1单抗、vegf单抗、tnf-α单抗等。应该理解，本发明不限于上述列举的单抗，任何合适的单抗都在本发明的保护范围之内。

优选地，所述重组蛋白是重组人凝血因子viii等。应该理解，本发明不限于上述列举的重组蛋白，任何合适的重组蛋白都在本发明的保护范围之内。

在又一方面，本发明提供了一种瞬时表达系统，其特征在于：所述瞬时表达系统包含前面任一项所述的hek293细胞无血清培养基。

进一步地，所述瞬时表达系统还包含补料。

本发明具有如下有益效果：

本发明的培养基化学成分确定，无动物源，不含蛋白质或生长因子，支持多种类型的hek293细胞，用于快速增殖和更高密度培养，支持有效的蛋白质表达，将表达提高到g/l水平，支持慢病毒和腺病毒的生产，病毒滴度可达1e7tu/ml，易于放大培养规模，适用于平板、摇瓶、tpp管、wave及其他反应器，具体地：

1、本发明的hek293细胞无血清培养基可明显提高蛋白表达量；

2、本发明的hek293细胞无血清培养基可以在更短的时间获得更多的蛋白；

3、本发明的hek293细胞无血清培养基能更有利于抗体快速生产的产业化应用。

附图说明

图1为本发明的hek293细胞无血清培养基与一种现有培养基(hek293)相比，本发明的hek293细胞无血清培养基体系中三种不同亚型抗体的表达水平提高了约200％。细胞系：expi293f；转染试剂：pei。转染后第6天获取数据。

图2为本发明的hek293细胞无血清培养基用于实现三种重组蛋白或抗体的高水平表达(可达1000mg/l)。与另一种现有培养基(cd293(gibco))相比，使用本发明的hek293细胞无血清培养基可使表达增加50％～100％。细胞系：expi293f；转染试剂：pei。转染后第6天获取数据。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：hek293细胞无血清培养基的配制

按照下述配方，配制hek293细胞无血清培养基，配制方法为本领域常规的配制方法。

实施例2

按照下述配方，配制hek293细胞无血清培养基，配制方法为本领域常规的配制方法。

实施例3

按照下述配方，配制hek293细胞无血清培养基，配制方法为本领域常规的配制方法。

实施例二：本发明的hek293细胞无血清培养基用于体外培养hek293以瞬时表达蛋白

体外培养hek293细胞以瞬时表达蛋白的步骤如下：

s1：取同一批次冻存的expi293细胞(原始expi293细胞从gibco购得，细胞数量2.0×10⁷)在原始培养基hek293或cd293(gibco)里复苏。将细胞在37℃培养箱中(120rpm，8％co2)孵育准备转染并表达目的蛋白(分别为重组人凝血因子viii、cd20单抗、pd-1单抗)。

s2：当细胞活率≥95％且生长处于对数中期时，才开始进行驯化程序(分别使用本发明实例一中实施例1-3的hek293细胞无血清培养，分别用于表达重组人凝血因子viii、cd20单抗、pd-1单抗)。在日常传代中，直接将细胞接种到本发明的hek293细胞无血清培养基中进行培养。

s3：每2到3天进行一次传代操作，以保持细胞处于早期对数生长期。细胞接种密度为0.3～0.6×10⁶细胞/ml。

s4：当细胞密度达到3～4×10⁶细胞/ml且细胞活率≥95％(2～4天)时，再次传代培养细胞。

s5：细胞密度达到约3～4×10⁶个活细胞/ml，活率≥95％时，准备转染质粒。转染前一天，将细胞按3×10⁶细胞/ml细胞密度接种，并使细胞生长过夜。

s6：在第二天(转染当天)，获取包括细胞密度和存活率的数据。进行转染的细胞活率应≥95％。使用新鲜的培养基将细胞稀释至3×10⁶细胞/ml。在接下来的步骤s7到s8，按照dna：1.5mg/l。pei：3mg/l的转染体系准备转染质粒和pei。

s7：用培养基稀释质粒dna。通过旋转和/或翻转试管混匀。

s8：将含有pei的试管轻轻翻转4至5次以充分混匀。并用培养基稀释pei。通过旋转和/或翻转试管来混合。

s9：将稀释后的pei加到稀释后的质粒dna中。旋转和/或颠倒试管或用移液器轻轻吹打2至3次进行混合。将复合物在室温下孵育约20分钟。

s10：将复合物缓慢添加至步骤s6的细胞摇瓶中，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。

s11：将摇瓶放回37℃培养箱中按日常条件培养。在转染第二天(第1天)，在转染后16-22小时向摇瓶中添加5％(v/v)293-profeed(来自奥浦迈)，在添加过程中轻轻晃动摇瓶。将摇瓶放回37℃培养箱。在瞬时表达过程中，维持葡萄糖浓度在4g/l以上。当细胞活率低于60％时收获细胞和表达产物，检测细胞培养液中蛋白浓度。

以上s1-s11各步骤中的参数，例如传代间隔、细胞密度、翻转参数、吹打次数、转染后时间等参数，可以根据实际情况进行调整和选择，这在本领域技术人员能力范围之内。

实验结果：

实施例1～3中，本发明的hek293细胞无血清培养基可用于实现三种抗体的高水平表达。实施例1中收获的蛋白1(重组人凝血因子viii)滴度为1167mg/l，实施例2中收获的单抗1(cd20单抗)滴度为1059mg/l，实施例3中收获的单抗2(pd-1单抗)滴度为402mg/l，均明显高于现有培养基的表达水平。

本发明的hek293细胞无血清培养基与一种现有培养基hek293相比，本发明的hek293细胞无血清培养基体系中三种不同抗体的表达水平提高了约200％。细胞系：expi293f；转染试剂：pei。转染后第6天获取数据(参见图1)。

本发明的hek293细胞无血清培养基用于实现三种重组蛋白或抗体(分别为：重组人凝血因子viii、cd20单抗、pd-1单抗)的高水平表达(可达1000mg/l)。与另一种现有培养基cd293(gibco)相比，使用本发明的hek293细胞无血清培养基可使表达增加50％～100％。细胞系：expi293f；转染试剂：pei。转染后第6天获取数据(参见图2)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述试验例的限制，上述试验例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。