一种脐带间充质干细胞联合骨支架材料成骨分化的方法与流程

本发明属于细胞学、免疫学领域，涉及脐带间充质干细胞技术，尤其是一种脐带间充质干细胞联合骨支架材料成骨分化的方法。
背景技术：
：脐带间充质干细胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells,uc-mscs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。同时uc-mscs因不表达或低表达与组织相容相关的免疫分子，它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出mscs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓mscs，免疫原性比骨髓干细胞低，并且具有取材方便，无伦理学争议，细胞分离操作简单，体外培养扩增效率更高，可以从同一来源短期内获得足够数量的、高质量、高纯度的可用于临床研究和治疗的干细胞。因此越来越受到研究工作者们的关注。脐带间充质干细胞体内成骨诱导不同于体外成骨诱导，单一的脐带间充质干细胞移植到裸鼠体内，细胞会在3-5天内在裸鼠体内消失，目前使用脐带间充质干细胞联合骨支架材料在体内成骨诱导的研究方法并不多，这是
技术领域：
内的一项空白，所以脐带间充质干细胞联合骨支架材料成骨分化是一项有意义的技术研究。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种采用脐带间充质干细胞联合羟基磷灰石骨支架材料，先在体外培养诱导，然后移植到裸鼠皮下，细胞不仅不会消失，还会继续在裸鼠体内增殖，并且加快了成骨诱导时间的脐带间充质干细胞联合骨支架材料成骨分化的方法。本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：一种脐带间充质干细胞联合骨支架材料成骨分化的方法，包括以下方法步骤：步骤一：制备高纯度uc-mscs-luc细胞⑴采集足月剖宫产胎儿脐带，采集后在生物安全柜对其进行分离，将脐带剪成3-5cm的小段，用生理盐水洗净脐带残血；⑵用镊子剥离脐带的两条动脉和一条静脉，用皮镊分离出沃顿胶；⑶使用剪刀将沃顿胶剪成3-5mm3的小块，均匀铺到培养瓶中，倒放在37℃二氧化碳培养箱，2-4小时后补充10％fbs的df-12培养基培养；⑷5天左右换液，待沃顿胶爬出细胞，生长融合至80％左右进行传代。步骤二：体外试验⑴将步骤一培养的高纯度uc-mscs-luc细胞扩增培养至p2代，按照5000cells/cm2的密度接种到6孔板中，共接种5个孔板，接种第二天按照组别更换培养液；本发明分为3个组：对照组、经典诱导组和经典诱导+bmp-2组(简称bmp-2组)；对照组培养液是10％fbs的h-dmem培养基；经典诱导组培养液：对照组培养基基础上再加入1％β-磷酸甘油，0.1％vc，0.01％地塞米松；bmp-2组培养液：经典诱导液培养基基础上再加入1％的10μg/ml的bmp-2因子。6孔板布局如下：对照组经典诱导组bmp-2组对照组经典诱导组bmp-2组⑵对诱导7-10d的细胞进行碱性磷酸酶(alp)定量检测，对诱导21-22d的细胞进行茜素红染色，验证成骨分化情况。步骤三：体内试验⑴对p1代的脐带间充质干细胞进行慢病毒侵染，使其带有rfp+luciferse红色荧光标记，由于脐带间充质干细胞不同于肿瘤细胞等细胞系，需要较温和的培养条件，不能使用嘌呤霉素等药物进行筛选，本发明采用moi＝65对脐带间充质干细胞进行转染，能够达到最佳转染效率，无需筛选，且能维持最佳细胞状态；⑵继续培养扩增到p3代，制备密度为2.5×107/ml细胞制剂，在24孔板中接种到大小相当的羟基磷灰石骨支架材料上，每个支架材料接种20μl，约5×105cells；⑶10％fbs的df-12培养基培养3d后进行成骨诱导，组别和培养基同体外实验，成骨诱导后4d移植到裸鼠皮下；⑷每周进行活体成像监测脐带间充质干细胞在裸鼠体内的增值情况，培养6周后对裸鼠进行取材，对支架材料进行masson、he和免疫组化(opn和col-ⅰ)染色。本方法中uc-mscs表面呈现cd14、cd90、cd105高表达，cd19、cd34、cd45不表达或低表达。制剂后通过流式细胞仪对uc-mscs进行检测。碱性磷酸酶(alp)是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物,茜素红染色是对成骨形成的钙结节进行染色，因此，本发明通过测定alp含量和茜素红染色鉴定体外成骨分化效果。体内成骨诱导的细胞表面ⅰ型胶原(col-ⅰ)和骨桥蛋白(opn)会明显升高，因此本发明在体内试验免疫组化染色中选择了col-ⅰ和opn两种抗体鉴定体内成骨分化效果。本发明的优点和积极效果是：1、本发明的目的在于探究：①制备高纯度uc-mscs-luc细胞的方法。②uc-mscs在体外骨支架材料在体内成骨分化方法。本发明制备高纯度uc-mscs-luc细胞的方法中uc-mscs表面呈现cd14、cd90、cd105高表达，cd19、cd34、cd45不表达或低表达。制剂后通过流式细胞仪对uc-mscs进行检测效果较好。本发明的体内试验中对p1代的脐带间充质干细胞进行慢病毒侵染，使其带有rfp+luciferse红色荧光标记，由于脐带间充质干细胞不同于肿瘤细胞等细胞系，需要较温和的培养条件，不能使用嘌呤霉素等药物进行筛选。本发明采用moi＝65对脐带间充质干细胞进行转染，能够达到最佳转染效率，无需筛选，且能维持最佳细胞状态。2、碱性磷酸酶(alp)是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物,茜素红染色是对成骨形成的钙结节进行染色，因此，本发明通过测定alp含量和茜素红染色鉴定体外成骨分化效果。3、本发明方法采用体内和体外试验同时进行，体内成骨诱导的细胞表面ⅰ型胶原(col-ⅰ)和骨桥蛋白(opn)会明显升高，因此本发明在体内试验免疫组化染色中选择了col-ⅰ和opn两种抗体鉴定体内成骨分化效果，能够有力说明成骨诱导的条件。4、bmp-2有助于脐带间充质干细胞成骨分化，本发明中bmp-2组中的成骨分化效果均优于经典诱导组，脐带间充质干细胞联合骨支架材料能够让细胞在裸鼠体内成骨分化，且分化效果较好，体外试验成骨诱导7-9d的脐带间充质干细胞bmp-2组均优于经典诱导组，其中y诱导7d的alp含量最高；成骨诱导22d经典诱导组和bmp-2组钙结节高表达，但是bmp-2组明显优于经典诱导组。5、本发明采用体内体外同时对脐带间充质干细胞进行成骨诱导，并进行成骨分化的验证，能够更直观对比观察脐带间充质干细胞联合骨支架材料在裸鼠体内成骨分化时间和效果。本发明步骤简单，效果突出，脐带间充质干细胞能够在骨支架材料上增值并移植到裸鼠体内，能够消除免疫排斥反应继续增值，且通过病理染色试验得出成骨分化效果较好，在脐带间充质干细胞成骨分化等临床前研究具有重要意义。附图说明图1为本发明的脐带间充质干细胞rfp表达图(4×)；图2为脐带间充质干细胞在骨支架材料上的luciferse表达图；图3为体外成骨诱导7-9d碱性磷酸酶含量的结果对比图；图4为成骨诱导22d体外试验钙结节染色表达图；图5为脐带间充质干细胞联合骨支架材料在裸鼠体内增值情况结果图；图6为脐带间充质干细胞联合骨支架材料在裸鼠体内成骨后he染色切片图；图7为脐带间充质干细胞联合骨支架材料在裸鼠体内成骨后masson染色切片图；图8为脐带间充质干细胞联合骨支架材料在裸鼠体内成骨后免疫组化col-ⅰ染色切片图；图9为脐带间充质干细胞联合骨支架材料在裸鼠体内成骨后免疫组化opn染色切片图。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。一种脐带间充质干细胞联合骨支架材料成骨分化的方法，包括以下方法步骤：步骤一：制备高纯度uc-mscs-luc细胞⑴采集足月剖宫产胎儿脐带，采集后在生物安全柜对其进行分离，将脐带剪成3-5cm的小段，用生理盐水洗净脐带残血；⑵用镊子剥离脐带的两条动脉和一条静脉，用皮镊分离出沃顿胶；⑶使用剪刀将沃顿胶剪成3-5mm3的小块，均匀铺到培养瓶中，倒放在37℃二氧化碳培养箱，2-4小时后补充10％fbs的df-12培养基培养；⑷5天左右换液，待沃顿胶爬出细胞，生长融合至80％左右进行传代。步骤二：体外试验⑴将步骤一培养的高纯度uc-mscs-luc细胞扩增培养至p2代，按照5000cells/cm2的密度接种到6孔板中，共接种5个孔板，接种第二天按照组别更换培养液；本发明分为3个组：对照组、经典诱导组和经典诱导+bmp-2组(简称bmp-2组)；对照组培养液是10％fbs的h-dmem培养基；经典诱导组培养液：对照组培养基基础上再加入1％β-磷酸甘油，0.1％vc，0.01％地塞米松；bmp-2组培养液：经典诱导液培养基基础上再加入1％的10μg/ml的bmp-2因子。6孔板布局如下：对照组经典诱导组bmp-2组对照组经典诱导组bmp-2组⑵对诱导7-10d的细胞进行碱性磷酸酶(alp)定量检测，对诱导21-22d的细胞进行茜素红染色，验证成骨分化情况。步骤三：体内试验⑴对p1代的脐带间充质干细胞进行慢病毒侵染，使其带有rfp+luciferse红色荧光标记，由于脐带间充质干细胞不同于肿瘤细胞等细胞系，需要较温和的培养条件，不能使用嘌呤霉素等药物进行筛选，本发明采用moi＝65对脐带间充质干细胞进行转染，能够达到最佳转染效率，无需筛选，且能维持最佳细胞状态，脐带间充质干细胞rfp表达图(4×)如图1所示；⑵继续培养扩增到p3代，制备密度为2.5×107/ml细胞制剂，在24孔板中接种到大小相当的羟基磷灰石骨支架材料上，每个支架材料接种20μl，约5×105cells，脐带间充质干细胞在骨支架材料上的luciferse表达图如图2所示；⑶10％fbs的df-12培养基培养3d后进行成骨诱导，组别和培养基同体外实验，成骨诱导后4d移植到裸鼠皮下；⑷每周进行活体成像监测脐带间充质干细胞在裸鼠体内的增值情况，培养6周后对裸鼠进行取材，对支架材料进行masson、he和免疫组化(opn和col-ⅰ)染色。本方法中uc-mscs表面呈现cd14、cd90、cd105高表达，cd19、cd34、cd45不表达或低表达。制剂后通过流式细胞仪对uc-mscs进行检测。碱性磷酸酶(alp)是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物,茜素红染色是对成骨形成的钙结节进行染色，因此，本发明通过测定alp含量和茜素红染色鉴定体外成骨分化效果，体外成骨诱导7-9d碱性磷酸酶含量的结果对比图如图3所示，图4为成骨诱导22d体外试验钙结节染色表达图。图5为脐带间充质干细胞联合骨支架材料在裸鼠体内增值情况结果图，实验结果直观。图6为脐带间充质干细胞联合骨支架材料在裸鼠体内成骨后he染色切片图。图7为脐带间充质干细胞联合骨支架材料在裸鼠体内成骨后masson染色切片图。体内成骨诱导的细胞表面ⅰ型胶原(col-ⅰ)和骨桥蛋白(opn)会明显升高，因此本发明在体内试验免疫组化染色中选择了col-ⅰ和opn两种抗体鉴定体内成骨分化效果。脐带间充质干细胞联合骨支架材料在裸鼠体内成骨后免疫组化col-ⅰ染色切片图如图8，脐带间充质干细胞联合骨支架材料在裸鼠体内成骨后免疫组化opn染色切片图如图9。本发明的目的在于探究：①制备高纯度uc-mscs-luc细胞的方法。②uc-mscs在体外骨支架材料在体内成骨分化方法。本发明制备高纯度uc-mscs-luc细胞的方法中uc-mscs表面呈现cd14、cd90、cd105高表达，cd19、cd34、cd45不表达或低表达。制剂后通过流式细胞仪对uc-mscs进行检测效果较好。本发明的体内试验中对p1代的脐带间充质干细胞进行慢病毒侵染，使其带有rfp+luciferse红色荧光标记，由于脐带间充质干细胞不同于肿瘤细胞等细胞系，需要较温和的培养条件，不能使用嘌呤霉素等药物进行筛选。本发明采用moi＝65对脐带间充质干细胞进行转染，能够达到最佳转染效率，无需筛选，且能维持最佳细胞状态。碱性磷酸酶(alp)是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物,茜素红染色是对成骨形成的钙结节进行染色，因此，本发明通过测定alp含量和茜素红染色鉴定体外成骨分化效果。本发明方法采用体内和体外试验同时进行，体内成骨诱导的细胞表面ⅰ型胶原(col-ⅰ)和骨桥蛋白(opn)会明显升高，因此本发明在体内试验免疫组化染色中选择了col-ⅰ和opn两种抗体鉴定体内成骨分化效果，能够有力说明成骨诱导的条件。bmp-2有助于脐带间充质干细胞成骨分化，本发明中bmp-2组中的成骨分化效果均优于经典诱导组，脐带间充质干细胞联合骨支架材料能够让细胞在裸鼠体内成骨分化，且分化效果较好，体外试验成骨诱导7-9d的脐带间充质干细胞bmp-2组均优于经典诱导组，其中y诱导7d的alp含量最高；成骨诱导22d经典诱导组和bmp-2组钙结节高表达，但是bmp-2组明显优于经典诱导组。本发明采用体内体外同时对脐带间充质干细胞进行成骨诱导，并进行成骨分化的验证，能够更直观对比观察脐带间充质干细胞联合骨支架材料在裸鼠体内成骨分化时间和效果。本发明步骤简单，效果突出，脐带间充质干细胞能够在骨支架材料上增值并移植到裸鼠体内，能够消除免疫排斥反应继续增值，且通过病理染色试验得出成骨分化效果较好，在脐带间充质干细胞成骨分化等临床前研究具有重要意义。尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。当前第1页12