Semaphorin7A单克隆抗体及其在制备用于治疗炎症疾病药物方面的应用的制作方法
本发明属于免疫学与心血管疾病药物制备领域，尤其涉及semaphorin7a单克隆抗体及其在制备用于治疗炎症疾病药物方面的应用。
背景技术：
亲和素semaphorins是轴突导向分子蛋白家族，是一类分泌或跨膜蛋白家族。semaphorin蛋白家族的分类是以蛋白结构域进行分类的，semaphorins结构包含一个n端细胞外基质结构域(sema结构域)，这个结构域含有约500个氨基酸，其中丰富含半胱氨酸的残基。中间结构域为plexin-semaphorin(psi)整合素结构域，c端为一个可变蛋白结构域。c末端基序的变异是semaphorin家族分类的关键因素。semaphorins蛋白家族一共有8个亚类。1类和2类是在存在无脊椎动物中，而3类到7类是在存在于脊椎动物，第8类分子是由病毒编码的。其中1，4～7类主要是跨膜蛋白，而2，3，8主要为分泌型蛋白。semaphorins最初是以作为轴突导向分子被发现的，可以介导细胞与细胞之间的相互作用或趋化作用，但现在其作用已经远不止在神经轴突生长过程中，semaphorins被发现参与诸多生理病理过程，例如，器官生长成熟，免疫细胞的调控以及血管的形成。
semaphorin7a(sema7a，氨基酸序列如seqidno.1所示)基因位于人15号染色体上，最早是在红细胞中发现的，并初次被命名为cdw108。yamada等人第一次克隆出人的cdw108cdna序列，他共编码了666个氨基酸。鼠源的对应蛋白由664个氨基酸组成并且与人的sema7a具有90％的同源性。直到1998年，cdw108才被证实属于semaphorin家族，并命名为semak-1。1999年，该蛋白被重新命名为sema7a，因为其gpi锚定的特异性，将他定位在一个新的semaphorin家族亚类中，是唯一一种糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白。源和鼠源的sema7a都含有一个7桨β螺旋semaphorinn末端结构域，一个psi结构域，一个免疫球状样结构域以及一个gpi锚定的c末端。sema7a通常是通过sema结构域与免疫球状样结构中间连接形成二聚体。sema7a可以与病毒编码semaphorin蛋白受体(vespr)结合，即plexinc1。也可以与整合素α1β1结合。
目前对于sema7a的研究主要集中在诱导神经轴突生长以及调控炎症免疫反应等方面。有报道表明sema7a参与了肠道黏膜免疫系统的维持，kang等在研究肠道黏膜免疫稳态时发现，肠道上皮细胞产生的sema7a可诱导巨噬细胞产生il-10，从而减轻肠道炎症反应，而这种效果可被il-10的中和抗体所阻断。此外，sema7a在皮肤炎症、病毒感染以及多种自身免疫性疾病中也扮演着重要角色。kamata等在研究皮肤炎症中，角质上皮细胞与单核细胞相互作用时发现，sema7a与α1β1整合素相互作用并激活单核细胞，诱导单核细胞产生il-8等炎症因子，加重皮肤炎症。sultana等在研究西尼罗病毒(wnv)时发现，wnv感染会导致血液及组织中sema7a表达增加，sema7a缺陷小鼠感染wnv后的炎症反应明显减轻，而在sema7a缺陷或腹腔注射sema7a抗体的小鼠中，wnv感染的致死率也明显降低。sema7a可促进多发性硬化等自身免疫性疾病的进展，活化t细胞上的sema7a和巨噬细胞上的其受体α1β1整合素结合，发挥促炎作用。另外也有研究证实，肠上皮细胞上的sema7a与巨噬细胞上其受体αvβ1整合素结合，分泌il-10调节肠道炎症反应。
目前，无论是sema7a的单克隆抗体，还是sema7a抗体在基因工程中和性抗体的研发，均处于实验室研究阶段，没有一种sema7a单克隆抗体中和抗体作为临床药物上市销售。
技术实现要素：
为了治疗巨噬细胞相关炎性疾病，本发明实施例提供了一种semaphorin7a单克隆抗体及其在制备用于治疗炎症疾病药物方面的应用，该semaphorin7a单克隆抗体在制备用于治疗炎症疾病药物方面的应用推广具有重要意义。
一方面，本发明实施例公开了一种semaphorin7a单克隆抗体，所述semaphorin7a单克隆抗体包括重链氨基酸可变区及轻链氨基酸可变区，其中：所述semaphorin7a单克隆抗体的6个cdr氨基酸序列如下：
vhcdr1的氨基酸序列是seqidno.2，
vhcdr2的氨基酸序列是seqidno.3，
vhcdr3的氨基酸序列是seqidno.4，
vlcdr1的氨基酸序列是seqidno.6，
vlcdr2的氨基酸序列是seqidno.7，
vlcdr3的氨基酸序列是seqidno.8；或
vhcdr1的氨基酸序列是seqidno.10，
vhcdr2的氨基酸序列是seqidno.11，
vhcdr3的氨基酸序列是seqidno.12，
vlcdr1的氨基酸序列是seqidno.14，
vlcdr2的氨基酸序列是seqidno.15，
vlcdr3的氨基酸序列是seqidno.16；
在一些实施例中，所述semaphorin7a单克隆抗体中6个cdr氨基酸的同源性至少为90％。
在一些实施例中，所述semaphorin7a单克隆抗体的氨基酸序列包括：
由seqidno.5所示氨基酸序列构成的重链及由seqidno.9所示氨基酸序列构成的轻链；或；
由seqidno.13所示氨基酸序列构成的重链及由seqidno.17所示氨基酸序列构成的轻链。
另一方面，本发明实施例还公开了一种所述semaphorin7a单克隆抗体在制备用于治疗炎症疾病药物方面的应用，所述炎症疾病至少包括病毒性心肌炎症、金黄色葡萄球菌(s.aureus)诱导的脓毒血炎症及肠道病毒ev71急性感染。
在一些实施例中，验证所述药物在治疗所述病毒性心肌炎症中的应用时，选取的组织至少包括血清、心脏组织。
在一些实施例中，验证所述药物在治疗所述金黄色葡萄球菌(s.aureus)诱导的脓毒血炎症中的应用时，选取的组织至少包括血清、肺部组织、肾脏组织。
在一些实施例中，验证所述药物在治疗所述肠道病毒ev71急性感染中的应用时，选取的组织至少包括：骨骼肌组织、小肠组织、脑干组织。
在一些实施例中，所述用于治疗炎症疾病的药物还包括药物辅料和药用基质。
在一些实施例中，所述用于治疗炎症疾病的药物为液体制剂或冻干制剂。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
1、本发明利用截短表达及合成肽段等技术，对semaphorin7a单克隆抗体2567-1、2567-3所识别的抗原表位进行淘选获得了其一致的表位序列，序列比对结果表明，该semaphorin7a单抗所识别的多肽序列落在semaphorin7aβ螺旋区域。进一步，申请人利用抗体基因测序技术分析了2567-1、2567-3单克隆抗体和sema7a发生特异性结合的轻链、重链序列。
2、本实施例分别给予了病毒性心肌炎症、金黄色葡萄球菌(s.aureus)诱导的脓毒血炎症及肠道病毒ev71急性感染以semaphorin7a单克隆抗体的治疗，能够有效缓解上述炎症感染和提高小鼠生存率，在上述炎症感染治疗中具有明显的疗效；
3、本实施例公开了semaphorin7a单克隆抗体在制备用于治疗病毒性心肌炎症、金黄色葡萄球菌(s.aureus)诱导的脓毒血炎症及肠道病毒ev71急性感染等炎症疾病的药物方面的应用；在治疗上述炎症疾病的药物的研发及生产中，semaphorin7a单克隆抗体的用途发明具有重要意义；
4、本发明实施例建立了健康balb/c雄性小鼠模型，作为一种广泛接受并应用的炎症疾病动物模型，该模型适合临床应用研究，对于病毒性心肌炎症、金黄色葡萄球菌(s.aureus)诱导的脓毒血炎症及肠道病毒ev71急性感染等炎症疾病的药物研发具有重要的应用推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是sema7a_truncated蛋白大肠杆菌表达图；
图2是sema7a单克隆抗体wb验证图；
图3是sema7a抗体elisa验证和gst-1，gst-2，gst-3亲和力图；
图4是sema7a抗体elisa验证和肽段p1，p2，p3，p4，p5亲和力图；
图5是sema7a抗体elisa验证和肽段2，3，4，5亲和力图；
图6是cvb3感染小鼠给予sema7a抗体治疗后血清血肌钙变化图；
图7是cvb3感染小鼠通过sema7a抗体治疗后心脏组织切片免疫组化染色图；
图8是sema7a抗体治疗后小鼠心脏组织炎性因子检测图；
图9是sema7a抗体治疗后cvb3感染病毒性心肌炎小鼠的生存率图；
图10是sema7a抗体治疗金黄色葡萄球菌感染小鼠血清炎性因子检测图；
图11是sema7a抗体治疗金黄色葡萄球菌感染小鼠肺部损伤检测图；
图12是sema7a抗体治疗金黄色葡萄球菌感染小鼠肾脏切片免疫组化染色图；
图13是sema7a抗体治疗金黄色葡萄球菌感染小鼠的生存率图；
图14是sema7a抗体治疗ev71感染小鼠骨骼肌切片免疫组化染色图；
图15是sema7a抗体治疗ev71感染小鼠小肠切片免疫组化染色图；
图16是sema7a抗体治疗ev71感染小鼠脑干切片免疫组化染色图；
图17是sema7a抗体治疗ev71感染小鼠炎性因子检测图；
图18是sema7a抗体治疗ev71感染小鼠的生存率图；
图19是sema7a抗体和抗病毒药物阿昔洛韦联合治疗ev71感染小鼠的生存率图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供两种semaphorin7a单克隆抗体：2567-1、2567-3，这两种semaphorin7a单克隆抗体均包括重链可变区及轻链可变区。
其中，semaphorin7a单克隆抗体2567-1的重链可变区包括如下3个cdr氨基酸序列及一个核苷酸序列：氨基酸序列为seqidno.2的vhcdr1，氨基酸序列为seqidno.3的vhcdr2，氨基酸序列为seqidno.4的vhcdr3，核苷酸序列为seqidno.5的核苷酸。semaphorin7a单克隆抗体2567-1的轻链可变区包括如下3个cdr氨基酸序列及一个核苷酸序列：氨基酸序列为seqidno.6的vlcdr1，氨基酸序列为seqidno.7的vlcdr2，氨基酸序列为seqidno.8的vlcdr3，核苷酸序列为seqidno.9的核苷酸。
同样的，semaphorin7a单克隆抗体2567-3的重链可变区包括如下3个cdr氨基酸序列及一个核苷酸序列：氨基酸序列为seqidno.10的vhcdr1，氨基酸序列为seqidno.11的vhcdr2，氨基酸序列为seqidno.12的vhcdr3，核苷酸序列为seqidno.13的核苷酸。semaphorin7a单克隆抗体2567-3的轻链可变区包括如下3个cdr氨基酸序列及一个核苷酸序列：氨基酸序列为seqidno.14的vlcdr1，氨基酸序列为seqidno.15的vlcdr2，氨基酸序列为seqidno.16的vlcdr3，核苷酸序列为seqidno.17的核苷酸。
本实施例还提供了一种semaphorin7a单克隆抗体的制备方法，该制备方法具体包括如下步骤：
(1)首先，通过lasergene软件包中protean程序，对小鼠sema7a基因序列的抗原性进行分析，得到抗原性较好的蛋白序列sema7a_truncated(seqidno.18)。
(2)如图1所示，把sema7a_truncated序列克隆到pet28a原核表达载体，在大肠杆菌中通过iptg诱导表达，表达了sema7a_truncated的抗原蛋白。
(3)sema7a_truncated的抗原蛋白通过皮下免疫小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞与sp20细胞融合，获得3株sema7a特异性小鼠单克隆抗体。如表1的elisa效价表所示，为了验证制备的抗体的中和效价，用1微克的抗原包被板子，对制备的抗体进行不同浓度稀释，发现这3株的抗体在1∶80000的稀释比例下，还是很好的能够与抗原sema7a_truncated结合。
表1semaphorin7a单克隆抗体2567-1、2567-2、2567-3的elisa效价表
*判断标准：s/n＞2.1(s：抗体检测od值，n：空白对照检测od值)
结论：所得抗体效价均符合标准，elisa检测结果合格。
(4)如图2所示，我们也通过westernblot方式，验证了获得的3株抗体的特异性，取小鼠肺部组织跑sds-page凝胶，我们的抗体1∶1000或者1∶5000都能够检测到sema7a蛋白的表达，阳性对照为商品化的抗体，通过以上实验我们表明了成功制备了3株小鼠sema7a特异性的单克隆抗体。
进一步，本实施例还提供了semaphorin7a单克隆抗体抗原表位的鉴定和抗体序列的分析，具体包括如下步骤：
(1)为了对semaphorin7a单克隆抗体的抗原表位进行分析，把sema7a_truncated蛋白更进一步分为3段：gst-1，gst-2，gst-3(氨基酸序列分别如seqidno.19-seqidno.21所示)。通过和原核表达载体gst做融合表达，把表达纯化的gst-1，gst-2，gst-3蛋白包被板子，然后用抗体做酶联免疫吸附反应，结果表明用sema7a_truncated的蛋白(sema7a-his)能够很好的和2567-1，2567-3号抗体发生结合。如图3a和3b所示，进一步分析可知，sema7a_truncated的蛋白中gst-3蛋白序列都能分别和2567-1，2567-3发生结合。
(2)在gst-3氨基酸序列基础上，进一步将其划分为5个肽段：p1，p2，p3，p4和p5，其中p1至p5的氨基酸序列分别如seqidno.22～26所示，把合成的5个肽段包被板子，同样用抗体做酶联免疫吸附反应，检测2567-1和2567-3抗体与其的亲和性。如图4所示的结果发现：p2肽段序列与gst-3阳性对照一样，与2567-1和2567-3抗体有着很高的亲和性。
(3)如图5所示，为了更加精确地分析p2肽段和单克隆抗体结合的序列，进一步把p2从n端或者c端做了递减，划分为4个肽段2～5，氨基酸序列分别如seqidno.27-seqidno.30所示。进行生化合成后，把合成的肽段包被板子，同样用抗体做酶联免疫吸附反应，检测2567-1和2567-3抗体与其的亲和性，结果发现p2肽段的n端氨基酸序列对于抗体的结合，起了很重要的作用。如图5a所示，如果把c端做了4个氨基酸的缺失，那么2号肽段和p2肽段对于2567-1和2567-3抗体亲和力改变不大，而如图5b所示，如果把p2肽段从n端做4个氨基酸缺失，那么与2567-1和2567-3抗体的亲和力大大减弱。因此，上述试验证明，2号肽段：fspdenslvlfegdev是我们制备的2567-1和2567-3sema7a单克隆抗体的抗原决定表位。
(4)为了分析2567-1和2567-3单克隆抗体与抗原结合的序列，对于本实施例提供的2567-1和2567-3单克隆抗体的可变区进行了基因克隆和序列测定。
进一步：semaphorin7a单克隆抗体的氨基酸序列包括：
由seqidno.31所示氨基酸序列构成的重链及由seqidno.32所示氨基酸序列构成的轻链(2567-1)；或；
由seqidno.33所示氨基酸序列构成的重链及由seqidno.34所示氨基酸序列构成的轻链(2567-3)。
本实施例利用截短表达及合成肽段等技术，对semaphorin7a单克隆抗体2567-1、2567-3所识别的抗原表位进行淘选获得了其一致的表位序列。序列比对结果表明，该semaphorin7a单抗所识别的多肽序列落在semaphorin7aβ螺旋区域。进一步，申请人利用抗体基因测序技术分析了2567-1、2567-3单克隆抗体和sema7a发生特异性结合的轻链、重链序列。
实施例2
本实施例提供了一种semaphorin7a单克隆抗体(2567-1，2567-3)在治疗cvb3诱导的病毒性心肌炎症中的应用。
首先构建cvb3诱导的病毒性心肌炎模型；所述模型的构建步骤具体包括：
(1)取6-8周龄的雄性balb/c小鼠，分4组，每组6只，以腹腔注射的方式给每只老鼠103tcid50剂量的cvb3病毒，诱导小鼠病毒性心肌炎症模型。
(2)在病毒感染的第一天，第三天和第五天分别以腹腔注射的方式给予小鼠sema7a2567-1或者2567-3抗体50ug/只，cvb3组为病毒感染非治疗对照组，control为健康小鼠组。
如图6所示，在感染的第7天，观测小鼠心肌炎指标和对照组相比，给予小鼠sema7a抗体2567-1治疗之后，血清血肌钙指标ctni含量为2.77ng/ml，给予小鼠sema7a抗体2567-3治疗之后，血清血肌钙指标ctni含量为4.24ng/ml，而cvb3对照组的ctni含量为10.83ng/ml，健康小鼠血清中control组ctni含量为0.54ng/ml。
在感染后第7天取感染小鼠心脏组织，用苏木素(hematoxylin)-伊红(eosin)染色浸润的炎性细胞。如图7所示，小鼠心脏病理切片同样表明，sema7a2567-1，2567-3抗体治疗组小鼠心脏在第7天见少许炎症，而对照组cvb3小鼠心脏炎症加重，有大量淋巴细胞浸润，心脏呈弥漫性坏死，如图中箭头所指，心肌病理切片染色和血清ctni结果一致。
进一步，对感染小鼠第七天的心脏组织研磨，检测心脏组织中分泌的与炎症相关的细胞因子，检测结果如图8所示，结果表明：炎症细胞因子il-6、il-1β和tnf-a在2567-1，2567-3抗体治疗组小鼠与cvb3组比较，有了明显的下降，而mcp-1炎性因子在2567-1，2567-3抗体治疗组小鼠和cvb3组比较，没有明显的变化。
进一步参照图9，观察各组小鼠每天的生存情况，sema7a2567-1抗体组能有效提高小鼠的生存率达到83.3％(5，n＝6)，sema7a2567-3抗体组能有效提高小鼠的生存率达到67.7％(4，n＝6)，而对照组小鼠的生存率只有50％(3，n＝6)。
本实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
1、本实施例给予cvb3诱导的病毒性心肌炎症以semaphorin7a单克隆抗体的治疗，能够有效缓解心肌细胞炎症和提高小鼠生存率，在治疗心肌炎疾病具有明显的疗效；
2、本实施例公开了semaphorin7a单克隆抗体在制备用于治疗cvb3诱导的病毒性心肌炎症药物方面的应用；在治疗心肌炎症药物的研发及生产中，semaphorin7a单克隆抗体的用途发明具有重要意义；
3、本发明实施例建立了健康balb/c雄性小鼠模型，作为一种广泛接受并应用的心肌炎动物模型，该模型适合临床应用研究，对于心肌炎的药物研发具有重要的应用推广价值。
实施例3
本实施例提供了一种semaphorin7a单克隆抗体(2567-1，2567-3)在治疗金黄色葡萄球菌(s.aureus)诱导的脓毒血炎症中的应用。
同样构建金黄色葡萄球菌(s.aureus)诱导的脓毒血炎症模型；所述模型的构建步骤具体包括：
(1)取6-8周龄的雄性c57bl/6小鼠，分4组，每组6只，以腹腔注射的方式给每只老鼠107cfu0剂量的金黄色葡萄球菌，诱导脓毒血小鼠炎症模型。
(2)在细菌感染的第一天，第三天和第五天分别以腹腔注射的方式给予小鼠sema7a2567-1或者2567-3抗体50ug/只，s.aureus组为细菌感染非治疗对照组，control为健康小鼠组。
对感染小鼠第6天的血清中炎性细胞因子进行检测，检测结果如图10所示。结果表明：炎症细胞因子il-6、mcp-1和tnf-ot在2567-1，2567-3抗体治疗组小鼠与s.aureus组比较，有了明显的下降，而il-10炎性因子在2567-1，2567-3抗体治疗组小鼠和cvb3组比较，没有明显的变化。
如图11所示，我们对小鼠肺部器官进行了检测。肺组织的湿/干重比是肺组织损伤的一个指标，我们在感染第6天检测了各组小鼠的肺组织的湿/干重比，检测结果如图11a所示，2567-1，2567-3抗体治疗组小鼠与s.aureus组比较，肺组织的湿/干重比有了明显的下降，同样的，如图11b所示，血液中细菌的载量通过2567-1，2567-3抗体治疗之后，也有了明显下降。同样的，如图11c所示，同时检测肺部灌洗液中蛋白含量，通过2567-1，2567-3抗体治疗之后，也有了明显下降。以上结果表明sema7a抗体2567-1，2567-3治疗能够改善金黄色葡萄球菌感染的肺部损伤。
同时，我们也对小鼠肾脏器官进行了检测。通过he肾脏切片，检测结果如图12所示：s.aureus组肾脏切片中肾小球结构有了破坏，呈现为不规则形状或者扁平状，有的肾小球结构中间囊腔间隙变小或者消失(如图中箭头所指)。
参照图13所示，观察各组小鼠每天的生存情况，sema7a2567-1抗体组能有效提高小鼠的生存率达到83.3％(5，n＝6)，sema7a2567-3抗体组能有效提高小鼠的生存率达到67.7％(4，n＝6)，而对照组小鼠的生存率只有33.3％(2，n＝6)。
本实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
1、本实施例给予了金黄色葡萄球菌(s.aureus)诱导的脓毒血炎症以semaphorin7a单克隆抗体的治疗，能够有效缓解脓毒血炎症和提高小鼠生存率，在金黄色葡萄球菌(s.aureus)诱导的脓毒血炎症治疗中具有明显的疗效；
2、本实施例公开了semaphorin7a单克隆抗体在制备用于治疗金黄色葡萄球菌(s.aureus)诱导的脓毒血炎症药物方面的应用；在金黄色葡萄球菌(s.aureus)诱导的脓毒血炎症药物的研发及生产中，semaphorin7a单克隆抗体的用途发明具有重要意义；
3、本发明实施例建立了健康balb/c雄性小鼠模型，作为一种广泛接受并应用的金黄色葡萄球菌(s.aureus)诱导的脓毒血炎症动物模型，该模型适合临床应用研究，对于金黄色葡萄球菌(s.aureus)诱导的脓毒血炎症的药物研发具有重要的应用推广价值。
实施例4
本实施例提供了一种semaphorin7a单克隆抗体(2567-1，2567-3)在治疗肠道病毒ev71急性感染中的应用。ev7病毒对中枢神经系统有极高的感染性，在临床上出现之症状包括脑炎(encephalitis)、无菌性脑膜炎(asepticmeningitis)、急性无力肢体麻痹(acuteflaccidparalysis)、手足口症(hand-foot-mouthdisease)、泡疹性咽峡炎(herpangina)、急性出血性结膜炎(acutehemorrhagicconjuctivitis)等，尤其对婴幼儿危害巨大。
本实施例中，同样构建肠道病毒ev71急性感染模型；所述模型的构建步骤具体包括：
(1)首先建立了ev71感染乳鼠的动物模型，取3-5天的雄性balb/c小鼠，分4组，每组6只，直接给小鼠腹腔注射107pfuev71病毒。
(2)在病毒感染的第一天，第三天和第五天分别以腹腔注射的方式给予小鼠sema7a2567-1或者2567-3抗体50ug/只，cvb3组为病毒感染非治疗对照组，control为健康小鼠组。
在病毒感染的第一天，第三天和第五天分别以腹腔注射的方式给予小鼠sema7a2567-1或者2567-3抗体50ug/只，cvb3组为病毒感染非治疗对照组，control为健康小鼠组。
在感染后第5天取感染小鼠骨骼肌组织，用苏木素(hematoxylin)-伊红(eosin)染色浸润的炎性细胞。如图14所示，小鼠骨骼肌病理切片表明，sema7a2567-1，2567-3抗体治疗组小鼠骨骼肌炎性细胞的浸润要显著少于ev71感染非治疗组。同时我们对感染小鼠小肠组织进行he切片染色，如图15所示，与非治疗组比较，sema7a2567-1，2567-3抗体治疗组小鼠小肠微绒毛结构破坏得到改善。特别是在神经组织，如图16所示，我们也观测到相同的现象，在感染小鼠的脑干区域，sema7a2567-1，2567-3抗体治疗组小鼠的炎症细胞的浸润明显少于非治疗组ev71。
如图17所示，对感染小鼠第5天骨骼肌、小肠和脑干中的炎性细胞因子我们用定量pcr的方式进行了检测；检测结果表明：炎症细胞因子il-6、mcp-1和tnf-α在2567-1，2567-3抗体治疗组小鼠在骨骼肌、小肠和脑干与ev71非治疗组比较，有了明显的下降。
进一步参照图18所示，观察各组小鼠每天的生存情况，虽然抗体治疗最后不能提高小鼠的生存率，但是相比非治疗组在感染第7天全部死亡，sema7a抗体2567-1和2567-3治疗能显著地延长小鼠存活时间，和对照组比较接近1倍。
另外，我们建立了ev7病毒感染并通过sema7a抗体和抗病毒药物阿昔洛韦联合治疗的小鼠模型。取3-5天的雄性balb/c小鼠，分4组，每组6只，直接给小鼠腹腔注射107pfuev71病毒。在病毒感染的第一天，第三天和第五天分别以腹腔注射的方式给予小鼠sema7a2567-150ug/只，或者阿昔洛韦(25mg/kg)药物，或者两者都给与，ev71组为病毒感染非治疗对照组，control为健康小鼠组。
观察各组小鼠每天的生存情况，参见图19所示的semaphorin7a抗体和抗病毒药物阿昔洛韦联合治疗ev71感染小鼠的生存率图，结果表明：如果仅给予阿昔洛韦药物治疗，那么小鼠的存活率是33.4％(n＝6)，但是如果用sema7a抗体药物联合治疗的话，那么小鼠的存活率可以大大提高1倍到66.7％，因此，可以进一步说明我们制备的semaphorin7a单克隆抗体在ev71的临床治疗中具有巨大的应用价值。
本实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
1、本实施例给予了肠道病毒ev71急性感染以semaphorin7a单克隆抗体的治疗，能够有效缓解ev71急性感染和提高小鼠生存率，在肠道病毒ev71急性感染治疗中具有明显的疗效；
2、本实施例公开了semaphorin7a单克隆抗体在制备用于治疗肠道病毒ev71急性感染的药物方面的应用；在肠道病毒ev71急性感染的药物的研发及生产中，semaphorin7a单克隆抗体的用途发明具有重要意义；
3、本发明实施例建立了健康balb/c雄性小鼠模型，作为一种广泛接受并应用的肠道病毒ev71急性感染的动物模型，该模型适合临床应用研究，对于肠道病毒ev71急性感染的药物研发具有重要的应用推广价值。
实施例5
本实施例进一步提供了一种用于治疗炎症疾病的药物，本实施例中药物剂型为液体制剂，其活性成分包括前述的semaphorin7a单克隆抗体。其中，semaphorin7a单克隆抗体含量为75-120mg。该治疗炎症疾病的药物还包括药物辅料和药用基质。
具体地，药物辅料包括免疫佐剂、稳定剂、防腐剂。其中稳定剂可选用1％的人白蛋白；在具体实施中，也常选用麦芽糖、葡萄糖、山梨醇等糖类生物制剂稳定剂。免疫佐剂选用植物油佐剂，具体可选为甘油；防腐剂为浓度为0.5％的氯仿。
另外，药物制剂还可含有其它通常的辅料物质或添加剂，如抗氧化剂例如谷胱甘肽或者抗坏血酸等物质。
具体地，本发明实施例中包括semaphorin7a单克隆抗体作为活性组分制备药物的基质优选为含有氯化钠的缓冲的抗体溶液，如注射剂等。该抗体溶液与含有添加剂糖、氨基酸和表面活性剂的水溶液混合，同时用酸或碱调节ph至5-8。加入适量磷酸或磷酸盐和氯化钠，以使溶液达到先前确定的浓度。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
1、本发明实施例给予发病小鼠semaphorin7a单克隆抗体(2567-1、2567-3)的治疗，能够有效缓解病毒性心肌炎症、金黄色葡萄球菌(s.aureus)诱导的脓毒血炎症及肠道病毒ev71急性感染引起的炎症和提高小鼠生存率，在治疗部分炎症疾病具有明显的疗效；
2、本发明实施例公开了semaphorin7a单克隆抗体(2567-1、2567-3)在制备用于治疗炎症疾病的药物中的应用；在治疗炎症的药物的研发及生产中，semaphorin7a单克隆抗体(2567-1、2567-3)的新用途发明具有重要意义。
实施例6
首先如实施例5的制备过程制备作为注射制剂的溶液，然后，过滤除菌，冷冻干燥该溶液，制成冻干制剂。
本发明实施例在药用基质中还添加了含有对冷冻敏感抗体的不稳定水溶液通过冷冻干燥的方式转变成稳定的制剂，并且该稳定制剂在高温下亦不变质而保持稳定。在具体实施中，也常选用麦芽糖、葡萄糖、山梨醇等糖类生物制剂稳定剂。
根据本发明，该冷冻干燥物的另一个优点在于：除了冷冻期间避免抗体损伤之外，即使在50℃下长期储存，该冷冻干燥物的抗体含量不减少，并且没有聚集物形成或不发生絮凝。因此，抗体的含量和纯度，是稳定的。用注射用水再生冷冻干燥物之后，低浊度值显示颗粒物的形成被避免。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>苏州大学
<120>semaphorin7a单克隆抗体及其在制备用于治疗炎症疾病药物方面的应用
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ser
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