一种水稻耐冷主效QTLqCTS12的分子标记及其鉴定方法和应用与流程

本发明属于分子遗传学领域，具体是一种水稻耐冷主效qtlqcts12的分子标记及其鉴定方法和应用，适用于水稻苗期耐冷主效qtlqcts12的分子标记及其在水稻苗期耐冷品种选育和基因资源筛选中的应用。

背景技术：

水稻作为世界最重要的粮食作物之一，其产量的提高对于解决未来全球粮食问题具有十分重要的战略意义。然而，我国主要的水稻产区在水稻种植期间都常因低温胁迫而遭受冷害，如东北地区，平均3～4年就会遭遇一次冷害；长江中下游及南方的稻作区常出现的“倒春寒”使早稻出现烂秧的现象；南方晚稻遭遇“寒露风”则会引起水稻抽穗延迟；2008年初我国南方地区遭受的严重低温冰雪灾害，对华南地区已经播种的杂交水稻制种亲本造成了极大的损害。因此，为了克服低温对水稻栽培的不利影响，除了采取一般的农业措施之外，培育耐冷水稻品种是消除低温危害的最经济、最有效的手段之一。

水稻冷害发生时细胞外膜以及细胞器的质体膜透性增加，细胞内活性氧含量上升、光合呼吸作用下降，从而导致植株代谢能力下降、生长缓慢、叶片发黄或者枯死，这些生理症状为耐冷qtl的定位提供了表型基础。1996年几个水稻苗期耐低温qtls被首次报道，之后随着生物技术的快速发展，水稻耐冷qtls被不断被发现。迄今为止，在水稻的12条染色体上共有250多个水稻耐低温qtl被发现。然而大部分qtl只是停留在初定位的水平上，精细定位和克隆的qtl十分有限。

水稻耐冷qtl被精细定位的只有12个，包括萌发期耐低温qtlqltg-9；苗期耐低温qtlqcts4，qctss11，qsct1，qsct11和qlop2/qpsr2-1；苗期和成熟期耐低温qtlqrc10-2；孕穗期耐低温qtlqltb3，qctb7，qctb8，qct-3-2和qctb10-2。

水稻耐冷qtl被成功克隆的只有7个，包括qltg3-1，cold1，qcts-9，gstz2，ltg1、ctb1和ctb4a。qltg3-1能增强水稻在低温条件下种子萌发能力。cold1编码的是一种g蛋白信号调节因子，低温下cold1增强钙离子的内流激活下游基因提升水稻苗期抗寒性。过量表达qcts-9显著提升水稻低温抗性。gstz2编码蛋白第99位的苯丙氨酸对蛋白行使低温应答功能至关重要。ltg1编码一个酪蛋白激酶ⅰ，功能缺失型对低温敏感。ctb1编码一个包含f-box结构域的蛋白，低温下参与泛素-蛋白酶体信号传导途径。ctb4a编码lrr-rlk(leucine-richrepeatreceptor-likekinase)，它与atp合成酶的β亚基atpb互作，维持atp酶在低温条件下的正常功能。这些基因的克隆极大地促进了人们对水稻耐冷机理的理解。

耐冷qtl的挖掘，可以深化我们对水稻耐冷调控网络的认识和理解。同时，其所获得的分子标记还可以用于辅助选择育种。由于分子标记辅助选择(marker-assistedselection，mas)方法是对品种的基因型进行的选择，不受环境的影响，因此mas育种应用于对水稻耐冷qtl的改良，必将有效的提升育种的效率。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种水稻耐冷主效qtlqcts12的分子标记，通过检测水稻耐冷主效qtlqcts12的分子标记，能够快速筛选出苗期耐冷水稻品种，提高该性状的选择效率、加快育种进度。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种水稻耐冷主效qtlqcts12的分子标记，所述分子标记为m5和m6，其对应的引物分别是：

m5：

上游引物：5'—ataagacgaaaggtcaaacg—3'；

下游引物：5'—atggtccacctccagagt—3'；

m6：

上游引物：5'—tggctagaaaatagtgggaa—3'；

下游引物：5'—ccagttatccacgatgaaat—3'。

所述的水稻耐冷主效qtlqcts12的分子标记的获取方法，包括以下步骤：

利用耐冷广西普通野生稻dp15作为供体亲本，以冷敏感水稻品种9311作为轮回亲本构建的染色体片段替换系群体(chromosomesegmentsubstitutionlines，cssls)，通过连续回交、自交并定向选择，在bc5f2代获得稳定遗传的耐冷染色体片段代换系dc90，包含了12号染色体上的替换系片段qcts12。为了进一步精细定位qcts12，用dc90与9311回交，获得f1杂交种，自交后获得f2分离群体，通过基因型鉴定和表型鉴定，经过分子标记选择和苗期耐冷表型鉴定出w1，w2，w18，w32，w38，w50，w82，w1758个重要的交换单株。本实验基于材料9311，dc90，nc，w1，w2，w18，w32，w38，w50，w82，w175通过pcr技术扩增亲本dp15和9311筛选多态性分子标记，并用所获得的多态性分子标记在各交换单株中进行验证，获得权利要求1所述的分子标记。

所述水稻耐冷主效qtlqcts12的分子标记在水稻苗期耐冷qcts12的定位中的应用。

所述的水稻耐冷主效qtlqcts12的分子标记方法，包括以下步骤：

以待鉴定水稻材料全基因组dna为模板，利用以上所述的分子标记m5和m6对应引物的进行pcr扩增，对扩增产物进行检测：

(1)采用分子标记m5引物进行pcr扩增，若扩增出167bp的特异扩增片段，则表明存在苗期耐冷主效qtlcts12；

(2)采用分子标记m6引物进行pcr扩增，若扩增出132bp的特异扩增片段，则表明存在苗期耐冷主效qtlcts12；

所述pcr的反应10ul体系如下：

所述pcr反应条件：94℃变性5min，94℃30s，58℃30s，72℃45s，扩增35个循环，最后72℃终延伸10min。

dna扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并通过核染料标记扩增的dna条带，通过凝胶成像仪对标记dna成像。

所述的分子标记方法在选育水稻耐冷品种中的应用。

本发明的有益效果为:

(1)通过水稻耐冷主效qtlqcts12的分子标记的发现，能够加快该耐冷qtlqcts12的精细定位，并将其应用于辅助选择育种，便于及时的杂交转育，加快育种进程；

(2)建立了一种水稻耐冷主效qtlqcts12的分子标记方法，能够准确、快速地鉴别带有qcts12的耐冷单株，提高该形状的选择效率，加快育种进度。

(3)通过水稻耐冷主效qtlqcts12的分子标记定位的主效基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测与该基因位点连锁的分子标记，即可以预测水稻植株的苗期耐冷抗性，用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有苗期耐冷抗性，进而快速筛选耐冷品种或品系用于水稻育种。丰富了人们对水稻耐冷调控网络的认识和理解，也增加了水稻耐冷基因资源的多样性，为培育不同类型的耐冷水稻品种提供了更多的选择；

附图说明

图1是染色体片段代换系cssl12dc90的遗传背景；

图2苗期低温胁迫表型，其中：a：冷处理前9311、nc和dc90表型；b：在8-10℃下冷处理5天，9311、nc和dc90表型；c：冷处理5天后，在正常条件下恢复7天，9311、nc和dc90表型；

图3是f2代交换单株苗期冷胁迫表型鉴定；

图4是qcts12遗传连锁分析；

图5是分子标记引物m5和m6对52个不同的水稻品种扩增的部分扩增带型；其中，图5a为分子标记引物m5对52个不同的水稻品种的部分扩增带型；图5b为分子标记引物m5对52个不同的水稻品种的部分扩增带型；

图6a和图6b是52个不同的水稻品种冷胁迫处理后的部分表型图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

分子标记的筛选和定位

1.耐冷染色体片段代换系cssl12的构建与代换片段耐冷表型分析

(1)、利用耐冷广西普通野生稻dp15作为供体亲本，以冷敏感水稻品种9311作为轮回亲本构建的染色体片段替换系群体(chromosomesegmentsubstitutionlines，cssls)，通过连续回交、自交并定向选择，在bc5f2代得到了dc90和nc这两个遗传背景近似的染色体片段替换系。dc90大部分遗传背景与轮回亲本9311一致，只在3号和12号染色体上有dp15的片段替换，其长度分别为10mb和20mb。而nc只在3号染色体上有dp15的片段替换，且与dc90中3号染色体替换区域相同，如图1所示。

(2)、对dc90和nc进行耐冷表型鉴定，结果发现，dc90具有对冷胁迫耐受的能力，而nc表现为冷敏感，如图2所示。结合dc90与nc的遗传背景推断，dc90冷耐受能力是由位于12号染色体上dp15的片段控制的，位于分子标记m3和m12之间的20mb大小的区域，因此获得了具有苗期耐冷抗性的替换系片段dc90。

2.dc90/9311的f2分离群体的构建与遗传分析

(1)、利用耐冷染色体片段代换系dc90与受体亲本9311杂交，获得f1杂交种，种植f1杂交种，自交获得f2分离群体，用于遗传分析。

(2)、用tps法提取亲本及f2群体各单株的叶片基因组dna。

(3)、将dp15和9311基因序列信息进行比对，在m3和m12区段设计了50多个sts标记用于进一步的精细定位。其中具有多态性的indel分子标记有m4，m5，m6，m7，m8，m9，m10，m11。

(4)利用分子标记筛选f2群体精细定位cts12基因

根据qtl的定位结果，利用获得的多态性分子标记m4，m5，m6，m7，m8，m9，m10，m11鉴定f2群体中每个个体的目标区域的基因型，从f2群体筛选得到了一系列交换型的单株，结合检测各单株的基因型和表型，考察标记与抗性表型共分离的情况。

上述连锁分析和初步定位过程，所采用的dna提取方法和pcr反应条件分别为：

a.用常规的tps法提取供体亲本、受体亲本和f2分离群体各单株的dna；

b.pcr的反应体系如下：

pcr反应条件为：94℃变性5min，94℃30s，58℃30s，72℃45s，扩增35个循环，最后

72℃终延伸10min。

dna扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，通过显色记录扩增的dna条带。

由上述过程可以看出利用这些与耐冷主效qtlqcts12的分子标记能够有效地开展耐冷qtlqcts12的分子标记辅助选择育种；同时能够利用大的分离群体，加快对耐冷qtlqcts12的精细定位。

(五)结果与分析

通过重组单株的基因型和相应耐冷表型鉴定，见表1及图3，结合基因型和表型遗传连锁分析：w18表现为冷敏感，则qcts12应位于分子标记m6的左侧。w38表现为冷耐受，则qcts12应位于m4的右侧。综上所述，qcts12应定位于分子标记m4和m6之间1.36mb的区域内，如图4所示。与之前的定位结果相比较，qcts12属于一个新的水稻苗期耐冷qtl位点。

表1f2交换单株基因型

注表1中：a代表9311基因型；b代表dp15基因型；h代表杂合型。

实施例2

分子标记的验证

1、材料和方法

1.1材料

52份不同来源的水稻品种

1.2方法

1.2.1pcr扩增：tps抽提法提取水稻叶片基因组dna，用引物m5和m6扩增所提取的样品dna，方法同实施例1。

1.2.2冷胁迫表型鉴定：选取饱满的种子，在30℃水温中发芽3天。待种子“露白”，播于盛满大田土壤的塑料桶中正常生长，环境温度30℃，光照20000lux，空气湿度40％。当幼苗长到3叶期后进行冷处理。当幼苗长到3叶期放入8℃—10℃的人工气候培养室中冷处理5天，期间光照周期为13h(光)/11h(暗)，光照强度20000lux，空气湿度40％。冷处理结束后将幼苗转移到正常条件下生长，7天后统计水稻苗期冷胁迫后存活率。所述正常条件为白天28℃/晚上26℃,光照强度20000lux，空气湿度40％。

2结果分析

(1)采用分子标记m5引物对不同水稻品种dna进行扩增，若扩增出167bp的特异扩增片段，则表明有耐冷主效qtlqcts12的存在，用b表示基因型；若能扩增出146bp的扩增片段，则表明有亲本9311的扩增片段，用a表示基因型，如图5a所示；

(2)采用分子标记m6引物对不同水稻品种dna进行扩增，若扩增出132bp的特异扩增片段，则表明有耐冷主效qtlqcts12的存在，用b表示基因型；若能扩增出107bp的扩增片段，则表明有亲本9311的扩增片段，用a表示基因型，如图5b所示；

(3)统计水稻基因型及苗期冷胁迫后存活率，如表2及图6a和图6b所示，基因型为a的水稻品种，苗期冷胁迫后存活率为0；基因型为b的水稻品种，苗期冷胁迫后存活率为68.97％。综合起来准确率可以达到82.69％。

基于上述2个分子标记来检测水稻品种，可验证是否含有耐冷主效qtlqcts12的存在，可以快速进行耐冷水稻品种的选育，从而加快育种进度。

表252份水稻品种基因型及冷胁迫表型

注表2中：a代表9311基因型；b代表dc90基因型；

1代表活，0代表死。

序列表

<110>广西大学

<120>一种水稻耐冷主效qtlqcts12的分子标记及其鉴定方法和应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ataagacgaaaggtcaaacg20

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atggtccacctccagagt18

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tggctagaaaatagtgggaa20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ccagttatccacgatgaaat20