调控水稻细菌性褐条病抗性的主效QTL位点Apam-1的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于水稻抗病育种及分子生物学领域，具体涉及一个调控水稻细菌性褐条病抗性的主效qtl位点apam-1的分子标记及其应用。

背景技术：

水稻细菌性褐条病(bacterialbrownstripeofrice,bbsr)又称水稻细菌性心腐病，是一种带菌率极高的种传病害。该病最早于上世纪五十年代在日本被发现，目前在亚洲、非洲、欧洲、美洲等世界范围内都有报道，在我国主要分布于长江流域和华南水稻产区(刘贺，2015)。水稻细菌性褐条病在大田中浅水管理时发病率很低，在0.07％以下，症状主要表现为单丛枯心。若经常保持深水的稻田，会呈中心病株扩散型，多丛集中在一起发病，发病率可达1％左右。如果大水淹苗，丛发病率都在15％左右，高的达100％，这对水稻的产量和质量会造成极大的危害。近几年来，随着早、中稻生长季节时常伴有暴雨，稻苗受淹或受洪涝侵袭的几率增大，使得褐条病在局部发生大流行，使得水稻产量损失严重(杨春兰，2015)。一般水淹过后一星期即见明显发病。原发病株为枯心型，被传染株症状先以边叶枯褐条症状为主，接着或同时发生枯心症状。如遇高温晴天，枯心表现为青枯扭曲筒卷的急性症状，由此可看出，水是再侵染扩散的途径；大水漫秧，伤口多，侵入发病也多(李俊平等，2002)。燕麦食酸菌燕麦亚种(acidovoraxavenaesub.avenae)是引起该种病害的病原菌，被该菌侵染的植株大多在抽穗前便枯死，存活下来的常早穗。孕穗期，穗苞染病导致穗早枯，穗颈异常伸长，小穗梗淡褐色且弯曲畸形，谷粒呈褐色不实，部分稻穗或还未伸长就从剑叶叶枕下破叶鞘而出，或裹在叶鞘内成“闷死胎”(王丽，2016；申荣萍等，2015)。

水稻细菌性褐条病发病严重，防治困难，目前生产上采取的防治措施主要有农业防治和化学防治。虽然这些措施起到了一定的防治作用，但却不能从根本上减少水稻细菌性褐条病的发生。抗性基因是水稻与病原菌长期互作的过程中演化出来了的多种防卫机制之一。挖掘水稻基因组上的抗细菌性褐条病遗传位点，导入到我们常用的水稻主栽品种中，以适应各地不同的气候条件，就能极大降低褐条病的发病率，且是一种最安全且经济有效的防治途径。迄今，qtl定位研究在水稻上虽有较多的报道，但在水稻抗细菌性褐条病基因qtl定位分析方面的报道非常少，通过构建遗传连锁图谱和数量性状位点(quantitativetraitlocus，qtl)分析，可以有效的找到与水稻细菌性褐条病抗性相关的主效qtl并应用于水稻分子辅助育种，改良水稻植株，节约了成本，还提高了育种效率。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供调控水稻细菌性褐条病抗性的主效qtl位点apam-1的分子标记及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种调控水稻细菌性褐条病抗性的主效qtlapam-1：qtl位点位于1号染色体dna片段上，遗传距离为162.95-172.83cm，物理距离为38013068bp-40317380bp，lod值高达4.67。

注：其对水稻细菌性褐条病具有较强抗性。qtl指的是控制数量性状的基因在基因组中的位置。

本发明还同时提供了调控水稻细菌性褐条病抗性的主效qtl位点apam-1的indel标记：为bbsr-1和bbsr-2的引物对；

分子标记indelbbsr-1的引物对为：

上游引物5’-catagcattttcgatttttgaa-3’

下游引物5’-cttgtgacggaaccaaatca-3’；

分子标记indelbbsr-2的引物对为：

上游引物5’-aatgatgaggggagtggatg-3’

下游引物5’-agctactggtggtgcttgct-3’。

本发明还同时提供了一种人工接种鉴定水稻植株抗病性的方法：

以华占、热研及其后代群体为研究对象，人工接种褐条病菌rs-1，对双亲华占、热研及群体各株系的植株高度进行测量和量化分析(接菌3周后进行，测量和量化分析的具体内容为用米尺从水稻茎秆底部向上测量水稻最高点的高度，每个株系分别测量4株接过菌的水稻和4株未接过菌的水稻)，判断植株是否具有对水稻细菌性褐条病具有抗性。

判定标准为：当该株系内接过菌的水稻平均植株高度/未接菌水稻平均植株高度>0.96时，判定该株系对水稻细菌性褐条病具有抗性；反之，当该株系内接过菌的水稻平均植株高度/未接菌水稻平均植株高度≤0.96时，则判定该株系对水稻细菌性褐条病不具有抗性。

注：热研是抗性亲本，在热研接菌后，水稻植株高度降低为正常植株的96％，因此选择0.96作为判断水稻是否具有褐条病抗性的指标。

若植株对褐条病是易感的，则接种过褐条病菌的植株高度会明显低于正常植株。水稻褐条病发时整个植株都会出现细小的褐色斑纹，随着病菌的蔓延最后整个植株腐烂，不易量化。

本发明还同时提供了一个调控水稻细菌性褐条病抗性的主效qtl的分子标记应用，利用分子标记方法进行筛选，定向选择，可获得具有条斑病抗性的水稻，大大提高了育种效率。

本发明的标记多态性好，选择方便，高效。

本发明针对上述研究背景，以籼稻华占(感性)/粳稻热研(抗性)杂交组合的ril群体为材料，进行了抗水稻细菌性褐条病性状的qtl定位。

本发明的目的之一在于提供一个调控水稻细菌性褐条病抗性的主效qtl位点，并将其命名为apam-1，所述的主效qtl被定位于1号染色体dna片段上，indel标记bbsr-1和indel标记bbsr-2之间；遗传距离为162.95-172.83cm，物理距离为38013068bp-40317380bp，lod值高达4.67，具有显著的水稻细菌性褐条病抗性，在育种过程中可以减少甚至消除水稻细菌性褐条病对水稻植株的危害。因此，本发明还保护所述的调控水稻细菌性褐条病抗性的主效qtl在优化水稻品种中的应用。

本发明还提供所述调控水稻细菌性褐条病抗性的主效qtl的定位方法，包括以下步骤：1)以华占、热研为亲本进行杂交，通过单粒传法，获得稳定遗传的株系，组成ril群体(获得134个稳定遗传的株系，共同组成ril群体)；2)采用人工接种鉴定方法测定ril群体的抗病性，以接过菌和未接菌植株的高度差异作为数量性状表型值，并以此区分各个株系对水稻细菌性褐条病的抗感性；3)利用实验室前期开发的大量snp标记和indel标记构建遗传图谱，通过r-qtl分析整个染色体组的snp标记和数量性状表型值的关系，将qtl逐一定位到连锁群的相应位置，并估计其遗传效应。若检测到lod>3的分子标记，则认为lod值最高处对应的2个标记间存在1个qtl。

本发明还提供一种人工接种鉴定水稻植株抗病性的方法，以华占、热研及其后代群体134个重组自交系为材料，人工接种褐条病菌rs-1，对双亲及群体各株系的植株高度进行测量和量化分析，判断植株是否具有对水稻细菌性褐条病具有抗性。

本发明的另一目的是提供调控水稻细菌性褐条病抗性的主效qtl位点apam-1的分子标记及其应用。

利用分子标记indelbbsr-1的引物对、分子标记indelbbsr-2的引物对，对待鉴定水稻材料的dna进行pcr扩增，扩增产物进行电泳检测，如扩增出对应大小的dna片段，则标志着qtlapam-1存在。

其中，所述分子标记indelbbsr-1的引物对，对dna进行pcr扩增后，电泳能检测到与水稻品种热研相同位置的条带。

其中，所述分子标记indelbbsr-1的引物对，其为：

上游引物5’-catagcattttcgatttttgaa-3’

下游引物5’-cttgtgacggaaccaaatca-3’。

其中，所述分子标记indelbbsr-2的引物对，对dna进行pcr扩增后，电泳能检测到与水稻品种热研相同位置的条带。

其中，所述分子标记indelbbsr-2的引物对，对dna进行pcr扩增后，电泳能检测到与水稻品种热研相同位置的条带。

其中，所述分子标记indelbbsr-2的引物对，其为：

上游引物5’-aatgatgaggggagtggatg-3’

下游引物5’-agctactggtggtgcttgct-3’。

其中，所述分子标记indelbbsr-2的引物对，对dna进行pcr扩增后，电泳能检测到与水稻品种热研相同位置的条带。

其中，所述pcr反应体系如下

其中，pcr反应条件为：94℃变性3min，94℃30s，57℃30s，72℃30s，扩增38个循环，最后72℃终延伸10min。

本发明还有一个目的在于提供所述的调控水稻细菌性褐条病抗性的主效qtl位点的分子标记在选育抗细菌性褐条病水稻品种的应用。

本发明采用qtl位点的分子标记方法，本方法是应用筛选到的在热研1号染色体上定位到的调控水稻细菌性褐条病抗性的主效qtlapam-1紧密连锁的2对分子标记，预测水稻材料的细菌性褐条病抗性，加快抗性水稻品种的选择进度。

本发明的有益效果主要在于：

本发明首次公开了一个调控水稻细菌性褐条病抗性的主效qtl，影响水稻植株对水稻细菌性褐条病的抗性；把所述qtl位点存在的调控水稻细菌性褐条病抗性的基因命名为apam-1。该qtl位点与水稻细菌性褐条病抗性相关，主要影响植株的生长发育，对植株的高度有着明显的影响，从而对水稻产量和质量产生重要影响，该qtl位点增强植株对水稻细菌性褐条病的抗性，可用于水稻分子辅助育种，加速水稻育种进程，简便易行，安全有效，有益于提高水稻品种的经济价值，适于大规模推广应用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是调控水稻细菌性褐条病抗性的主效qtl定位方法中遗传材料构建流程图。

图2是人工接种褐条病菌后对ril群体中植株高度的统计柱状图，从而判断植株对水稻细菌性褐条病的抗性差异。其中，hzry代表接菌之后亲本华占和亲本热研的植株高度，ry代表未接菌亲本热研的植株高度，hz代表未接菌亲本华占的植株高度。

图3是分子标记indelbbsr-1的引物对在亲本及其f1代和ril群体中扩增产生的电泳图。其中，1为感病品种华占、2为抗病品种热研、3为华占/热研杂交后代f1、4-10为华占/热研杂交组合的ril群体。

图4是分子标记indelbbsr-2的引物对在亲本及其f1代和ril群体中扩增产生的电泳图。其中，1为感病品种华占、2为抗病品种热研、3为华占/热研杂交后代f1、4-10为华占/热研杂交组合的ril群体。

图5是分子标记indelbbsr-1的引物对在亲本华占、热研及其f1代和以华占为轮回亲本的bc3f1代中扩增产生的电泳图。其中，1为感病品种华占、2为抗病品种热研、3为华占/热研杂交后代f1、4-10为以华占为轮回亲本的bc3f1代中扩增产生的电泳图。

图6是分子标记indelbbsr-2的引物对在亲本华占、热研及其f1代和以华占为轮回亲本的bc3f1代中扩增产生的电泳图。其中，1为感病品种华占、2为抗病品种热研、3为华占/热研杂交后代f1、4-10为以华占为轮回亲本的bc3f1代中扩增产生的电泳图。

图7是调控水稻细菌性褐条病抗性的主效qtlapam-1在1号染色体上的位置。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定，以下实施例中的若未特别说明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1、实验材料的获取

本地水稻品种华占对水稻细菌性褐条病的抗性较强，以华占为供体亲本，本地水稻品种热研为受体亲本，进行杂交构建rils，利用单粒传法(即，对f1进行套袋单株受种处理，直至后代株系表型不发生分离)，最终得了134个稳定遗传的株系(f13，所有株系表型稳定)，如图1。

选取亲本与各株系(f13)种子各60粒，表面消毒后浸种2天，再用湿润的毛巾包裹，置于37℃恒温箱中催芽48h后，挑选露白一致的种子播种。30天后，选择生长状况相似的亲本及各株系秧苗各24株移栽，所有水稻材料种植于浙江省金华市浙江师范大学生化学院试验田，常规管理。

实施例2、人工接菌鉴定

取rs-1菌株(4℃保存)，在na培养基平板上划线培养48h后，挑取平板上的单菌落接种到200ml的nb培养基上，以180r/min的速度于28℃恒温摇床上振荡培养24h，所得菌液(浓度为9×10⁹个/ml)即可用于接菌。在水稻苗期，采用茎部注射法接种褐条病菌，接种时各设置4组实验组和4组对照组。接种1周后开始每2日观察水稻表面褐色病斑的发生情况，在接菌3周后测量各株系接过菌和未接菌水稻的株高，并根据水稻株高判断植株之间的抗性差异(图2)。

图2中，hzry代表接菌之后亲本华占和亲本热研的植株高度，ry代表未接菌亲本热研的植株高度，hz代表未接菌亲本华占的植株高度；根据图2可得知接菌3周后，亲本的株高变化差异明显。hz接菌后的平均株高为104.00cm，比正常未接菌植株的平均株高矮了6.50cm；ry的平均株高为101.40cm，比正常植株的平均株高矮了3.60cm，两个亲本间褐条病抗性差异明显。株高统计结果显示，ril群体接菌后的平均株高为105.40cm，正常植株的平均株高为110.43cm。群体内出现一定数量的超亲个体，且株高表现为正态分布。

rs-1菌株，在已经公开发表于《arch.microbiol》的icmfanddotuarerequiredforthevirulenceofacidovoraxoryzaestrainrs-1中有告知。

实施例3、qtl定位分析

利用实验室前期开发的大量snp标记和indel标记构建的遗传图谱，对褐条病接菌后的株高进行数量性状座位(qtl)区间作图，通过专业软件r-qtl分析整个染色体组的snp标记和数量性状表型值的关系，将qtl逐一定位到连锁群的相应位置，并估计其遗传效应。若检测到lod>3的分子标记，则认为lod值最高处对应的2个标记间存在1个qtl(图3、4)。在整个染色体组中找到位于1号染色体上的一个主效qtl，其遗传距离为162.95-172.83cm，物理距离为38013068bp-40317380bp，并命名为apam-1(图7)。

qtl指的是控制数量性状的基因在基因组中的位置，本发明定位的qtl位于1号染色体dna片段上，物理距离在38013068bp-40317380bp之间。

实施例4、以华占、热研及其后代群体共计2680株(每类设置20个重复)，人工接种褐条病菌rs-1，对双亲华占、热研及群体各株系的植株高度进行测量和量化分析，判断植株是否具有对水稻细菌性褐条病具有抗性；

具体如下：接菌3周后进行，用米尺测量水稻从茎秆底部至最高处的高度，每个株系分别测量4株接过菌的水稻和4株未接过菌的水稻，分别求取平均数，相减得到该株系接菌前后植株的高度差。

按照如下判定标准进行判断：当该株系内接过菌的水稻平均植株高度/未接菌水稻平均植株高度>0.96时，判定该株系对水稻细菌性褐条病具有抗性；反之，当该株系内接过菌的水稻平均植株高度/未接菌水稻平均植株高度≤0.96时，则判定该株系对水稻细菌性褐条病不具有抗性。

所得的测定结果如图2。

验证实验、利用分子标记辅助选择法对上述植株进行判定正确性的验证：

在qtl位点apam-1上下游分别设定分子标记bbsr-1和分子标记bbsr-2。

分子标记indelbbsr-1的引物对为：

上游引物5’-catagcattttcgatttttgaa-3’

下游引物5’-cttgtgacggaaccaaatca-3’；

分子标记indelbbsr-2的引物对为：

上游引物5’-aatgatgaggggagtggatg-3’

下游引物5’-agctactggtggtgcttgct-3’。

取亲本华占、热研及其f1代和ril群体的水稻叶片，提取基因组dna，利用上述分子标记对其基因组dna进行pcr扩增，pcr反应体系：上游引物1μl，下游引物1μl，dna2μl，mix酶6μl。反应程序为dna94℃预变性3min，94℃预变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，扩增38个循环，最后72℃终延伸10min。pcr扩增产物用4％琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如下：被判定成对水稻细菌性褐条病具有抗性的，经该法验证所得的结果为pcr扩增产物的电泳条带趋向于亲本热研；被判定成不对水稻细菌性褐条病具有抗性的，经该法验证所得的结果为pcr扩增产物的电泳条带不同于亲本热研(图5、6)。即，两种方法所得的结果完全一致。

实施例5、水稻抗褐条病qtl在水稻育种中的应用：

实施例4中设定的分子标记可应用于水稻分子辅助育种，具体实施方式为，将其他感褐条病的水稻品种，如华占，与热研进行杂交，获得相应的f1，以华占为轮回亲本进行回交，至bc3f1代。提取bc3f1代部分单株dna，然后用indel标记bbsr-1和bbsr-2的引物进行pcr扩增，通过带型分析来确定是否存在相应的标记，存在标记的说明该株系水稻细菌性褐条病达到抗的水平，不存在则是感病(图4)。标记辅助检测后收取阳性单株的自交种，随后利用人工接种鉴定的方法进行苗期的褐条病抗性鉴定。验证结果为转化的植株具有水稻细菌性褐条病抗性，接菌后植株高度/正常植株>0.96，即获得具有褐条病抗性基因apam-1的水稻转基因株。利用该方法进行筛选，定向选择，可获得具有褐条病抗性且保留了华占优良性状的水稻，大大提高了育种效率。

综上所述，本发明的调控水稻细菌性褐条病抗性的主效qtl可以有效的增强水稻植株对水稻细菌性褐条病的抗性，在育种过程中可以减少甚至消除水稻细菌性褐条病对水稻植株的危害，同时可加快优化水稻品种的进程。同时在水稻分子辅助育种的过程中可以培育抗褐条病水稻，降低水稻细菌性褐条病的发病率。此种方法简便易行，安全有效，有益于提高水稻品种的经济价值，适于大规模推广应用。

由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110>浙江师范大学

<120>调控水稻细菌性褐条病抗性的主效qtl位点apam-1的分子标记及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

catagcattttcgatttttgaa22

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cttgtgacggaaccaaatca20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aatgatgaggggagtggatg20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

agctactggtggtgcttgct20