一种转基因玉米双抗12-6转化体特异性PCR的检测方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种转基因玉米双抗12-6转化体特异性pcr的检测方法，包括普通pcr和实时荧光pcr检测方法。
背景技术：
：玉米是世界三大粮食作物之一，在我国东北、华北和西南山区大量种植玉米，玉米是重要的加工产原料，同时玉米也是虫害和杂草发生较为严重的作物之一。亚洲玉米螟是危害我国玉米的主要害虫，北方春玉米区因玉米螟为害，一般年份减产10％左右，大发生年份可导致玉米损失30％以上甚至绝产。在玉米生育期施用化学药剂防治玉米螟十分困难，并且对生态环境污染严重。田间杂草也影响玉米的生长，给种植者带来生产上的不便。以转基因技术为核心的新品种设计技术则可以将抗性基因导入玉米染色体中，从而使改造后的品种具有很高的抗虫和耐除草剂特性。目前已经有多个转基因玉米转化体准入环境释放和生产性试验，对转基因作物及其产品进行有效监管是转基因生物安全的前提。利用外源插入位点的旁侧序列鉴定转基因转化体，设计转化体特异性引物对其进行检测，普通pcr检测方法应用最早，操作方便，对仪器配备要求较低，能够满足检测的需要。近年来，实时荧光定量pcr技术以其特异性强、灵敏度高等优点在定量检测方面得到广泛应用，也是转基因检测领域的一种发展趋势。所以本专利提供了转化体特异性的普通pcr和实时荧光pcr两种检测方法。双抗12-6是最新研发的转基因抗虫耐除草剂玉米转化体，尚无任何相关转基因玉米双抗12-6转化体特异性检测方法的文章报道和专利。技术实现要素：本发明的目的在于提供了一种转基因玉米双抗12-6转化体特异性pcr的检测方法，利用外源插入位点的旁侧序列特异性地鉴定转基因玉米转化体，根据双抗12-6外源基因插入基因的旁侧序列提供该转基因玉米转化体的特异性普通pcr和实时荧光pcr检测方法。为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：本方法通过对转基因抗虫耐除草剂玉米双抗12-6外源插入基因的旁侧序列进行分析，设计了双抗12-6转化体特异性普通pcr检测的引物和实时荧光pcr检测的引物及探针，并通过引物、探针组合的筛选，特异性测试，pcr扩增条件的优化，灵敏度测试等步骤，最终确立了用于特异性检测双抗12-6的普通pcr检测和实时荧光pcr检测方法。其中用于双抗12-6普通pcr检测的引物序列为：正向引物为sk12-6-f：5’-cagtactaaaatccagatcccccga-3’，反向引物为sk12-6-r：5’-cagacgacggtccgctaa-3’，特异性实时荧光pcr引物序列为：正向引物为sk12-6-qf：5’-cgcgtcgcacgatggt-3’，反向引物为sk12-6-qr：5’-gtcgtttcccgccttcagt-3’，探针为sk12-6-p：5’-fam-ccacacgcgtgcgcgca-bhq1-3’本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了转基因抗虫耐除草剂玉米双抗12-6转化体特异性的普通pcr检测方法和实时荧光pcr检测方法，为转基因抗虫耐除草剂玉米双抗12-6及其衍生品种的检测提供了转化体特异性检测方法。本发明所述转基因抗虫耐除草剂玉米双抗12-6转化体特异性普通pcr和实时荧光pcr检测的方法，该方法以转基因玉米双抗12-6基因组dna为模板，分别进行普通pcr扩增和实时荧光pcr扩增。具体实施方式实施例1转基因玉米双抗12-6转化体特异性普通pcr检测一、实验材料1.植物材料（1）阳性对照：抗虫耐除草剂玉米双抗12-6。（2）阴性对照：抗虫耐除草剂玉米双抗12-6受体材料。（3）空白对照：ddh2o。（4）转基因大豆混样：rrs、356043、305423、cv127、mon89788、a5547-127、a2704-12，每种转化体含量各1%。（5）转基因水稻混样：tt51-1、kf-6、kf-2、kmd-1、m12、kf-8，每种转化体含量各1%。（6）其他转基因玉米混样：bt11、bt176、mon810、mon863、ga21、nk603、t25、tc1507、mon89034、mon88017、59122、mir604、3272、mon87460，每种转化体含量各1%。（7）转基因油菜混样：ms1、ms8、rf1、rf2、rf3、t45、oxy235、topas19/2，每种转化体含量1%。（8）转基因棉花混样：mon1445、mon531、mon15985、llcotton25、mon88913，每种转化体含量1%。试剂（1）2xgreentaqmastermix，购自promega公司；（2）pcr扩增引物及探针：苏州金唯智生物科技有限公司合成；（3）2000bpdnamarker由宝生物工程（takara）有限公司提供；（4）agarose：西班牙琼脂糖，biowest公司提供；3实验仪器（1）分析天平：pb153，瑞士梅特勒；（2）高速冷冻离心机：bekman，allegra21r；（3）pcr扩增仪：abiveriti96pcr仪；（4）电泳仪系统：bio-radpowerpacbasic电源、bio-radsub-cellgt水平电泳槽；（5）凝胶成像系统：azure凝胶成像系统；（6）移液器：eppendorfresearch可调量程移液器。二、实验方法1.植物基因组dna提取使用植物基因组dna提取试剂盒，提取阳性对照、阴性对照、转基因大豆混样、转基因水稻混样、其他转基因玉米混样、转基因油菜混样和转基因棉花混样基因组dna，为供试品dna模板，稀释至25ng/μl备用。2.转基因玉米双抗12-6转化体特异性普通pcr检测根据插入基因的旁侧序列，设计转化体特异性检测引物，详见表1。表1双抗12-6普通pcr和实时荧光pcr检测引物及探针名称序列5’-3’sk12-6-fcagtactaaaatccagatcccccgask12-6-rcagacgacggtccgctaask12-6-qfcgcgtcgcacgatggtsk12-6-qrgtcgtttcccgccttcagtsk12-6-pfam-ccacacgcgtgcgcgca-bhq13.采用普通pcr方法扩增基因组dna以sk12-6-f和sk12-6-r为一对特异性引物，按表2所述普通pcr反应体系和反应条件进行pcr扩增，分别进行特异性检验和灵敏度测定等试验，扩增产物电泳检测。表2普通pcr和实时荧光pcr反应体系和反应条件三、实验结果（1）特异性检验用表1中的sk12-6-f和sk12-6-r这对引物扩增双抗12-6dna得到片段为259bp，条带清晰，且空白和阴性非转基因受体没有相应的扩增条带。特异性检验结果显示，转基因大豆混样、转基因水稻混样、转基因油菜混样、转基因棉花混样和其他转基因玉米混样基因组dna均没有相应的扩增条带，特异性良好。（2）灵敏度测定将提取的双抗12-6基因组dna用鲑鱼精子dna进行梯度稀释，dna浓度分别为100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%和0%，灵敏度检测结果显示，dna浓度在0.1%时，仍然能扩增出明显的条带。实施例2转基因玉米双抗12-6转化体特异性实时荧光pcr检测一、实验材料1.植物材料同实施例1中“植物材料”。2.试剂（1）2xpremixextaq(probeqpcr)由宝生物工程（takara）有限公司提供；（2）pcr扩增引物及探针：苏州金唯智生物科技有限公司合成；3实验仪器（1）分析天平：pb153，瑞士梅特勒；（2）高速冷冻离心机：bekmanallegra21r；（3）实时荧光pcr扩增仪：abisteponeplus实时荧光定量pcr系统；（4）移液器：eppendorfresearch可调量程移液器。二、实验方法1.植物基因组dna提取同实施例1中“植物基因组dna提取”。2.基于转基因抗虫耐除草剂玉米双抗12-6转化体特异性实时荧光pcr检测根据插入基因的旁侧序列，设计转化体特异性检测引物及探针，详见表1，按表2所述实时荧光pcr反应体系和反应条件进行pcr扩增，分别进行特异性检验和灵敏度测定等试验。三、实验结果（1）特异性检验用表1中的引物sk12-6-qf、sk12-6-qr和探针sk12-6-p扩增双抗12-6dna，扩增曲线良好，且空白和阴性非转基因受体没有出现扩增。特异性检验结果显示，转基因大豆混样、转基因水稻混样、转基因油菜混样、转基因棉花混样和其他转基因玉米混样基因组dna均没有出现扩增，特异性良好。（2）灵敏度测定将提取的双抗12-6基因组dna用鲑鱼精子dna进行梯度稀释，dna浓度分别为100%、10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0%，pcr扩增结果显示，最终确立的实时荧光检测方法的灵敏度为0.01%。附图说明:图1：转化体特异性普通pcr特异性检测验证图。泳道1：dl2000dnamarker；泳道2：空白（h2o），未扩增出特异条带；泳道3：双抗12-6阴性受体，未扩增出特异条带；泳道4：双抗12-6dna扩增出259bp片段，泳道5-9：依次分别为转基因大豆混样、转基因水稻混样、转基因油菜混样、转基因棉花混样和其他转基因玉米混样，未扩增出特异条带。图2：转化体特异性普通pcr灵敏度验证图。泳道1：dl2000dnamarker；泳道2-9：依次分别为双抗12-6dna浓度100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%，扩增出259bp片段；泳道10：双抗12-6dna浓度0.01%，扩增259bp片段模糊不清晰；泳道11：双抗12-6dna浓度0%，未扩增出特异条带。图3：转化体特异性实时荧光pcr特异性检测验证图。自左向右依次为1：双抗12-6dna扩增曲线；2-9：依次为空白（h2o）、双抗12-6阴性受体、转基因大豆混样、转基因水稻混样、转基因油菜混样、转基因棉花混样和其他转基因玉米混样，未有曲线扩增。图4：转化体特异性实时荧光pcr灵敏度检测验证图。1-9自左向右依次为：双抗12-6dna浓度100%、10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0%。序列表<110>天津市农业质量标准与检测技术研究所<120>一种转基因玉米双抗12-6转化体特异性pcr的检测方法<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>25<212>dna<213>玉米(zeamays)<400>1cagtactaaaatccagatcccccga25<210>2<211>18<212>dna<213>玉米(zeamays)<400>2cagacgacggtccgctaa18<210>3<211>16<212>dna<213>玉米(zeamays)<400>3cgcgtcgcacgatggt16<210>4<211>19<212>dna<213>玉米(zeamays)<400>4gtcgtttcccgccttcagt19<210>5<211>17<212>dna<213>玉米(zeamays)<400>5ccacacgcgtgcgcgca17当前第1页12