本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及一种糖化酶黑曲霉菌种制备、保藏及使用方法。
技术背景
众所周知，在生物工程领域，高产菌株制种和保藏不当的情况下，很容易倒致菌种的生产性状退化，产量大幅度降低，给企业造成巨大的经济损失。
传统的糖化酶制种工艺繁杂，每次制种都要从原始菌种作为出发菌进行活化、传代、复壮、筛选并制种，即每次制生产菌种都要从甘油管或试管斜面到淀粉平板（4-5天）再到察氏培养基（4-5天）再到半干体培养基（4-5天）再到摇瓶种（2-3天），传代次数多（4次）、操作步骤多（4步），制种周期长（14-18天）。
因此，传统的菌种制种工艺的菌种在不断的传代过程中很容易发生生产性状退化，这种现象不仅在传统诱变选育的菌种或在基因工程菌中都普遍存在，基因工程菌表现尤甚。
本发明从冻存的甘油管原种开始，进行菌丝球种子萌发扩培、菌丝体制做，菌丝球制做，然后通过甘油做保护剂制做满足一个月或一季生产所需的一定数量的冻存管，存放在-40℃的超低温冰箱或液氮中，使用时直接拿出并在无菌条件下将冻存管内的种子接种入灭菌后的三角瓶内的培养基中，上摇床菌丝球由致密的白色小菌球变成众多的白色大菌球即可到车间接种使用，菌种室只需一次制原种，够一个月或一季使用，生产种制种工艺由原来的4步简化为1步，即从甘油管到摇瓶种，时间由14-18天缩短到2-3天，使用极为方便。
该方法通过甘油管种子超低温（-40℃-196℃）保存代替试管斜面3-7℃保存，同时由于菌种保藏方法的改进省去了多次活化、复壮、筛选等步骤，制种和保藏工艺简单、操作方便、菌种生产性状稳定，经过连续在生产上使用上千批次未见退化现象，很好的解决了传统糖化酶黑曲霉菌种制种繁琐、易退化的技术缺陷。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供一种糖化酶黑曲霉菌种制备、保藏及使用方法，制种和保存工艺简单、操作方便且菌种生产性状稳定。本发明采用以下技术方案得以实现，包括原种扩培、菌丝体制备、菌丝菌球制备、冻存管制备、超低温保存、生产种制备（使用方法）等步骤。
一种糖化酶黑曲霉菌种制备、保藏及使用方法，其特征在于所用的制种培养基由以下组份组成：蛋白胨1-3%、糊精或饴糖11--13%、硫酸铵1-3%、消泡剂0.5%，ph值自然，定容250-300毫升。
所述的一种糖化酶黑曲霉菌种制备、保藏及使用方法，其特征在于所用的半干体培养基由以下组份组成：蔗糖3.2-3.5%、硝酸钠1-1.5%，磷酸氢二钾1.2-1.5%，硫酸镁0.06-0.08%，氯化钾0.06-0.08%，琼脂粉0.06%，ph值自然，定容100-150毫升。
所述的一种糖化酶黑曲霉菌种制备、保藏及使用方法，其特征在于通过以下几个步骤实现：
1）原种扩培：培养基为制种培养基，定容250-300毫升，ph值自然;将冻存管从超低温环境内取出，放置室温内解冻20-30分钟，然后在无菌条件下将含有甘油的菌液全部接种至1000mi三角瓶内灭过菌的培养基中，在33-35℃、摇床转速为300-400r/min条件下进行60-72小时扩培，种子由致密白色小菌球萌发成1-2mm的白色菌丝球，且数量增多作为种子成熟终点；
2）菌丝体制备：培养基为制种培养基，定容为种子发酵罐40-50%，将扩培的种子全部接入5-15l带搅拌的种子发酵罐中，转速为400-450r/min，在33-35℃下，通无菌风培养60-72小时，得到碎化菌丝体或者用发酵车间发酵良好、发酵36-48小时的菌丝体作为菌丝体来源；
3）菌丝球制备：将碎化的菌丝体在无菌条件下按培养基体积的0.1-3%接种量接种到一定数量的300-500mi三角瓶中灭过菌的半干体培养基中，在30-32℃下、摇床转速30-60r/min，培养60-72小时，形成致密白色菌丝球（直径在0.5-1mm）；
4）冻存管制备：将含有菌丝球的菌液通过灭过菌的移液管移入与已灭菌的甘油管中，菌液的体积与甘油的体积比≦1:1，优选值为1:1，将甘油管盖旋紧混合均匀即为甘油管种子；
5）超低温保存：将制备的一定数量的甘油管种子放入-40℃的超低冰箱或者液氮罐（-196℃）中保存；
6）生产种制备（使用方法）：从-40℃的超低冰箱或者液氮罐（-196℃）中取2-3支出冻存的甘油管，放置室温内解冻20-30分钟，将含有甘油的菌液全部接种入1000mi三角瓶中灭过菌的制种培养基中，在33-35℃，摇床转速300-400r/min的条件下培养时间60-72小时至菌丝球增大1-2mm白色菌丝球且数量比原来的增多，从2-3瓶中挑选出一瓶菌丝球为白色致密、大小均匀、菌丝球量大、无染菌的摇瓶种子作为生产发酵种子罐种子使用。
本发明通过一次批量制甘油管种，长周期使用（以月、季为单位），菌种室的日常工作只有制做摇瓶种，省去了传统的挑选、复壮、半干体种等繁琐步骤，大大简化了制种流程（由4步简化为1步），缩短了制种周期（由原来的14-18天缩短到2-3天），同时有效避免了反复传代造成的种子生产性状的退化，保证了发酵工厂的正常用种。
本发明的糖化酶黑曲霉菌种制备、保藏及使用方法，仅将培养基和培养工艺参数有针对性调整后，该制种流程在丝状真菌或高等真菌（如平菇、杏炮菇等）上具有普适性，即凡是能够产生菌丝球的微生物（丝状真菌、高等真菌），均可以运用该制种流程。
具体实施方式
实施例1
本发明采用以下技术方案得以实现，包括原种扩培、菌丝体制备、菌丝菌球制备、冻存管制备、超低温保存、生产种制备（使用方法）等步骤。
1、培养基配方如下：
1）制种培养基：蛋白胨1%、糊精11%、硫酸铵1%、消泡剂0.5%，ph值自然，定容250毫升。
2）半干体培养基：蔗糖3.2%、硝酸钠1%，磷酸氢二钾1.2%，硫酸镁0.06%，氯化钾0.06%，琼脂粉0.06%，ph值自然，定容100毫升。
2、步骤实现如下：
1）原种扩培：培养基为制种培养基，定容250毫升，ph值自然;将冻存管从超低温环境内取出，放置室温内解冻20分钟，然后在无菌条件下将含有甘油的菌液全部接种至1000mi三角瓶内灭过菌的培养基中，在33℃、摇床转速为300r/min条件下进行60小时扩培，种子由致密白色小菌球萌发成1-2mm的白色菌丝球，且数量增多作为种子成熟终点；
2）菌丝体制备：培养基为制种培养基，定容为种子发酵罐40%，将扩培的种子全部接入5l带搅拌的种子发酵罐中，转速为400r/min，在33℃下，通无菌风培养60小时，得到碎化菌丝体；
3）菌丝球制备：将碎化的菌丝体在无菌条件下按培养基体积的0.1%接种量接种到一定数量的300mi三角瓶中灭过菌的半干体培养基中，在30℃下、摇床转速30r/min，培养60小时，形成致密白色菌丝球（直径在0.5-1mm）；
4）冻存管制备：将含有菌丝球的菌液通过灭过菌的移液管移入与已灭菌的甘油管中，菌液的体积与甘油的体积比为1:1，将甘油管盖旋紧混合均匀即为甘油管种子；
5）超低温保存：将制备的一定数量的甘油管种子放入-40℃的超低冰箱中保存；
6）生产种制备（使用方法）：从-40℃的超低冰箱中取2支出冻存的甘油管，放置室温内解冻20分钟，将含有甘油的菌液全部接种入1000mi三角瓶中灭过菌的制种培养基中，在33℃，摇床转速300r/min的条件下培养时间60小时至菌丝球增大1-2mm白色菌丝球且数量比原来的增多，从2瓶中挑选出一瓶菌丝球为白色致密、大小均匀、菌丝球量大、无染菌的摇瓶种子作为生产发酵种子罐种子使用。
实施例2
本发明采用以下技术方案得以实现，包括原种扩培、菌丝体制备、菌丝菌球制备、冻存管制备、超低温保存、生产种制备（使用方法）等步骤。
1、培养基配方如下：
1）制种培养基：蛋白胨2%、糊精12%、硫酸铵2%、消泡剂0.5%，ph值自然，定容280毫升。
2）半干体培养基：蔗糖3.4%、硝酸钠1.2%，磷酸氢二钾1.4%，硫酸镁0.06%，氯化钾0.06%，琼脂粉0.06%，ph值自然，定容120毫升。
2、步骤实现如下：
1）原种扩培：培养基为制种培养基，定容280毫升，ph值自然;将冻存管从超低温环境内取出，放置室温内解冻25分钟，然后在无菌条件下将含有甘油的菌液全部接种至1000mi三角瓶内灭过菌的培养基中，在34℃、摇床转速为350r/min条件下进行65小时扩培，种子由致密白色小菌球萌发成1-2mm的白色菌丝球，且数量增多作为种子成熟终点；
2）菌丝体制备：培养基为制种培养基，定容为种子发酵罐45%，将扩培的种子全部接入10l带搅拌的种子发酵罐中，转速为420r/min，在34℃下，通无菌风培养65小时，得到碎化菌丝体；
3）菌丝球制备：将碎化的菌丝体在无菌条件下按培养基体积的0.2%接种量接种到一定数量的500mi三角瓶中灭过菌的半干体培养基中，在31℃下、摇床转速50r/min，培养65小时，形成致密白色菌丝球（直径在0.5-1mm）；
4）冻存管制备：将含有菌丝球的菌液通过灭过菌的移液管移入与已灭菌的甘油管中，菌液的体积与甘油的体积比为1:1.5，将甘油管盖旋紧混合均匀即为甘油管种子；
5）超低温保存：将制备的一定数量的甘油管种子放入液氮罐（-196℃）中保存；
6）生产种制备（使用方法）：从液氮罐（-196℃）中取3支出冻存的甘油管，放置室温内解冻25分钟，将含有甘油的菌液全部接种入1000mi三角瓶中灭过菌的制种培养基中，在34℃，摇床转速350r/min的条件下培养时间65小时至菌丝球增大1-2mm白色菌丝球且数量比原来的增多，从3瓶中挑选出一瓶菌丝球为白色致密、大小均匀、菌丝球量大、无染菌的摇瓶种子作为生产发酵种子罐种子使用。
实施例3
本发明采用以下技术方案得以实现，包括原种扩培、菌丝体制备、菌丝菌球制备、冻存管制备、超低温保存、生产种制备（使用方法）等步骤。
1、培养基配方如下：
1）制种培养基：蛋白胨3%、饴糖13%、硫酸铵3%、消泡剂0.5%，ph值自然，定容300毫升。
2）半干体培养基：蔗糖3.5%、硝酸钠1.5%，磷酸氢二钾1.5%，硫酸镁0.08%，氯化钾0.08%，琼脂粉0.06%，ph值自然，定容150毫升。
2、步骤实现如下：
1）原种扩培：培养基为制种培养基，定容300毫升，ph值自然;将冻存管从超低温环境内取出，放置室温内解冻30分钟，然后在无菌条件下将含有甘油的菌液全部接种至1000mi三角瓶内灭过菌的培养基中，在35℃、摇床转速为400r/min条件下进行72小时扩培，种子由致密白色小菌球萌发成1-2mm的白色菌丝球，且数量增多作为种子成熟终点；
2）菌丝体制备：培养基为制种培养基，定容为种子发酵罐50%，将扩培的种子全部接入15l带搅拌的种子发酵罐中，转速为450r/min，在35℃下，通无菌风培养72小时，得到碎化菌丝体；
3）菌丝球制备：将碎化的菌丝体在无菌条件下按培养基体积的3%接种量接种到一定数量的500mi三角瓶中灭过菌的半干体培养基中，在32℃下、摇床转速60r/min，培养72小时，形成致密白色菌丝球（直径在0.5-1mm）；
4）冻存管制备：将含有菌丝球的菌液通过灭过菌的移液管移入与已灭菌的甘油管中，菌液的体积与甘油的体积比为1:2，将甘油管盖旋紧混合均匀即为甘油管种子；
5）超低温保存：将制备的一定数量的甘油管种子放入-40℃的超低冰箱；
6）生产种制备（使用方法）：从-40℃的超低冰箱中取3支出冻存的甘油管，放置室温内解冻30分钟，将含有甘油的菌液全部接种入1000mi三角瓶中灭过菌的制种培养基中，在35℃，摇床转速400r/min的条件下培养时间72小时至菌丝球增大1-2mm白色菌丝球且数量比原来的增多，从2-3瓶中挑选出一瓶菌丝球为白色致密、大小均匀、菌丝球量大、无染菌的摇瓶种子作为生产发酵种子罐种子使用。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。