醛酮还原酶BcAKR及其突变体和应用的制作方法

文档序号：18747386发布日期：2019-09-24 20:20阅读：496来源：国知局

本发明涉及生物技术领域，涉及醛酮还原酶bcakr及其突变体和应用，所述突变体是由野生型腊样芽孢杆菌醛酮还原酶(bacilluscereusaldo-ketoreductase,bcakr)出发经过突变得到的，本发明还涉及所述的醛酮还原酶bcakr及其突变体的制备方法。还涉及所述的醛酮还原酶bcakr及其突变体通过催化邻氯苯甲酰甲酸甲酯的还原，得到具有光学活性的s或r构型仲醇化合物的方法。

背景技术：

氯吡格雷是一种二磷酸腺苷(adp)受体阻滞剂，可与血小板膜表面adp受体结合，使纤维蛋白原无法与糖蛋白gpⅱb/ⅲa受体结合，从而抑制血小板凝集，主要用于预防和治疗因血小板高聚集引起的心、脑及其他动脉循环障碍疾病，在国内具有广泛市场。(r)-邻氯扁桃酸甲酯(分子式为o-cl-c6h4ch(oh)cooch3，分子量为200.62，cas号：32345-59-8)是合成氯吡格雷的重要手性中间体，可由相应的α-酮酸脂不对称还原得到。α-酮酸酯类化合物是一种结构简单而又特殊的化合物，具有两个羰基，还原得到的光学醇类化合物作为重要的合成中间体在化工与医药领域得到广泛的应用。光学活性手性醇的合成有化学法和生物法两种。与化学方法相比，生物法具有反应条件温和、转化率高、对映体选择性高等多种优点，尤其生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇合成中的应用越来越受到重视。

因此针对上述的化合物及其类似化合物，寻找一种羰基还原酶能够催化高底物浓度下的高立体选择性不对称还原，不添加或者添加极少量辅酶，经济易得，无疑具有极其重大的意义。已有文献报道利用醛酮还原酶进行高底物浓度催化的实例，如利用属醛酮还原酶的ytbe生成氯吡格雷中间体，底物浓度达500g/l(tetrahedronlett2012,53(35):4715-4717)。

醛酮还原酶(aldoketoreductases，akrs)是一类依赖于nad(p)⁺的氧化还原酶，包含了超过190个成员。其结构由(α/β)8桶状结构及loop区构成，活性中心由loop4、loop7及loopc组成，催化活性位点包括tyr、asp、lys以及his。醛酮还原酶能够催化底物的类型包含多种，例如糖醛、类固醇、前列腺素、羰基化合物及酮酸酯类化合物等。来源于不同菌属中的醛酮还原酶可催化不同类型的底物得到相应的具有手性中心的氧化还原产物，一些野生状态下或经过蛋白质修饰后的的醛酮还原酶在手性药物中间体合成中得到了合理应用。目前已有10余个来源于不同菌属的醛酮还原酶被表征，因此，不论在学术领域还是在实际应用当中，醛酮还原酶都有着潜在的研究价值。

然而目前已有文献报道的具有高活性与立体选择性的醛酮还原酶仍占少数。最近已有通过蛋白质工程将自然界存在的醛酮还原酶进行改造来提高醛酮还原酶的催化性能，例如可通过对醛酮还原酶的loop区进行改造来提高醛酮还原酶的催化性能，但成功例子仍较少。因此发掘并且改造醛酮还原酶以提高其催化性能的需求较为迫切。

本实验室通过基因挖掘获取的来源于蜡样芽孢杆菌的醛酮还原酶bcakr，通过理性设计及蛋白质定向进化提高该酶的活性及立体选择性，实现光学纯的手性醇的生物催化制备，具有十分重要的应用价值。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种醛酮还原酶bcakr，还提供了通过对该醛酮还原酶进行突变得到的还原酶突变体，所述的醛酮还原酶bcakr和突变体可以提高其对α-酮酸酯类化合物的对映选择性及活性，使通过醛酮还原酶还原得到对应手性醇路线高效、可行。

本发明提供了醛酮还原酶bcakr，通过测序确定为野生型腊样芽孢杆菌醛酮还原酶，其序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了由野生型腊样芽孢杆菌醛酮还原酶(bcakr)基因(seqidno.1)通过突变得到具有改良性质的醛酮还原酶的突变体，该酶在大肠杆菌工程菌中表达，该醛酮还原酶及其突变体，能够将α-酮酸酯类化合物还原得到具有光学活性的s或r构型仲醇。

进一步地，将醛酮还原酶基因连接到表达质粒中，得重组醛酮还原酶。所述的表达质粒为：pet-28b-mbp。

所述的重组醛酮还原酶包括与seqidno.2至少75％同一性的氨基酸序列。

更进一步地，本发明提供了醛酮还原酶bcakr的突变体，所述的突变体是对重组醛酮还原酶(即seqidno.2)的24位或112位突变，或24位和116位同时突变获得。

本发明所述的醛酮还原酶bcakr的突变体对应于seqidno.2的24位残基为较小的氨基酸残基，116位残基为较大氨基酸残基，这些氨基酸对于改善醛酮还原酶的活性及对映体选择性至关重要。

本发明中涉及的较小的氨基酸为ala、ser、thr、val、ile与leu，优选为丝氨酸(ser)；涉及的较大氨基酸残基为pro、phe、try、leu，优选为苯丙氨酸(phe)。

本发明的一些实施方案中，含有突变的醛酮还原酶突变体针对α-酮酸酯类化合物展现出更高的活性及立体选择性，这些突变体包含一个或两个突变，即24位或116位突变，或24位和116位同时突变，氨基酸序列24位突变为ser；氨基酸序列116位突变为phe。

本发明所述的醛酮还原酶突变体，其氨基酸序列优选如seqidno.4，6，8所示。

本发明的实施方式包括编码所述醛酮还原酶突变体的核酸，与编码本发明所述bcakr突变体的核酸序列具有至少75％的序列同一性。

所述的能够编码突变体的核酸，序列如seqidno.3，5，7所示。

本发明的相关实施方式还包括包含这些核酸的载体及包含该类载体的宿主细胞。

本发明还提供了所述的醛酮还原酶及其突变体在还原α-酮酸酯类化合物中的应用。本发明中所述的野生型醛酮还原酶bcakr与其突变体，或者是含有野生型或突变体酶的细胞可以作为催化剂催化不对称还原α-酮酸酯类化合物获取相应的光学纯手性产物。

所述的α-酮酸酯类化合物较佳的结构如(ii)所示：

其中r1为c1-c4烷基，苯基或者带有取代基的苯基，苯基的取代基为卤素；

r2为c1-c4烷基；

优选结构如1a所述：

本发明的一个实施方式提供了不对称还原α-酮酸酯类化合物的方法：

在ph5-7的磷酸盐缓冲液溶液中，在葡萄糖脱氢酶，葡萄糖和nadp⁺存在下，在醛酮还原酶突变体的催化下，对α-酮酸酯类化合物进行还原，生成光学活性手性仲醇。

醛酮还原酶突变体用量为0.02-40g/l，葡萄糖脱氢酶用量为0.01-5g/l，葡萄糖用量为6-200g/l，nadp⁺用量为0.1-0.5mmol，α-酮酸酯类化合物的底物浓度为3-100g/l，所述缓冲液为ph5-7的磷酸盐缓冲液，反应温度是30-40℃。该醛酮还原酶或其突变体可以多种可行的方式如细胞、粗酶粉、酶溶液、固定化酶等多种形式存在。

本发明的有益技术效果：通过对腊样芽孢杆菌醛酮还原酶(bcakr)进行突变，所得到的醛酮还原酶突变体与天然存在的酮还原酶野生型相比，反转与提高了其对α-酮酸酯类化合物的活性与对映选择性。

附图说明

图1为野生型醛酮还原酶bcakr与其突变体酶的基因、含有上述基因的重组表达载体的构建。

图2为野生型醛酮还原酶bcakr与其突变体酶催化底物1a还原的hplc检测结果；

sub1：底物1a对照；rac-1：产物消旋体对照；野生型(seqidno.2)hplc检测结果；野生型f24s突变体(seqidno.4)hplc检测结果；野生型f24s-w116f双位点突变体(seqidno.8)hplc检测结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案，描述本发明的醛酮还原酶突变体，以及利用该酶还原α-酮酸酯类化合物。除特别指明，本发明中所用的实验方案均为本领域技术人员所公知的方法。此外，实施例应理解为说明性的，而不是限制本发明。

某些术语的定义。

不对称还原是还原前手性化合物得到光学纯的相应的还原产物的一种方法，在本发明中指醛酮还原酶催化α-酮酸酯类化合物选择性地得到s或r构型的相应的醇。

对映体过量定义为对映体混合物中一个异构体a比另一个异构体b多出来的量占总量的百分数，缩写为ee，公式为(a-b)/(a+b)*100％，对映体过量值用于表示一种手性化合物的光学纯度。ee值越高，光学纯度也越高。

20种氨基酸缩写如下

aspd天冬氨酸ilei异亮氨酸

thrt苏氨酸leul亮氨酸

sers丝氨酸tyry酪氨酸

glue谷氨酸phef苯丙氨酸

prop脯氨酸hish组氨酸

glyg甘氨酸lysk赖氨酸

alaa丙氨酸argr精氨酸

cysc半胱氨酸trpw色氨酸

valv缬氨酸glnq谷氨酰胺

metm甲硫氨酸asnn天冬酰胺

氨基酸分类，根据氨基酸侧链基团的空间位阻分为较大及较小的氨基酸，本发明中涉及的本发明中涉及的较小的氨基酸为ala、ser、thr、val、ile与leu，较大氨基酸残基为pro、phe、try、leu。

实施例涉及的培养基配方。

lb液体培养基：0.5％酵母提取物、1％蛋白质胨与1％氯化钠(如配置固体培养基，在灭菌前加入1.5％琼脂)，115℃高压灭菌30min。

实施例1蜡样芽孢杆菌基因组dna的提取

蜡样芽孢杆菌用lb液体培养过夜后，发酵液用1ml离心管3000r/min离心5min，弃上清收集菌体，可重复几次以得到足够量的细胞；b)按细菌基因组dna提取试剂盒操作说明提取蜡样芽孢杆菌基因组。

实施例2野生型bcakr基因的克隆

以实施例1获得的蜡样芽孢杆菌基因组dna为模板进行pcr反应，反应体系如下：

扩增程序：94℃：10min，(94℃：30s，45℃：30s，72℃：30s)30个循环，72℃，10min。

引物1：bcakr-ecori-f：ccggaattcgatgaaaaacttacaaagt；

引物2：bcakr-xhoi-r：ccgctcgaggaaatcgaagttatcagg；

限制性内切酶酶切位点用下划线标出；

pcr扩增得到的dna片段用胶回收试剂盒纯化。含有pet28bmbp质粒的e.colidh5α用lb液体培养基37℃，220r/min培养过夜，质粒提取采用参照tianprepminiplasmidkit。

目的片段与质粒pet28bmbp质粒限双酶切，酶切体系如下：

酶切产物用胶回收试剂盒回收片段，并通过t4连接酶连接。

实施例3e.colirosetta(de3)感受态细胞的制备及转化

a)从种子培养基中取0.4ml接种于20mllb液体培养基中培养3h；b)3000r/min，5min分两次富集2ml菌体于1.5mlep管中，弃上清；c)加入100μl冰冷tss溶液，重新悬浮菌体，冰浴30min；d)加入20μl连接液轻轻旋转混匀，冰浴30min；e)42℃热休克60s，冰浴2min，加入600μllb液体培养基。37℃培养，150r/min振荡培养1h；f)分别取150μl涂布于lb抗性平板。

实施例4突变体的构建

突变库的构建是利用突变引物和侧翼引物，重叠延伸pcr进行的。(设计的突变引物如下：)

pcr扩增条件：94℃：10min，(94℃：30s，45℃：30s，72℃：30s)35个循环，72℃：10min。所得基因片段经过纯化，按如下pcr扩增

按实施例2中所述pcr获得目的片段并连接到pet28bmbp载体上，按实施例3所述转化到e.colirosetta(de3)中。分别得到了野生型醛酮还原酶bcakr与其突变体。

实施例5突变体表达

a)取单菌落接种于4ml卡那霉素抗性lb液体培养基中，37℃，200rpm培养6h后得到种子液；b)取20μl种子液接种于20ml卡那霉素抗性lb液体培养基中，37℃，200rpm培养至培养液od600达到0.8-1.0时加入终浓度0.5mmiptg，并将温度降至20℃诱导表达20h；c)4000rpm×15min离心培养液收集菌体，生理盐水洗涤两次后用0.1mph6.0磷酸钠缓冲液重选菌体，加入终浓度1mg/ml溶菌酶，30℃，200rpm破碎1h后，4℃下，10000rpm离心收集上清进行筛选。

实施例6葡萄糖脱氢酶表达

将含有pet22b-gdh质粒的e.colirosetta(de3)按照实施例5所述表达获得葡萄糖脱氢酶。

实施例7粗酶液催化还原

反应体系：如实施例5、6中所述的上清各450μl混匀，终浓度0.3mmnadp⁺，8mg葡萄糖，4mg底物(100μl甲醇助溶)，30℃反应6h；用等体积乙酸乙酯萃取三次。

实施例8高效液相分析底物和产物

本实施例中涉及的典型底物如下所示：

检测底物1a及产物的条件为：色谱柱：ad-h，流动相：正己烷：异丙醇＝90:10，流速：0.8ml/min，波长：254nm，柱温：25℃，检测器：uv检测器。

实施例9野生型(seqidno.2)及f24s突变体(seqidno.4)对底物1a选择性测定结果

a)转化率[％]；b)还原产物醇对映体过量值(ee％)；c)还原产物醇的绝对构型

seqidno.4催化底物1a液相图见图2。

实施例10野生型(seqidno.2)及f24s-w116f双位点突变体(seqidno.8)对底物1a的选择性测定结果

a)转化率[％]；b)还原产物醇对映体过量值(ee％)；c)还原产物醇的绝对构型

seqidno.8催化底物1a液相图见图2。

序列表

<110>沈阳药科大学

<120>醛酮还原酶bcakr及其突变体和应用

<141>2019-01-08

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>837

<212>dna

<213>蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)

<400>1

atgaaaaacttacaaagtaaaacagtattaaataatggtgtagaaatgccttggttcggt60

ttaggtgtatttaaagtagaagaaggaccagaacttgtagaagctgtaaaatcagcgatt120

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<210>2

<211>279

<212>prt

<213>蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)

<400>2

metlysasnleuglnserlysthrvalleuasnasnglyvalglumet

151015

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275

<210>3

<211>837

<212>dna

<213>蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)

<400>3

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