漆酶TvLac及其编码基因和应用的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及漆酶tvlac及其编码基因和应用。

背景技术：

真菌毒素是真菌次级代谢产物，对家畜、家禽和人类的健康有害。常见的真菌毒素包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)、桔霉素、赭曲霉毒素、伏马菌素、展青霉素和单端孢真菌毒素，可以分为具环状结构和不具环状结构的两类毒素。大多数真菌毒素，如黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，属于具环状结构的亚组中，通常通过真菌聚酮途径进行合成。例如，黄曲霉毒素(aflatoxin)b1由黄曲霉(aspergillusflavus)产生，具有一个核心的香豆素环和两侧的五元碳环和两个并列的二氢呋喃环，其是很强的肝脏致癌物。此外，玉米赤霉烯酮的结构是间二羟基苯甲酸酚内酯。

物理吸附(或灭活)以及生物转化是将食物和饲料中的真菌毒素脱毒的两种主要方式。除此之外，使用微生物，特别是通过微生物产生的酶，进行真菌毒素的脱毒是一种新兴的脱毒手段。现有酶法霉菌毒素降解技术中所用的泛解酸内酯水解酶、以及一些尚不能分类的酶可通过氧化或水解机理降解真菌毒素，但是均只能特异性地降解单一种类毒素，在实际应用中由于成本高等缺点而受到极大限制。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种漆酶tvlac。

本发明的再一目的在于提供上述漆酶tvlac的编码基因。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供上述漆酶tvlac的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述漆酶tvlac的应用。

本发明的再一目的在于提供含有上述漆酶tvlac的真菌毒素降解剂。

本发明的漆酶tvlac，其氨基酸序列如seqidno.1所示：

mgkfhsfvnvvalslslsgrvfgaigpvtdltisnadvtpdgitraavlaggvfpgplitgnkgdefqinvidnltnetmlksttihwhgifqagtnwadgaafvnqcpiatgnsflydftvpdqagtfwyhshlstqycdglrgplvvydpddanaslydvdddttvitladwyhtaaklgpafpagpdsvlinglgrfsgdgggatnltvitvtqgkryrfrlvsiscdpnftfsidghnmtiievggvnhealdvdsiqifagqrysfilnanqsidnywiraipntgttdttggvnsailrydtaeeiepttnattsvipltetdlvpldnpaapgdpqvggvdlamsldfsfngsnffinnetfvpptvpvllqilsgaqdaasllpngsvytlpsnstieisfpiittdgalnapgaphpfhlhghtfsvvrsagsstfnyanpvrrdtvstgnsgdnvtirfttdnpgpwflhchidfhldagfaivfaedtadtasanpvptawsdlcptydaldssdl

其中，该酶包括527个氨基酸，n端23个氨基酸为其信号肽序列，信号肽序列如seqidno：2所示：

mgkfhsfvnvvalslslsgrvfg

成熟的漆酶tvlac的理论分子量为53.7kda，其氨基酸序列如seqidno.3所示：

aigpvtdltisnadvtpdgitraavlaggvfpgplitgnkgdefqinvidnltnetmlksttihwhgifqagtnwadgaafvnqcpiatgnsflydftvpdqagtfwyhshlstqycdglrgplvvydpddanaslydvdddttvitladwyhtaaklgpafpagpdsvlinglgrfsgdgggatnltvitvtqgkryrfrlvsiscdpnftfsidghnmtiievggvnhealdvdsiqifagqrysfilnanqsidnywiraipntgttdttggvnsailrydtaeeiepttnattsvipltetdlvpldnpaapgdpqvggvdlamsldfsfngsnffinnetfvpptvpvllqilsgaqdaasllpngsvytlpsnstieisfpiittdgalnapgaphpfhlhghtfsvvrsagsstfnyanpvrrdtvstgnsgdnvtirfttdnpgpwflhchidfhldagfaivfaedtadtasanpvptawsdlcptydaldssdl

本发明还提供了编码上述漆酶tvlac的基因序列，其基因组序列如seqidno.4所示：

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漆酶tvlac编码基因序列全长1584bp。其中，信号肽的碱基序列如seqidno.5所示：

atgggcaagtttcactcttttgtgaacgtcgtcgcccttagtctttctttgagcggtcgtgtgttcggc

成熟的漆酶tvlac的cdna(去信号肽)序列如seqidno.6所示：

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本发明还提供了包含上述漆酶tvlac的重组载体，优选为ppic9-tvlac。将本发明的漆酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的漆酶tvlac插入到质粒ppic9上的ecori-noti限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于aox启动子的下游并受其调控，得到重组毕赤酵母表达质粒ppic9-tvlac。

本发明还提供了包含上述漆酶tvlac的重组菌株，优选为重组毕赤酵母菌株gs115/tvlac。

本发明还提供了一种制备漆酶tvlac的方法，包括以下步骤：

(1)用包含编码漆酶tvlac基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养所述重组菌株，诱导漆酶tvlac表达；

(3)利用阴离子交换层析获得纯化后的漆酶tvlac。

本发明还提供了上述漆酶tvlac的应用，尤其在霉菌毒素脱毒方面，其能够有效降解黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮。

本发明还提供一种真菌毒素降解剂，其包括漆酶tvlac和介体，介体为丁香酸甲酯或其他可辅助漆酶降解真菌毒素的化合物，如合成介体(2,2-联氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(abts)、紫脲酸(vio)等)、天然介体(丁香醛、乙酰丁香酮、对香豆酸等)或多金属氧酸盐。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种漆酶tvlac，其对黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮有较好的降解能力。

附图说明

图1显示重组漆酶tvlac对黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮的降解率；

图2显示重组漆酶tvlac降解黄曲霉毒素b1的hplc分析结果；

图3显示重组漆酶tvlac降解玉米赤霉烯酮的hplc分析结果。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、基因及载体：毕赤酵母表达载体ppic9及菌株毕赤酵母gs115；

2、酶类及其它生化试剂：内切酶、重组酶、黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、丁香酸甲酯；色谱纯乙腈、三氟乙酸、tris；

3、培养基：毕赤酵母培养基ypd(2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母提取物)，bmgy(1％甘油，2％蛋白胨，1％酵母提取物，10％ynb，1‰biotin)，bmmy(0.5％甲醇，2％蛋白胨，1％酵母提取物，10％ynb，1‰biotin)。

实施例1漆酶tvlac编码基因的克隆

漆酶tvlac基因来源于变色栓菌(trametesversicolor)，设计特异性引物，并进行pcr扩增，引物序列如下：

tvlac-f：5'-gctgaagcttacgtagaattcgccattgggcccgtcaccga-3'；

tvlac-r:5'-aaggcgaattaattcgcggccgcgaggtcggacgagtcca-3'。

pcr产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化，经分析其核苷酸序列如seqidno.4所示。

利用限制性内切酶ecori、noti对pcr扩增基因所得产物及ppic9载体进行双酶切，酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化。利用t4dna连接酶将酶切后的载体和基因片段进行连接并转化毕赤酵母克隆宿主，获得重组毕赤酵母表达质粒ppic9-tvlac。

实施例2重组漆酶tvlac的制备

将获得的含有漆酶tvlac的重组毕赤酵母表达质粒ppic9-tvlac转化毕赤酵母gs115，获得重组毕赤酵母gs115/tvlac。

取含有目的基因tvlac的毕赤酵母gs115工程菌株，接种于50mlypd培养液中，30℃，220rpm振荡培养48h后，按2％比例转接于300mlbmgy培养基中，30℃220rpm振荡培养48h，更换bmmy培养基(含有0.2mmcuso4)，利用甲醇诱导外源漆酶蛋白表达。每24h补充0.5％甲醇，共诱导72h。12000rpm离心去除菌体，利用膜包将上清浓缩至5ml，置于10mm磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(ph6.5)中透析过夜。利用阴离子柱层析进行纯化，收集电泳纯的洗脱组分并透析至10mm磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(ph6.5)保存。

实施例3tvlac-丁香酸甲酯介体体系降解黄曲霉毒素b1

将黄曲霉毒素b1溶解到二甲基亚砜中配制成50mg/l的母液，按如下反应体系：50mmtris-hcl(ph7.0)，20μl黄曲霉毒素b1溶液(50mg/l)，20μl丁香酸甲酯(10mm)，20μltvlac(300u/l)。以未加入漆酶tvlac的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，10h后加入三倍体积的乙腈终止反应，采用高效液相色谱(hplc)分析黄曲霉毒素b1的降解率。液相色谱为岛津nexerauhplc高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为zorbaxsb-c18(4.6×250mm,5μm)，流动相a(0.06％tfa的水)，流动相b(0.05％tfa的乙腈)；梯度洗脱条件0％b洗脱4分钟，0％-100％b洗脱15分钟，100％b洗脱6分钟；检测波长365nm。

结果如图1、图2所示，部分黄曲霉毒素b1已被降解，降解率为69.0％。

实施例4tvlac-丁香酸甲酯介体体系降解玉米赤霉烯酮

将玉米赤霉烯酮溶解到二甲基亚砜中配制成50mg/l的母液，按如下反应体系：50mmtris-hcl(ph7.0)，20μl黄曲霉毒素b1溶液(50mg/l)，20μl丁香酸甲酯(10mm)，20μltvlac(300u/l)。以未加入漆酶tvlac的体系作为对照，反应体系设3个重复。反应在30℃下进行，10h后加入三倍体积的乙腈终止反应，采用高效液相色谱(hplc)分析玉米赤霉烯酮的降解率。液相色谱为岛津nexerauhplc高效液相色谱分析系统，色谱分离柱为zorbaxsb-c18(4.6×250mm,5μm)，流动相a(0.06％tfa的水)，流动相b(0.05％tfa的乙腈)；梯度洗脱条件0％b洗脱4分钟，0％-100％b洗脱15分钟，100％b洗脱6分钟；检测波长316nm。

结果如图1、图3所示，部分玉米赤霉烯酮已被降解，降解率为100％。

本发明中漆酶tvlac对黄曲霉毒素b1和玉米赤霉烯酮的降解率分别达到69.0％和100％，该降解率均高于现有漆酶的数据，如scc0152来源的漆酶对黄曲霉毒素b1的降解率约为52.4％，t.versicolor来源的漆酶对玉米赤霉烯酮的降解率为81.7％。

序列表

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>漆酶tvlac及其编码基因和应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>527

<212>prt

<213>变色栓菌(trametesversicolor)

<400>1

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<400>6

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