一种悬浮细胞KBM5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法与流程

本发明属于细胞生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种悬浮细胞kbm5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法。

背景技术：

针对悬浮细胞的基因编辑目前已有采用crispr/cas9技术进行编辑的研究，但大多为对k562、jurkatt细胞的基因进行编辑，而且具体过程多种多样。其中单就细胞转染方法上有利用脂质体、病毒感染和电穿孔转染等多种方法。在细胞抗性筛选上也有利用g418或者嘌呤霉素的差异，此外筛选浓度与时间也各有不同。另外，在在克隆化方法上也存在半固体培养法、流式细胞分选法及有限稀释克隆法多种选择。

crispr/cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源dna。crispr/cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒dna的片段整合到crispr中，并利用相应的crisprrnas(crrnas)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。crispr/cas9系统的工作原理是crrna(crispr-derivedrna)通过碱基配对与tracrrna(trans-activatingrna)结合形成tracrrna/crrna复合物，此复合物引导核酸酶cas9蛋白再与crrna配对的序列靶位点剪切双链dna。而通过人工设计这两种rna，可以改造形成具有引导作用的sgrna(single-guiderna)，足以引导cas9对dna的定点切割。

现有的细胞系构建方法包括利用电穿孔结合流式细胞分选技术构建细胞系，采用电转、嘌呤霉素筛选与有限稀释法构建细胞系，以及通过病毒感染、流式分选构建悬浮细胞基因编辑稳定细胞系。而针对kbm5细胞的研究目前多是采用sirna干扰技术，有研究利用cripsr/cas9技术通过电穿孔转染结合流式细胞分选法对其进行基因编辑筛选点突变细胞，但效率仅有1％左右。针对kbm5细胞的基因编辑构建稳定细胞系的研究很少，且普遍存在安全性、免疫排斥和阳性克隆效率低等问题。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种悬浮细胞kbm5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法，能有效解决现有技术存在的安全性、免疫排斥和阳性克隆效率低等问题，具有转染效率高、操作简便、成本低和基因敲除稳定系的效率高等优点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种悬浮细胞kbm5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建含靶向kbm5细胞基因的sgrna的重组表达载体；

(2)培养悬浮细胞kbm5；

(3)采用电穿孔瞬时转染法将步骤(1)获得的重组表达载体和phcas9质粒共转染步骤(2)获得的kbm5细胞；

(4)筛选阳性细胞；

(5)筛选单克隆细胞；

(6)对单克隆细胞进行鉴定；

(7)阳性单克隆细胞扩大培养及冻存。

优选地，所述步骤(1)中靶向kbm5细胞基因的sgrna包括如seqidno.1所示的正义链和seqidno.2所示的反义链，所述载体为pu6表达质粒。

优选地，所述步骤(1)详细步骤如下：a、所述sgrna合成oligo；b、步骤a合成的oligo退火；u6进行bbsi酶切线性化，条件为：37℃反应2h，切胶回收线性化片段；c、退火的oligo与线性化u6酶切产物连接过夜，连接产物转化dh5α感受态细胞，涂布于含卡那霉素的lb平板生长，挑取单菌落于1mllb液体培养基中(含卡那霉素)，37℃培养2～3h，采用sp6引物(序列如seqidno.3所示)和所述sgrna的正义链(序列如seqidno.1所示)进行菌落pcr；菌落pcr为阳性的单克隆菌进行测序鉴定，测序引物为sp6，序列正确者进行扩大培养，提取质粒，即得到含所述sgrna的重组表达载体，本申请记载为pu6-pkm2-sgrna表达质粒。

seqidno.3：5’-atttaggtgacactatag-3’；

优选地，所述步骤(1)中还包括对所述重组表达载体的切割有效性进行鉴定。

优选地，对所述重组表达载体的切割有效性进行鉴定的方法为：将pu6-pkm2-sgrna表达质粒与phcas9质粒共转染293t细胞，72h后提取基因组进行靶位点扩增，pcr产物进行t7ei酶切鉴定。

优选地，所述步骤(3)中电穿孔瞬时转染法包括以下步骤：

a、培养kbm5细胞，使转染时细胞密度达到70-90％；

b、收集步骤a获得的kbm5细胞，离心弃上清，重悬细胞，取1.8×10⁶个细胞，离心弃上清；

c、分别取4.5ug含靶向kbm5细胞基因的sgrna的表达质粒和phcas9质粒，得到质粒悬液，用pbs调整质粒悬液体积至90ul；

d、用步骤c获得的质粒悬液重悬步骤b获得的细胞沉淀，混匀；

e、在电转杯中加入3mlbuffere，调节电转参数，将步骤d获得的质粒与细胞混合液进行电转；

f、电转枪插上配套的10μl的电转枪头吸取步骤e获得的电转液，不能有气泡，将电转枪插入电转杯中，按下按钮通电；

g、将步骤f获得的电击液放入培养箱中培养，再次吸取10μl取步骤e获得的电转液进行步骤f所述的电击操作，获得的电击液放入对应培养孔中培养，直至步骤e中电转液全部电击完成，混匀电击液，置于培养箱中培养。

优选地，所述步骤e中的电转参数为：电压1200～1350v，脉冲时间20～30ms，脉冲次数1～3次。

优选地，所述步骤(4)中使用g418进行阳性克隆筛选。

优选地，所述步骤(5)中使用有限稀释法进行单细胞克隆筛选。

优选地，所述有限稀释法进行单细胞克隆筛选包括以下步骤：

a、分别收集经g418筛选后的kbm5细胞，低速离心，弃上清，重悬细胞，并将细胞浓度调整为10⁵cells/ml，混匀；

b、将步骤a获得的细胞进行10倍稀释，调整细胞密度为10⁴cells/ml，然后再进行10倍稀释，调整细胞密度为10³cells/ml；

c、分别取步骤b获得的细胞悬液100μl，置于96孔培养板第一列孔中，使各个孔中的细胞数为100个，分别补加100μl的完全培养基，混匀，从第一列吸取100μl至第二列的孔中，以此类推，以列为单位进行稀释，最终稀释至每一列孔的细胞约为1个，最后每列孔再分别补加100μl完全培养基；

d、将步骤c获得的培养板放于培养箱内，用倒置显微镜观察克隆的生长情况，留下只有一个细胞克隆生长的孔，即为所述单细胞克隆。

本发明还提供了一种靶向kbm5细胞基因的sgrna，所述sgrna包括如seqidno.1所示的正义链和seqidno.2所示的反义链。

seqidno.1：5’-caccatttgaggaactccgccgcc-3’；

seqidno.2：5’-aaacggcggcggagttcctcaaat-3’。

本发明还提供了所述的sgrna在构建悬浮细胞kbm5高效基因编辑稳定细胞系中的用途。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明通过优化的电转染方案可使转染效率高于50％，能有效解决悬浮细胞的脂质体转染效率低、病毒转染有致突变性等问题，且具有操作简便、成本低和基因敲除稳定系的效率高等优点；(2)本发明提供的电穿孔瞬时转染方案是发明人经过大量的探索和优化得出的，特别是转染参数的优化，使得本发明转染效率高达50％以上；(3)本发明提供的有限稀释法进行单细胞克隆筛选方案是发明人经过大量研究后得到的，能够在低成本条件下有效地进行单细胞克隆筛选；(4)本申请发明人付出通过大量创造性劳动后发现，本发明转染方案中重组表达质粒和phcas9质粒与kbm5细胞的比例可以有效提高基因编辑效率，使构建及筛选的悬浮细胞基因敲除稳定系的效率达60％以上。

附图说明

图1为pu6-pkm2-sgrna表达质粒的切割有效性鉴定结果，其中，m代表marker；1代表pu6-pkm2-sgrna表达质粒与phcas9质粒共转染的293t细胞基因组酶切结果；2代表正常未转染质粒的293t细胞基因组酶切结果。

图2为kbm5细胞转染质粒后gfp荧光图片。

图3为部分单克隆细胞测序结果，其中，a代表wt单峰；b代表含wt套峰；c代表ko单峰；d代表多种ko峰。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

实施例1

本发明一种悬浮细胞kbm5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法的一种实施例，包括以下步骤：

(1)构建含靶向悬浮细胞kbm5pkm2基因的sgrna的重组表达载体，所述sgrna包括如seqidno.1所示的正义链和seqidno.2所示的反义链：

a、所述sgrna合成oligo；

b、步骤a合成的oligo退火；u6进行bbsi酶切线性化，条件为：37℃反应2h，切胶回收线性化片段；

c、退火的oligo与线性化u6酶切产物连接过夜，连接产物转化dh5α感受态细胞，涂布于含卡那霉素的lb平板生长，挑取单菌落于1mllb液体培养基中(含卡那霉素)，37℃培养2～3h，采用sp6引物和所述sgrna的正义链(序列如seqidno.1所示)进行菌落pcr；菌落pcr为阳性的单克隆菌进行测序鉴定，测序引物为sp6，序列正确者进行扩大培养，提取质粒，即得到含所述sgrna的重组表达载体，本申请记载为pu6-pkm2-sgrna表达质粒；

d、对pu6-pkm2-sgrna表达质粒的切割有效性进行鉴定：将pu6-pkm2-sgrna表达质粒与phcas9质粒共转染293t细胞，72h后提取基因组进行靶位点扩增，pcr产物进行t7ei酶切鉴定：

本实施例采用genjet^tm中方案1将pegfp-n2以及上述构建成功的crispr/cas系统质粒分别转染至hek293t细胞，通过荧光倒置显微镜观察gfp表达强度，分析转染效率，并提取细胞基因组进行sgrna的功能性验证。具体操作如下：细胞铺板；转染293t细胞；转染效率观察；t7eⅰ酶切鉴定分析。

1)利用genjet^tm中方案1将pegfp-n2质粒转染至hek293t细胞，转染操作按照genjet^tm中方案1使用说明书进行：

a、在24孔培养板的一个孔中进行293t细胞培养，至其汇合度达到70-80％时进行转染，转染前30-60min分别换上0.5ml新鲜的完全培养基，放进培养箱中预热；

b、在25μl无血清(fbs)的dmem中加入0.5μg的pegfp-n2质粒dna,轻轻吹打混匀；

c、分别在25μl无血清(fbs)的dmem中加入1.5μlgenjet^tm试剂，轻轻吹打混匀；

d、把稀释后的genjet^tm试剂立即加入到上述质粒dna悬液中，轻轻吹打混匀，并于室温孵育约15min以形成genjet^tm/dna复合物，注意不要孵育超过30min；

e、将50μl的genjet^tm/dna复合物悬液对应加入预热好的细胞培养基中，轻轻晃动培养板以混匀；

f、培养箱中培养12-18h后使用完全培养基进行换液，24h后用荧光倒置显微镜观察细胞并估计转染效率，结果显示转染效率超过90％。。

2)将pu6-pkm2-sgrna表达质粒与phcas9质粒共转染293t细胞，具体操作同步骤1)，各质粒的添加量如表1所示。

表1各质粒dna的添加量

3)提取基因组dna：转染48h后，用0.25％胰酶将细胞消化下来，分别收集至相应的1.5ml离心管中，10000rpm离心5min，弃去上清，收集细胞沉淀，采用takara公司minibestuniversalrnaextractionkit基因组dna提取试剂盒提取基因组，具体步骤如下：

a、用200μlddh2o吹打使重新悬浮细胞，将180μlbuffergb、20μlproteinasek和10μlrnasea(10mg/ml)混合液加至上述细胞悬液中，充分吹打混匀后将1.5ml离心管置于56℃恒温金属浴中裂解10min；

b、加入200μl无水乙醇，充分吹打混匀；

c、将spincolumn结合柱安置于收集管上，转移上述混合溶液转移至spincolumn结合柱中，室温12000rpm离心2min，弃掉滤液；

d、加入500μlbufferwa，室温12000rpm离心1min，弃掉滤液；

e、小心沿管壁四周加入700μlbufferwb(使用前已加入指定体积的无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃滤液；

f、复上一步骤；

g、将结合柱重新安置于收集管上，室温12000rpm离心2min以甩干柱子上残余的液体，弃掉滤液；

h、将结合柱放置于新的已灭菌的1.5ml离心管上，同时敞开结合柱盖子，挥发5-10min，使乙醇挥发完全；

i、在结合柱膜中央加入15-30μlelutionbuffer(提前预热至65℃)溶解dna，静置5-10min；

j、12000rpm，离心1min，收集滤液，紫外分光光度计检测dna的浓度，并进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

4)切割有效性鉴定——t7ei酶切鉴定：

a、提取未转染的hek293t-wt的基因组作为对照；

b、以所提取转染后的细胞基因组和wt细胞基因组为模板pcr，依据最佳退火温度设定pcr程序，反应结束后将pcr产物分别用cycle-purekit回收试剂盒纯化目的条带，纯化产物进行变性和退火，各反应的体系和程序分别如下：

表2pcr扩增反应体系

表3pcr扩增反应程序

表4pcr产物退火体系

pcr产物退火程序为：95℃反应5min，以2℃/s降至85℃，再以0.1℃/s降至25℃；

引物ko-f序列如seqidno.4所示，引物ko-r序列如seqidno.5所示；

seqidno.4：5’-ggaagcctgtcatctgtgct-3’；

seqidno.5：5’-cacgcatggtgttggtgaag-3’；

c、t7ei酶切检测sgrna活性，酶切反应体系如表5所示：

表5酶切反应体系

上述酶切体系于37℃反应30min，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，表明sgrna能有效切割靶点。

(2)培养悬浮细胞kbm5：

a、将pbs溶液、kbm5细胞完全培养基(在rpmi1640培养基中加入终浓度为10％的fbs，1％双抗ps，充分混合均匀后采用直径为0.22μm滤器进行过滤)从4℃冰箱取出至室温放置预热；

b、在生物安全柜中用移液枪将细胞悬液转移至15ml离心管中，500rpm离心3min后弃掉上清液，加入1mlpbs，轻轻吹打重悬细胞，500rpm离心3min后吸掉上清液(本方法为了去除悬浮细胞的死亡细胞及碎片，选择采用低速离心的方法，500rpm离心3min，与以往采用1000rpm离心悬浮细胞悬液有所不同)；

c、用1ml培养基重悬细胞，按照1：3接种至6孔培养板中，置于培养箱内培养，2-3天传代一次，如此进行多次传代培养。

(3)采用电穿孔瞬时转染法将步骤(1)获得的重组表达载体和phcas9质粒共转染步骤(2)获得的kbm5细胞：

本实施例将pegfp-n2质粒以及上述构建成功的crispr/cas系统质粒分别转染至kbm5细胞，通过荧光倒置显微镜观察gfp表达强度，以分析转染效率。

1)pegfp-n2质粒转染kbm5细胞：

a、细胞转染前1-2天，细胞传代至新的孔，以使电转时细胞密度能达到70-90％；

b、提前配好不加双抗的培养基，与不加双抗的pbs放于室温预热，在24孔培养板的两个孔中各加入1ml的无双抗培养基，放于培养箱预热30min；

c、收集各孔中的细胞将其吸至15ml离心管中，500rpm离心5min，吸掉上清；

d、用1mlpbs培养基重悬细胞，取100μl细胞悬液稀释10倍后用血球计数板进行细胞计数，各取2×10⁵个细胞至两个1.5ml离心管中，500rpm离心5min，小心地吸掉上清。

e、配制2管质粒悬液，质粒以及pbs的添加量如表6所示,移液枪轻轻吹打混匀质粒悬液；

表6pegfp-n2质粒和pbs的添加量

f、分别用上述配制的10μl质粒悬液重悬1.5ml离心管中的细胞沉淀，轻轻吹打混匀；

g、在电转杯中加入3mlbuffere，将电转杯按说明书操作插入电转仪器的卡槽中，并调节参数，上述细胞与质粒的悬液采用表7的电转参数进行电转操作进行电转操作；

表7电转参数

h、电转枪插上配套的10μl的电转枪头吸取上述混匀的细胞质粒悬液，注意不能有气泡，将电转枪插入电转杯中，按下按钮通电；

i、将电击后的枪拔出，从培养箱中拿出预热的24孔培养板，将悬液打入培养基中，用移液枪轻轻吹打混匀，同时十字型轻轻晃动数次，使细胞分布均匀，并放置于37℃,5％co2培养箱内培养；

j、转染效率的评定：转染细胞24h后更换为新鲜的培养基，48h后将细胞置于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白gfp在细胞中的表达情况，据此进行转染效率的评估。结果如图2所示，转染效率高达50％以上。

2)构建成功的crispr/cas系统质粒转染kbm5细胞：

a、kbm5细胞转染前1-2天，细胞传代至新的六孔培养板，以使电转时细胞密度能达到70-90％；

b、提前配好不加双抗的培养基，与不加双抗的pbs放于室温预热，在六孔培养板的孔中各加入3ml的无双抗培养基，放于培养箱预热30min；

c、收集孔中的胞，将其吸至15ml离心管中，500rpm离心5min，吸掉上清；

d、用1mlpbs培养基重悬细胞，同时用血球计数板进行细胞计数，取1.8×10⁶个细胞至1.5ml离心管中，500rpm离心5min，小心地吸掉上清；

e、配制质粒悬液，质粒以及pbs的添加量如表8所示，移液枪轻轻吹打混匀两管质粒悬液；

表8质粒和pbs的添加量

f、用上述配制的90μl质粒悬液重悬1.5ml离心管中的细胞沉淀，轻轻吹打混匀；

g、在电转杯中加入3mlbuffere，将电转杯按说明书操作插入电转仪器的卡槽中，并调节参数：电压1350v，脉冲时间30ms，脉冲次数1次，对上述细胞与质粒的悬液进行电转操作；

h、电转枪插上配套的10μl的电转枪头吸取上述混匀的kbm5细胞与质粒悬液，注意不能有气泡，将电转枪插入电转杯中，按下按钮通电；

i、将电击后的枪拔出，从培养箱中拿出预热的六孔培养板，将悬液打入培养基中，再次吸取10μl细胞与质粒的悬液电击，打入对应的孔中，直至90μl悬液全部电击完，用移液枪轻轻吹打混匀孔中的培养基，同时十字型轻轻晃动数次，使细胞分布均匀，并放置于37℃，5％co2培养箱内培养。

(4)筛选阳性细胞：

步骤(3)中电击细胞培养48h后加入浓度为100mg/ml的g418，使其终浓度为400μg/ml进行筛选，每天观察记录细胞状态，每隔一天更换新鲜含有g418的筛选培养基。

(5)筛选单克隆细胞：

经5-7天的g418药物筛选后，停止药物筛选，进行细胞克隆化培养，利用有限稀释法(limitingdilutionanalysis,lda)以获得单克隆细胞，最终使96孔板的每个孔约含有一个细胞。具体操作步骤如下：

a、将经g418筛选后的细胞分别收集至15ml离心管中，低速离心，用1ml培养基重悬细胞，用血球计数板进行细胞计数，细胞的数量在5×10⁵-1×10⁶cells/ml之间，准备1.5ml离心管，按比例用完全培养基分别将其稀释至10⁵cells/ml，用移液枪充分吹打混匀；

b、在新的1.5ml离心管中加入900μl完全培养基，从第一个管中吸取100μl加入第二个离心管，充分吹打混匀细胞，此时细胞的密度为10⁴cells/ml，依此类推稀释至离心管中细胞的密度为10³cells/ml；

c、分别取上述100μl细胞悬液在96孔培养板第一列孔中，使各个空中的细胞数为100个，分别补加100μl的完全培养基，轻轻吹打混匀，从第一列吸取100μl至第二列的孔中，以此类推，以列为单位进行稀释，最终稀释至每一列孔的细胞约为1个，最后每列孔再分别补加100μl完全培养基；

d、将培养板放于培养箱内，每天用倒置显微镜观察克隆的生长情况，留下只有一个克隆生长的孔；

e、观察细胞8-10天后，选取大量繁殖的克隆扩大至含有1ml完全培养基的24孔培养板中培养，并做好相应标记；

f、待培养4-5天后，细胞大量繁殖，从24孔培养板的各个孔中分别吸取500μl的细胞悬液至相应的1.5ml离心管中，做好标记，用于后续的鉴定，同时补加500μl的完全培养基至相应的孔中。

(6)对单克隆细胞进行鉴定：

a、将步骤(5)获得的单克隆悬液于10000rpm离心5min，洗掉上清，于室温倒置，待其干燥后加入细胞裂解液20μl，吹打混匀，并将其转移至pcr管中，于pcr仪上进行裂解，裂解程序如表9所示，反应结束后，离心取上清用作pcr反应模板；

表9裂解程序

b、以上述细胞裂解后所获得的基因组作为模板，对sgrna靶向位点附近进行pcr扩增，pcr反应体系如表2所示，反应程序如表3所示，pcr产物送去进行sanger测序；

c、使用snapgene对测序结果进行分析，判断克隆细胞的基因是否编辑程功，对于无法确定克隆细胞基因型的情况，进一步采用ta克隆的方法进行分析，部分单克隆测序结果如图3所示。

(7)阳性单克隆细胞扩大培养及冻存。

实施例2

本发明一种悬浮细胞kbm5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法的一种实施例，所述步骤(3)中电穿孔瞬时转染法步骤e中的电转参数为：电压1200v，脉冲时间20ms，脉冲次数3次，其他步骤与实施例1相同。

倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白gfp在kbm5细胞中的表达情况，结果显示转染效率高达50％以上，具体数据省略。

实施例3

本发明一种悬浮细胞kbm5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法的一种实施例，所述步骤(3)中电穿孔瞬时转染法步骤e中的电转参数为：电压1300v，脉冲时间25ms，脉冲次数2次，其他步骤与实施例1相同。

倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白gfp在kbm5细胞中的表达情况，结果显示转染效率高达50％以上，具体数据省略。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>广州华腾生物医药科技有限公司

<120>一种悬浮细胞kbm5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法

<130>2019.7.8

<141>2019-07-09

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>1

caccatttgaggaactccgccgcc24

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>2

aaacggcggcggagttcctcaaat24

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>3

atttaggtgacactatag18

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>4

ggaagcctgtcatctgtgct20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>5

cacgcatggtgttggtgaag20