一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法与流程

本发明涉及兔出血症治疗领域，具体是一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法。

背景技术：

兔出血症(rabbithemorrhagicdisease，rhd)是由兔出血症病毒(rabbithemorrhagicdiseasevirus，rhdv)引起的一种急性、高度传染性、高致死性的疾病，以呼吸系统出血、实质器官水肿、淤血及出血变化为特征，给养兔业带来巨大的经济损失，曾是兔的一种毁灭性传染病而备受关注。该病于1984年在我国江苏省的江阴县首次被发现，之后迅速蔓延至全国25个省、市、自治区。迄今亚洲的朝鲜、印度和黎巴嫩、美洲的墨西哥、非洲的喀麦隆和欧洲的奥地利、比利时、捷克、丹麦、法国、德国、希腊、卢森堡、荷兰、波兰、西班牙、瑞典、瑞士及南斯拉夫等国也都有发生。该病常呈暴发性流行，发病率及病死率极高，对易感动物致病率达90％，病死率高达100％，是危害养兔业的最严重的疾病之一。

对rhdv感染至今尚无有效治疗药物，所能应用的治疗措施仅限于对症治疗和支持治疗。目前，各国都加大了rhdv疫苗的研究力度，以便能够对rhdv感染进行有效的预防和治疗。使用的组织灭活疫苗预防该病，但存在着散毒、生产成本不断增加等潜在的缺点以及动物福利等问题，使得研究人员致力于基因工程疫苗的研制以达到预防该病的效果。

现在的rhdv疫苗制备主要以rhdv病毒接种家兔后，分离肝脏，研磨过滤灭菌后，但是病毒的体外培养仍是难题,还没有找到合适的体外培养细胞，有使用期限，过期后疫苗失效。现仍用该病死兔的肝脏制灭活苗,因灭活不彻底有导致散毒可能,故有必要在病毒结构和体外易感细胞上突破,研制基因疫苗是当下乃至将来的发展趋势。

技术实现要素：

本发明实施例的目的在于提供一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，具体步骤如下：

步骤一，筛选重组鸡痘病毒中间转移载体：将rhdv结构蛋白vp60插入复合启动子的下游，将il-18基因插入串联启动子的下游，构建了含有rhdv结构蛋白vp60和il-18的鸡痘病毒中间转移载体。

步骤二，制备cef单层细胞：取9-11日龄无特定病原体鸡胚，分别用碘酒、酒精棉对鸡胚进行擦拭消毒后放在超净台内，将有气室的部位朝上，小心地用无菌镊子敲破蛋壳，沿气室边缘夹掉蛋壳，再用心的无菌镊子接开尿囊绒毛膜，再用弯头镊子深入蛋壳内取出鸡胚后放入平皿中，去头、四肢、内脏，剪碎成小块，再用pbs清洗3遍，至组织款发白为止。将剪碎的组织小块移入另一小平皿内，加入适量的胰酶(0.5％)和磷酸盐缓冲液，于37℃细胞培养箱中消化10分钟左右，倒掉液体后加入生长液，用枪头反复吹成单个细胞，再用灭菌纱布过滤，将过滤的得到的细胞悬液稀释10倍，使细胞终止浓度到达50万个/ml，每个细胞瓶中加入8ml，放入二氧化碳培养箱中，将培养至cef(胚胎成纤维细胞)细胞长成融合单层，待用。

步骤三，鸡痘病毒细胞内同源重组：取新制备的生长状态良好的cef细胞，倒掉其中的培养液，清洗并且加入胰酶，静置至壁上细胞全部消化下来，倾去并洗去残留胰酶，选择融合度为70～80％的融合单层cef细胞，吸去培养上清液，然后按0.1mol接种fpv282e4株(由军事医学科学院军事兽医研究惠赠)，吸附，在鸡痘病毒吸附培养的同时，向85μl的mem完全培养液中加入15μldotapliposomal(脂质体转染试剂)，轻轻混匀，得到前混合物，另取50mlmem完全培养液加入10～20μg鸡痘病毒中间转移载体并且混匀，得到后混合物，然后将后混合物滴加于前混合物中轻轻吹打混匀，待鸡痘病毒吸附1.5～3h后，将质粒与转染试剂的混合液加到上述单层细胞上，并用无血清mem完全培养液将每孔中的液体补足至1ml，培养12～18h，然后每孔补加mem完全培养液，继续培养72～120h收病毒，-70℃保存；

步骤四，鸡痘病毒的筛选：向mem完全培养液中加入brdu(胸腺嘧啶核苷类似物)，10～14小时后吸去mem完全培养液，接种步骤三得到的病毒，再用含brdu的培养液将每孔中的液体补足至3ml，接种病毒后120h收获细胞，将收获细胞接种于brdu预处理后的cef单层细胞上，继续培养120h，收获细胞，经过三次brdu加压筛选后，将收获的细胞再接种于cef单层细胞上，在无brdu的条件下培养，挑选单个病毒蚀斑，并进行三次蚀斑纯化、扩增，再筛选重组病毒；

步骤五，鉴定重组病毒：将重组病毒接种于玻片上的融合单层cef上，同时设亲本fpv和正常细胞对照。在37℃，co2体积分数为5％的条件下吸附培养1.5～2.5h，继续培养至细胞出现明显病变后，取出玻片，将玻片置于玻璃器皿中，用pbs(ph7.2)或tbs洗涤缓冲液洗一次，100％丙酮固定10～15min，再用pbs冲洗3次后，与适当稀释后的兔抗asia1型fmdv阳性血清37℃反应2h，用pbs洗涤3次，然后与异硫氰酸荧光素(fitc)标记的二抗(1:100)在37℃反应30min，用pbs洗涤3次，再用tbs洗涤缓冲液和蒸馏水各洗一次，载玻片上加一滴甘油缓冲液(甘油的质量分数为50％的pbs)，将载有细胞的玻片反扣于载玻片上，于荧光显微镜下观察和拍照。

作为本发明实施例进一步的方案：步骤一中复合启动子为ati-p7.5×20(由军事医学科学院军事兽医研究所金宁一院士惠赠)，串联启动子为p7.5×16(由军事医学科学院军事兽医研究所金宁一院士惠赠)。

作为本发明实施例进一步的方案：步骤二中病毒滴度的计算公式为：病毒滴度(pfu/ml)＝病毒空斑数×稀释倍数/接种量。

作为本发明实施例进一步的方案：步骤三中吸附和培养的条件均为37℃和co2的体积分数为5％。

作为本发明实施例进一步的方案：步骤四中将收获细胞冻融3次后，再接种于brdu预处理后的cef单层细胞上。

作为本发明实施例进一步的方案：步骤四中筛选重组病毒的方法包括间接免疫荧光实验和westernblotting检测。

作为本发明实施例进一步的方案：步骤二中添加mem完全培养液并且继续培养24～48h的培养条件为37℃，湿度为60～80％，co2的体积分数为5％，mem完全培养液中甲基纤维素的质量分数为1％，小牛血清的质量分数为4％。

il-18是一种新近发现的细胞因子，具有多种生物学功能。它由单核-巨噬细胞和上皮细胞产生，可激活nk细胞，刺激激活的t细胞产生gm-csf、il-2、ifn-γ，抑制激活的t细胞产生il-10。研究发现，il-18可通过调节ifn的表达提高机体的免疫水平，起到免疫佐剂作用，从而达到控制和预防微生物感染。因此，将il-18与rhdv结构基因vp60共表达，以起到基因佐剂的作用，构建共表达结构蛋白vp60、分子佐剂的重组鸡痘病毒疫苗，有效地提高接种动物的细胞免疫和体液免疫水平，预防该病的发生和流行，减少巨大的经济损失。

与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：

本发明应用基因重组技术，构建含有il-18的重组鸡痘疫苗，再经过加压筛选、鉴定、培养、浓缩后的毒力测定，免疫原性的检测，具有易培养、易储存、无毒性扩散、易生产、提高免疫效果、节省资金等优点，应用前景广阔。

附图说明

图1为重组鸡痘病毒疫苗的制备方法中实验动物接种重组疫苗、兔瘟疫苗的特异性抗体产生情况的示意图。

图2为重组鸡痘病毒疫苗的制备方法中实验动物接种重组疫苗、兔瘟疫苗的il-2细胞免疫反应检测结果图。

图3为重组鸡痘病毒疫苗的制备方法中实验动物接种重组疫苗、兔瘟疫苗的ifn-γ检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，具体步骤如下：

步骤一，筛选重组鸡痘病毒中间转移载体：将rhdv的结构蛋白vp60插入复合启动子ati-p7.5×20的下游，将兔il-18基因插入串联启动子p7.5×16的下游，构建了含有rhdv结构蛋白vp60和兔白细胞介素il-18的鸡痘病毒中间转移载体putal-vp60-il18；

步骤二，制备cef单层细胞：将cef细胞覆盖于6孔细胞培养板(孔径3.5cm，6×30mm)，每孔3ml，培养至cef细胞长成融合单层，吸去培养液并且采用hankˊs液洗融合单层2次，将fpv病毒以mem完全培养液按10^-8递进10倍稀释，然后每孔接fpv病毒稀释液300μl，设一孔作细胞对照，37℃吸附1h，再向其中加入mem完全培养液培养，吸去培养上清液，添加mem完全培养液并且继续培养28h，吸去培养液，用pbs洗两次，在倒置显微镜下直接检查蚀斑数，并计算病毒原液中的病毒滴度，病毒滴度的计算公式为：病毒滴度(pfu/ml)＝病毒空斑数×稀释倍数/接种量；

步骤三，鸡痘病毒细胞内同源重组：取新制备的生长状态良好的cef细胞，倒掉其中的培养液，用1ml质量分数为0.25％的胰酶洗一次，然后再加入0.5ml质量分数为0.25％的胰酶，静置至壁上细胞全部消化下来，倾去并洗去残留胰酶，混匀后取小量细胞悬液，在光学显微镜下计数，选择融合度为75％的融合单层cef细胞，吸去培养上清液，然后按0.1mol接种fpv282e4株，在37℃和co2的体积分数为5％下吸附2.5h，每30min摇动一次培养板，在鸡痘病毒吸附培养的同时，向85μl的mem完全培养液中加入15μldotapliposomal(这是脂质体)，轻轻混匀，另取50mlmem完全培养液加入16μg鸡痘病毒中间转移载体并且混匀，然后将后者滴加于前一液体中轻轻吹打混匀，室温下作用30min以上，待鸡痘病毒吸附2h后，将质粒与转染试剂的混合液加到上述单层细胞上，并用无血清mem完全培养液将每孔中的液体补足至1ml，在37℃和co2的体积分数为5％的条件下培养14h，然后每孔补加mem完全培养液，继续培养110h(一般在第四天出现病变)收病毒，-80℃保存；

步骤四，鸡痘病毒的筛选：向mem完全培养液中加入brdu，使其终浓度为40μg/ml，12小时后吸去mem完全培养液，接种步骤三得到的病毒，37℃吸附1.5h后，再用含brdu的培养液将每孔中的液体补足至3ml，继续培养，观察细胞病变，接种病毒后120h收获细胞，将收获细胞接种于brdu预处理后的cef单层细胞上，继续培养120h，收获细胞，经过三次brdu加压筛选后，将收获的细胞冻融3次，再接种于cef单层细胞上，在无brdu的条件下培养，挑选单个病毒蚀斑，并进行三次蚀斑纯化、扩增，再采用间接免疫荧光实验和westernblotting检测筛选重组病毒；

步骤五，鉴定重组病毒：将重组病毒接种于玻片上的融合单层cef上，同时设亲本fpv和正常细胞对照。在37℃，co2体积分数为5％的条件下吸附培养2h，继续培养至细胞出现明显病变后，取出玻片，将玻片置于玻璃器皿中，用pbs(ph7.2)或tbs洗涤缓冲液洗一次，质量分数为100％的丙酮固定13min，再用pbs冲洗3次后，与适当稀释后的兔抗asia1型fmdv阳性血清37℃反应2h，用pbs洗涤3次，然后与异硫氰酸荧光素(fitc)标记的二抗(1:100)在37℃反应30min，用pbs洗涤3次，再用tbs洗涤缓冲液和蒸馏水各洗一次，载玻片上加一滴甘油缓冲液(甘油的质量分数为50％的pbs)，将载有细胞的玻片反扣于载玻片上，于荧光显微镜下观察和拍照。

图1为实验动物接种重组疫苗、兔瘟疫苗的特异性抗体产生情况，表明重组疫苗具有良好的免疫反应；图2为实验动物接种重组疫苗、兔瘟疫苗的il-2细胞免疫反应检测结果，表明重组疫苗能引起实验动物产生良好的细胞免疫反应。图3为实验动物接种重组疫苗、兔瘟疫苗的ifn-γ检测结果，表明重组疫苗能引起实验动物产生良好的细胞免疫反应。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。