本发明涉及微生物的技术领域，具体为一种微生物絮凝剂的制备方法。
背景技术：
随着经济的高速发展和人口的增长，我国每年的用水量和污水排放量也在增加，污水处理问题日益严峻，给水处理问题也不容忽视。目前，水和废水的处理方法主要有生化、离子交换、吸附、化学氧化、电渗析和絮凝沉淀等多种。其中应用最普遍、成本较低的处理方法是絮凝沉淀法。在絮凝沉淀法处理废水中，絮凝剂的开发选择是其关键技术之一。絮凝剂作为一种用途广泛的水处理试剂，不仅应用于工业废水处理，同时也广泛应用于发酵工业水处理以及化工、食品、医药等领域的固液分离过程。长期以来用于给水和废水处理常用的絮凝剂主要以铝盐、铁盐及其聚合物为代表的无机絮凝剂和以聚丙烯酰胺为代表的有机高分子絮凝剂。这些絮凝剂虽然有较好的絮凝活性，但是它们的残留物多有害，且存在二次污染问题。同时也危害着人类的健康。由于应用铝盐絮凝剂法处理后的污泥作为肥料应用于农业，或者填埋后，导致土壤中的铝含量升高，使植物出现铝害，从而影响植物正常生长，甚至死亡；同时伴随着农作物进入食物链，最终影响人类的健康，引起铝性脑病。老年性痴呆症就是铝性脑病的一种。铁性絮凝剂不仅具有强烈的腐蚀性，限制设备的使用，而且容易残留铁离子，而且被处理后的水带有色度。合成有机高分子絮凝剂最常用的就是聚丙烯酰胺。其虽然本身没有任何毒性，但其难降解性却易造成二次污染，而且聚合物单体的残留不仅具有强烈的神经毒性，而且是强致癌物。因此这类的絮凝剂的使用受到了制约。同时开发无毒、无害、无二次污染，可以生物降解的高效絮凝剂受到研究者越来越多的关注。微生物絮凝剂(mbf，microbialflocculant)是一类由微生物或其分泌物产生的代谢产物，它是利用微生物技术，通过细菌、真菌等微生物发酵、提取、精制而得的，是具有生物分解性和安全性的高效、无毒、无二次污染的水处理剂。它主要由微生物代谢产生的各种多聚糖类、蛋白质，或是蛋白质和糖类参与形成的高分子化合物。能产生微生物絮凝剂的微生物种类很多，它们大量存在于土壤、活性污泥和沉积物中。
对微生物絮凝剂的研究，最早见报道的是1935年butterfield从活性污泥中筛选到一株絮凝剂产生菌。随后的研究者在这方面继续进行了研究。70年代j.nakamura等人从霉菌、细菌、放线菌、酵母菌等214株菌中筛选出19株絮凝剂产生菌株，包括8株霉菌、5株细菌、5株放线菌和1株酵母菌。其中aspergzllussoda产生的絮凝剂aj7002效果最好；takagih等从土壤中分离到一株对多种微生物细胞和悬浮胶体颗粒具有良好絮凝作用的真菌paecilomycessp.；八十年代末kurane等人从土壤中分离筛选一株r.erythropolis,制成了命名为noc-1的微生物絮凝剂。kurane等人将noc一1用于畜产废水、膨胀污泥和砖场生产废水等的处理，均取得了很好的效果，被认为是目前发现的最好的微生物絮凝剂。目前，韩国的kwong.s.，seohyunhyo,kimyoung-jun等人，德国的p.reinhard说明书1/4页3cn105731657b3以及以色列的n.levy等人也对微生物絮凝剂进行了较为全面的研究。[3]至今研究者已经获得了多株具有不同絮凝能力的微生物絮凝剂产生菌，这些微生物絮凝剂在使用过程中具有高效、安全、不污染环境的优点，在食品、化学以及制药等领域具有巨大的潜在应用价值，现有的微生物絮凝剂最大的问题是微生物絮凝剂的活性普遍低下，为此亟需一种可以提高絮凝剂活性的微生物絮凝剂制备方法。
技术实现要素：
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种微生物絮凝剂的制备方法，具备絮凝剂活性高等优点，解决了絮凝剂活性普遍低下的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种微生物絮凝剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种取样：活性污泥稀释后,将其放置在30c恒温摇床，随后采用稀释平板涂布法获得单菌落,再分别将纯化后菌株接入筛选培养基中摇瓶培养,之后培养液进行絮凝活性的初步测定,絮凝活性较高者的为产絮凝剂菌株。
(2)絮凝活性测定：称取高岭土,从中加入蒸馏水至制成高岭土悬液；随后取待测液加入到高岭土悬液中，慢速搅拌,静置,并在550nm处测量上清液吸光度,以去离子水代替待测液作为对照,同法测吸光度。
(4)菌种培养：将菌种种子培养后再进行摇瓶培养,分别对培养基初始ph和培养时间对絮凝率的影响进行测定，将筛选后的菌种进行摇瓶培养,培养时间分别为22h,44h,66h,88h,测其絮凝率结果。
(5)絮凝剂的提取：将培养液离心分离，从而去除沉淀，上清夜中加人1.5倍体积的丙酮,此时去除上清液，乙醚洗涤沉淀，随后真空干燥,得到絮凝剂粗制品。
(6)絮凝剂的投加：测定絮凝剂投加量体积分数为0.75％，1％,1.25％
和1.5％时的絮凝率。
优选的，所述培养液于12000r/min转速下离心10min。
优选的，所述培养液去除的沉淀物为菌体和杂物。
优选的，所述上清液投加量在1.00％～1.25％时絮凝效果最好,达到59.5％.小于或大于此范围时,絮凝效果均有所降低。
优选的，所述絮凝剂提取的方法为三种，分别为丙酮法、乙醇法与十六烷基三甲基溴化铵法。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种微生物絮凝剂的制备方法，具备以下有益效果：
1、该微生物絮凝剂的制备方法，通过对丙酮提取法,乙醇提取法和十六烷基三甲基溴化铵法3种提取方法的比较表明,十六烷基三甲基溴化铵法具有较高的产率,每升培养液可得到1.33g的干制品,3种方法得到的粗制品絮凝活性相差不大,十六烷基三甲基溴化铵法相对较高,为71.8％，有效地提高了絮凝剂粗制品的活性，通过十六烷基三甲基溴化铵法从微生物培养液中提取得到的絮凝剂产率高,具有较高的絮凝活性,且对环境不会造成二次污染,具有非常广阔的应用前景。
2、该微生物絮凝剂的制备方法，通过设定不同的培养时间，测定其絮凝率的结果，在培养时间为0～22h,微生物生长迅速,代谢旺盛,培养物絮凝活性随培养时间增加提高，22～66h絮凝率略有升高，但变化不大,在培养66h时絮凝率最高，66h后由于微生物生长代谢的消耗，培养液的絮凝率开始降低，从而使用户的得到培养絮凝活性最合适的时间，有效地提升了用户的产品质量。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
一种微生物絮凝剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种取样：活性污泥稀释后,将其放置在30c恒温摇床，160r/min富集培养三天,随后采用稀释平板涂布法获得单菌落,再分别将纯化后菌株接人100ml筛选培养基中,以30℃,160r/min摇瓶培养3天,之后培养液进行絮凝活性的初步测定,絮凝活性较高者的为产絮凝剂菌株。
(2)絮凝剂活性测定：称取0.1g高岭土,从中加入蒸馏水至200ml,制成高岭土悬液，取2ml待测液加入到200ml高岭土悬液中，慢速搅拌10min,随后静置5min,在550nm处测量上清液吸光度b,以去离子水代替待测液作为对照,同法测吸光度a，絮凝率＝(a-b)/a.100％。
(3)菌种培养：将菌种接种于平板培养基中活化一天后，用接种环将菌种接种到装有50mi,在发酵培养基的锥形瓶中发酵培养,培养温度为30℃,摇床转速为150r/min,培养时间为22h，将其离心后取上清液测定其絮凝率，在培养时间为0～22h时,微生物生长迅速,代谢旺盛,培养物絮凝活性随培养时间增加提高。
(4)絮凝剂的提取：其中丙酮法的方法为培养液离心分离(5000r/min,离心25min),去除沉淀菌体和杂物，上清液中加入1.5倍体积的丙酮,4℃放置过夜，12000r/min,离心10min,此时去除上清液，随后乙醚洗涤沉淀，再将真空干燥,得到絮凝剂粗制品。
(5)絮凝剂的投加：投加絮凝剂加量体积为0.75％，1％,1.25％和1.5％时的絮凝率，上清液投加量在1.00％～1.25％时絮凝效果最好,达到59.5％，小于或大于此范围时,絮凝效果均有所降低。
实施例二：
一种微生物絮凝剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种取样：活性污泥稀释后,置将其放置在30c恒温摇床，160r/min富集培养四天,随后采用稀释平板涂布法获得单菌落,再分别将纯化后菌株接人100ml筛选培养基中,以30℃,160r/min摇瓶培养4天,之后培养液进行絮凝活性的初步测定,絮凝活性较高者的为产絮凝剂菌株。
(2)絮凝剂活性测定：称取0.2g高岭土,从中加入蒸馏水至400ml,制成高岭土悬液，取2ml待测液加入到200ml高岭土悬液中，慢速搅拌10min,静置5min,在550nm处测量上清液吸光度b,以去离子水代替待测液作为对照,同法测吸光度a，絮凝率＝(a-b)/a.100％。
(3)菌种培养：将菌种接种于平板培养基中活化两天后，用接种环将菌种接种到装有50mi,发酵培养基的锥形瓶中发酵培养,培养温度为30℃,摇床转速为150r/min,培养时间为44h，离心后取上清液测定其絮凝率，在培养时间为22～66h，絮凝率略有升高，但变化不大。
(4)絮凝剂的提取：乙醇法，培养液离心分离(5000r/min,离心25min),去除沉淀菌体和杂物，上清夜中加人1.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀离心，收集沉淀，70％乙醇洗涤沉淀，真空干燥，得到絮凝剂粗制品。
(5)絮凝剂的投加：投加絮凝剂加量体积为0.75％，1％,1.25％和1.5％时的絮凝率，上清液投加量在1.00％～1.25％时絮凝效果最好,达到59.5％，小于或大于此范围时,絮凝效果均有所降低。
实施例三：
一种微生物絮凝剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种取样：活性污泥稀释后,置将其放置在30c恒温摇床，160r/min富集培养五天,随后采用稀释平板涂布法获得单菌落,再分别将纯化后菌株接人100ml筛选培养基中,以30℃,160r/min摇瓶培养5天,之后培养液进行絮凝活性的初步测定,絮凝活性较高者的为产絮凝剂菌株。
(2)絮凝剂活性测定：称取0.3g高岭土,从中加入蒸馏水至700ml,制成高岭土悬液，取2ml待测液加入到200ml高岭土悬液中，慢速搅拌10min,静置5min,在550nm处测量上清液吸光度b,以去离子水代替待测液作为对照,同法测吸光度a，絮凝率＝(a-b)/a.100％。
(3)菌种培养：将菌种接种于平板培养基中活化两天后，用接种环将菌种接种到装有50mi,发酵培养基的锥形瓶中发酵培养,培养温度为30℃,摇床转速为150r/min,培养时间为66h，离心后取上清液测定其絮凝率，在培养时间为0～22h,微生物生长迅速,代谢旺盛,培养物絮凝活性随培养时间增加提高，22～66h絮凝率略有升高，但变化不大,在培养66h时絮凝率最高。
(4)絮凝剂的提取：十六烷基三甲基溴化铵法，培养液离心分离,去除沉淀菌体和杂物，上清夜中缓慢加人浓度为10％的十六烷基三甲基溴化铵,直到无沉淀析出，离心后收集沉淀，将沉淀溶于2mol/l的nacl溶液中,加2倍体积的无水乙醇进行沉淀，直到无沉淀析出，分别用75％乙醇、无水乙醇、乙醚进行洗涤，真空干燥,得到絮凝剂粗制品。
(5)絮凝剂的投加：投加絮凝剂加量体积为0.75％，1％,1.25％和1.5％时的絮凝率，上清液投加量在1.00％～1.25％时絮凝效果最好,达到59.5％，小于或大于此范围时,絮凝效果均有所降低。
实施例四：
一种微生物絮凝剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种取样：活性污泥稀释后,将其放置在30c恒温摇床，160r/min富集培养六天,随后采用稀释平板涂布法获得单菌落,再分别将纯化后菌株接人100ml筛选培养基中,以30℃,160r/min摇瓶培养六天,之后培养液进行絮凝活性的初步测定,絮凝活性较高者的为产絮凝剂菌株。
(2)絮凝剂活性测定：称取0.3g高岭土,从中加入蒸馏水至800ml,制成高岭土悬液；取2ml待测液加入到200ml高岭土悬液中，慢速搅拌10min,静置5min,在550nm处测量上清液吸光度b,以去离子水代替待测液作为对照,同法测吸光度a，絮凝率＝(a-b)/a.100％。
(3)菌种培养：将菌种接种于平板培养基中活化四天后，用接种环将菌种接种到装有50mi,发酵培养基的锥形瓶中发酵培养,培养温度为30℃,摇床转速为150r/min,培养时间为88h，离心后取上清液测定其絮凝率，在培养时间为0～22h,微生物生长迅速,代谢旺盛,培养物絮凝活性随培养时间增加提高，22～66h絮凝率略有升高，但变化不大,在培养66h时絮凝率最高，66h后由于微生物生长代谢的消耗，培养液的絮凝率开始降低。
(4)絮凝剂的提取：在絮凝剂粗制品的投加量均为3mg/l的情况下,分别对丙酮提取法,乙醇提取法和十六烷基三甲基溴化铵提取法得到的絮凝剂粗品进行絮凝率的测定,絮凝率结果依次为66.0％,67.4％和71.8％，3种方法得到的粗制品絮凝活性相差不大,十六烷基三甲基溴化铵法得到絮凝剂的絮凝活性相对较高。
(5)絮凝剂的投加：投加絮凝剂加量体积为0.75％，1％,1.25％和1.5％时的絮凝率，上清液投加量在1.00％～1.25％时絮凝效果最好,达到59.5％，小于或大于此范围时,絮凝效果均有所降低。
实施例五：
一种微生物絮凝剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种取样：活性污泥稀释后,将其放置在30c恒温摇床，160r/min富集培养六天,随后采用稀释平板涂布法获得单菌落,再分别将纯化后菌株接人100ml筛选培养基中,以30℃,160r/min摇瓶培养六天,之后培养液进行絮凝活性的初步测定,絮凝活性较高者的为产絮凝剂菌株。
(2)絮凝剂活性测定：称取0.4g高岭土,从中加入蒸馏水至1000ml,制成高岭土悬液，分别取高岭土悬液、氯化钙水溶液各10ml、0.5ml，混合均匀，从中取9.8ml，再取0.2ml发酵液加入小烧杯中，对照不加发酵液，用ph计在小烧杯中调节ph值到7.5-8.0，在此过程中充分混匀，倒入试管中，静置半个小时，先用观测法观察其絮凝剂絮凝效果，再用滴管吸取上清液到比色皿中，在紫外分光光度计中550nm处测其吸光值，并计算絮凝率：絮凝率＝(a-b)/a.100％。
(3)菌种培养：将菌种接种于平板培养基中活化四天后，用接种环将菌种接种到装有50mi,发酵培养基的锥形瓶中发酵培养,培养温度为30℃,摇床转速为150r/min,培养时间为88h，离心后取上清液测定其絮凝率，在培养时间为0～22h,微生物生长迅速,代谢旺盛,培养物絮凝活性随培养时间增加提高，22～66h絮凝率略有升高，但变化不大,在培养66h时絮凝率最高，66h后由于微生物生长代谢的消耗，培养液的絮凝率开始降低。
(4)絮凝剂的提取：在絮凝剂粗制品的投加量均为3mg/l的情况下,分别对丙酮提取法,乙醇提取法和十六烷基三甲基溴化铵提取法得到的絮凝剂粗品进行絮凝率的测定,絮凝率结果依次为66.0％,67.4％和71.8％，3种方法得到的粗制品絮凝活性相差不大,十六烷基三甲基溴化铵法得到絮凝剂的絮凝活性相对较高。
(5)絮凝剂的投加：投加絮凝剂加量体积为0.75％，1％,1.25％和1.5％时的絮凝率，上清液投加量在1.00％～1.25％时絮凝效果最好,达到59.5％.小于或大于此范围时,絮凝效果均有所降低。
实施例六：
一种微生物絮凝剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种取样：活性污泥稀释后,将其放置在30c恒温摇床，160r/min富集培养六天,随后采用稀释平板涂布法获得单菌落,再分别将纯化后菌株接人100ml筛选培养基中,以30℃,160r/min摇瓶培养七天,之后培养液进行絮凝活性的初步测定,絮凝活性较高者的为产絮凝剂菌株。
(2)絮凝剂活性测定：称取0.4g高岭土,从中加入蒸馏水至1000ml,制成高岭土悬液，分别取高岭土悬液、氯化钙水溶液各10ml、0.5ml，混合均匀，从中取9.8ml，再取0.2ml发酵液加入小烧杯中，对照不加发酵液，用ph计在小烧杯中调节ph值到7.5-8.0，在此过程中充分混匀，倒入试管中，静置半个小时，先用观测法观察其絮凝剂絮凝效果，再用滴管吸取上清液到比色皿中，在紫外分光光度计中550nm处测其吸光值，并计算絮凝率：絮凝率＝(a-b)/a.100％。
(3)菌种培养：将菌种接种于平板培养基中活化五天后，用接种环将菌种接种到装有50mi,发酵培养基的锥形瓶中发酵培养,培养温度为30℃,摇床转速为150r/min,培养时间为88h，离心后取上清液测定其絮凝率，在培养时间为0～22h,微生物生长迅速,代谢旺盛,培养物絮凝活性随培养时间增加提高，22～66h絮凝率略有升高，但变化不大,在培养66h时絮凝率最高，66h后由于微生物生长代谢的消耗，培养液的絮凝率开始降低。
(4)絮凝剂的提取：在絮凝剂粗制品的投加量均为4mg/l的情况下,分别对丙酮提取法,乙醇提取法和十六烷基三甲基溴化铵提取法得到的絮凝剂粗品进行絮凝率的测定,絮凝率结果依次为66.0％,67.4％和71.8％，3种方法得到的粗制品絮凝活性相差不大,十六烷基三甲基溴化铵法得到絮凝剂的絮凝活性相对较高。
(5)絮凝剂的投加：投加絮凝剂加量体积为0.75％，1％,1.25％和1.5％时的絮凝率，上清液投加量在1.00％～1.25％时絮凝效果最好,达到59.5％.小于或大于此范围时,絮凝效果均有所降低。
判断标准：絮凝剂活性检测为百分之60以上时为合格。
本发明的有益效果是：通过对丙酮提取法,乙醇提取法和十六烷基三甲基溴化铵提取法3种提取方法的比较表明,十六烷基三甲基溴化铵法具有较高的产率,每升培养液可得到1.33g的干制品,3种方法得到的粗制品絮凝活性相差不大,十六烷基三甲基溴化铵法相对较高,为71.8％，有效地提高了絮凝剂粗制品的活性，通过catb法从微生物培养液中提取得到的絮凝剂产率高,具有较高的絮凝活性,且对环境不会造成二次污染,具有非常广阔的应用前景，通过设定不同的培养时间，测定其絮凝率的结果，在培养时间为0～22h,微生物生长迅速,代谢旺盛,培养物絮凝活性随培养时间增加提高，22～66h絮凝率略有升高，但变化不大,在培养66h时絮凝率最高，66h后由于微生物生长代谢的消耗，培养液的絮凝率开始降低，从而使用户的得到培养絮凝活性最合适的时间，有效地提升了用户的产品质量。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。