本发明涉及一种动物软骨的加工技术，特别是利用动物软骨分别提取硫酸软骨素和胶原蛋白肽的方法，具体涉及先用乙酸抽提的方法提取硫酸软骨素再用酶解法提取胶原蛋白肽的一种生产工艺。
背景技术：
我国是一个人口大国，农业、畜牧业比较发达，软骨资源比较丰富。动物软骨、喉骨、鼻骨和气管中富含硫酸软骨素和胶原蛋白等活性成分已经被广泛的应用于药品、保健食品、化妆品以及食品等领域中。
硫酸软骨素素(chondroitinsulfate，cs)是一种由d-葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基半乳糖构成的重复二糖单位组成的酸性粘多糖。它含有50-70个双糖基本结构，分子量为10000-50000之间。按照其化学组成和结构可以具体分为：硫酸软骨素a、b、c、d、e、f、h等多种同分异构体。硫酸软骨素是从动物软骨中提取，主要是硫酸软骨素a和硫酸软骨素c及其他硫酸软骨素的混合物。硫酸软骨素a和硫酸软骨素c均有d-氨基葡萄糖醛酸和n-乙酰-d-氨基半乳糖组成，只是硫酸基的位置不同。
硫酸软骨素通常是和胶原蛋白结合形成糖蛋白的形式存在。硫酸软骨素生产方式分为碱解法（收率低、杂质多、污染严重已经被淘汰）及酶解法（目前硫酸软骨素生产厂家主流生产方法）都是把硫酸软骨素和胶原蛋白肽同时从软骨中通过不同种酶的作用同时水解到同一溶液中，然后逐步通过树脂吸附、超滤、氧化、醇沉、脱水、干燥得到硫酸软骨素；树脂吸附后的废液或超滤滤出液经过纳滤、双效浓缩以及喷雾干燥得到粗胶原蛋白肽。部分生产企业只选择提取硫酸软骨素而胶原蛋白肽随废水排放浪费掉，部分生产厂家做简单的提取得粗的蛋白粉以饲料或生物发酵培养基的形式销售，附加值非常低。酶解法和碱解法相比具有收率高、杂蛋白含量相对较低、硫酸软骨素含量较高的优势，但是也不是最理想的生产方法。
硫酸软骨素广泛的应用于药品、保健食品、化妆品以及食品等领域中，因为硫酸软骨素在临床上主要用于防治关节炎、治疗神经痛、关节痛、动脉硬化症、听觉障碍及肝炎等疾病，对冠心病、风湿性炎症，对降血脂、抗血栓、抗肿瘤及伤口愈合等具有良好的疗效。还可以做为滴眼剂来使用。硫酸软骨素做为保健食品、食品、食品添加剂除了具有以上功效以外还具有食品的乳化、祛除异味的效果。硫酸软骨素用作化妆品可以调节皮肤细胞代谢、促进营养物质的吸收、对皮肤保湿以及改善发质。
胶原蛋白是一种在动物体内含量最丰富的功能性蛋白质。占蛋白质总含量的33%左右。胶原蛋白主要分布在皮肤、软骨、肌腱、腺体、骨骼等器官中。美国fda将胶原蛋白肽归类为最高安全等级目录（gras）内。可见其安全性非常高。胶原蛋白肽具有非常好的水溶性、分散性、营养性、易消化吸收、低过敏性。胶原蛋白肽在食品中的应用：预防性保健食品，降血压食品，补钙食品，美容，延缓衰老类保健食品，胶原蛋白肽应用于镇静的保健食品中。市场中高端补钙产品、美容产品、治疗骨关节炎的保健食品中都有胶原蛋白肽。市场上已经出现了以胶原蛋白肽为主的固体功能性饮料，乳制品里面也添加胶原蛋白肽。胶原蛋白肽促进皮肤胶原代谢、快速止血、降低血清中胆固醇含量等方面的生理功能，是食品和医药领域重要的添加剂。
随着硫酸软骨素和胶原蛋白肽的生物活性不断被发现以及在各个领域的应用不断的被扩展，有关硫酸软骨素和胶原蛋白肽的提取、纯化、分离技术已经取得很大的研究成果。其生产提取技术同样需要改进和完善。尤其是把硫酸软骨素和胶原蛋白肽分开来获得并不是先水解到同一溶液再进行分离获得。目前硫酸软骨素生产厂家采用酶解法生产成本比较高，产率和纯度相对碱解法有所提高，但生产方法不是最理想的（产品收率相对软骨本身的含量）。
技术实现要素：
本发明为了克服现有技术的缺陷、解决上述技术问题之一所采用的技术方案是：利用动物软骨分别提取硫酸软骨素和胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述方法为：先采用乙酸抽提方的法从动物软骨中提取硫酸软骨素，再从剩余的软骨中提取胶原蛋白肽。
优选地，所述方法包括如下步骤：
（1）将动物软骨投入到反应釜中，加入纯化水；调节料液温度35-40℃，用乙酸调节料液的ph值4-6进行抽提5-10小时（抽提过程中保持ph值不变）；将抽提液放出用板框式过滤机过滤得抽提液a；向反应釜中再次加入纯化水，调节料液的温度40-60℃，用naoh调节料液ph值8-9，加入酶1进行酶解（酶解过程中保持ph值不变）4-6小时，酶解结束后调节料液温度50-60℃，用naoh调节料液的ph值5.5-6.5加入酶2进行酶解（酶解过程中保持ph值不变）1-3小时，酶解结束，调节料液的ph值4-6后升温70-90℃使酶解所用的酶灭活；静止1-5小时，用板框式过滤机进行过滤得酶解液b；
（2）硫酸软骨素的制备方式：
（2a）将步骤（1）中所得抽提液a进行超滤浓缩后用乙醇进行沉淀得到一次沉淀硫酸软骨素；
（2b）将步骤（2a）中所得一次沉淀硫酸软骨素用氯化钠（食用级）溶液溶解，调节溶液ph值10-12，将溶液升温40-50℃，加入双氧水（双氧水的浓度为1-4%）静止4-6小时；
（2c）将步骤（2b）中静止后溶液用板框式过滤机过滤，滤液用乙醇沉淀、脱水、干燥即得硫酸软骨素成品；
（3）胶原蛋白肽的制备方式：
（3a）将步骤（1）中所得酶解液b的温度调节到50-70℃；加入活性炭粉末（活性碳重量：酶解液体积=10-20g:1l），用盐酸调节料液ph值4-6，反应1-4小时；
（3b）将步骤（3a）中所得料液用板框式过滤机过滤，滤液用纳滤机纳滤，纳滤结束后，双效浓缩器再次浓缩得浓缩液；
（3c）将步骤（3b）中所得浓缩液用巴氏消毒法灭菌后喷雾干燥（喷雾设备的进风温度220±5℃，出风温度100±5℃）即得食品级胶原蛋白肽。
优选地，步骤（1）中所述处理为将动物软骨投入到反应釜中，软骨和纯化水的比例为1：1kg/l（动物新鲜软骨）或1:8kg/l（动物干软骨）；调节料液温度为35-40℃，优选37±0.5℃；调节料液的ph值4-6，优选为4.5±0.2；抽提5-10小时，优选为8小时。
优选地，步骤（1）中所述处理为抽提结束后调节料液的温度40-60℃，优选为50±2℃下调节溶液的ph值为8-10，优选为9.5±0.2；酶解时间为4-6小时，优选为5小时。
优选地，所述naoh溶液的质量浓度为10-50%，优选为20%。
优选地，步骤（1）中所述处理为第一次酶解结束后调节料液温度50-60℃，优选为55±2℃；用盐酸调节料液的ph值为5.5-6.5，优选为6±0.2；酶解1-4小时，优选为1.5小时；酶解结束后调节料液的ph值4-6，优选为4.5±0.2。
优选地，所述盐酸溶液的质量浓度为8-30%，优选为15%。
优选地，步骤（1）中所述处理为酶1为碱性蛋白酶，用量为1-5‰（以软骨的重量计算），优选为2‰；酶2为风味蛋白酶用量为1-3‰（以软骨的重量计算），优选为1.5‰。
优选地，步骤（1）中所述升温为升温至70-90℃。优选为80±2℃。
优选地，所述静止1-5小时，优选为3小时。
优选地，步骤（2）中（2a、2c）步骤所述处理为：醇沉在沉淀釜中进行。
优选地，沉淀时使用乙醇浓度为≥90%，优选地用边搅拌边加入乙醇的方式。
优选地，沉淀时乙醇混合液的的乙醇浓度为60-80%，优选为68±0.5%。
优选地，步骤（2）中（2b）步骤所述处理为：氯化钠溶液浓度为1-3%，优选为1.5%；调节溶液的ph值10-12，优选为10.5±0.2；溶液温度为40-50℃，优选为48±2℃；双氧水的浓度为1-4%，优选为3%。氧化时间为4-8小时，优选为6小时。
优选地，步骤（2）中（3a）步骤所述处理为：酶解液b的温度调节为50-70℃，优选为60±2℃；盐酸调节料液ph值4-6，优选为4.5±0.2；加入活性炭的量为:活性碳重量：酶解液体积=10-20g:1l，优选为15g:1l，加入活性炭反应1-4小时，优选为1小时。
本发明的有益效果体现在：本发明提供了一种全新的方法（乙酸抽提法-酶解法，即：先用乙酸抽提法先提取硫酸软骨素，再用酶解法提取胶原蛋白肽），从动物软骨中提取硫酸软骨素和胶原蛋白肽，能有效的降低成本，提高产品的收率、纯度（纯度可达99%，蛋白含量≤2%）、品质、提高效益；并减少环境污染。
本发明通过技术革新，采用新的生产方法。先低温生产硫酸软骨素，再通过两种酶对料液实施分段酶解技术来生产胶原蛋白肽。实现了硫酸软骨素和胶原蛋白肽分开生产并结合各自的提取工艺超滤、精制、醇沉，纳滤、灭菌、喷雾干燥等先进的生产技术。通过独自的生产方法增加了产品的收率，利润空间增加，经济效益增加，能源消耗降低，污水的排放量降低，降低污水处理费用并降低环境污染的问题。
本发明通过技术改进，采用分开提取的方法，制备方法工艺简单可行，生产的硫酸软骨素颜色洁白，主要杂质蛋白质含量非常低≤2%。硫酸软骨素的纯度非常高达到99%以上；再生产的胶原蛋白肽口感非常好，颜色洁白，胶原蛋白肽的含量非常高。杂质含量非常低，各类重金属符合国家药品食品、标准。
本发明制备的硫酸软骨素可用于治疗心脑血管疾病、关节疼痛、关节炎、滴眼液及保健食品和食品等中；
本发明制备的胶原蛋白肽主要用于保健食品、降血压食品、补钙食品，美容、延缓衰老类保健食品，胶原蛋白肽促进皮肤胶原代谢、快速止血、降低血清中胆固醇含量等方面的生理功能，是食品和医药领域重要的添加剂。
具体实施方式
为了便于理解本发明，结合实施例和对比例对本发明作进一步的说明。本领域技术人员应该明了，下述说明仅仅是为了理解、解释本发明，并不对其内容进行限定。
具体方案为：
一：硫酸软骨素的制备方法
（1）乙酸抽提
将动物软骨投入反应釜中，加纯化水（软骨和纯化水的比例为1：1kg/l（动物鲜软骨）或1:8kg/l（动物干软骨）），调节料液的温度为37±0.5℃，用乙酸调节料液ph值为4.5±0.2，抽提8小时（抽提过程中始终保持料液的ph值4.5±0.2）。结束后抽提液用板框式过滤机过滤，收集滤液为抽提液a。
（2）浓缩醇沉
将步骤（1）中抽提液a用超滤机超滤浓缩，滤液转移到醇沉釜中，加入乙醇（浓度≥90%）进行醇沉，最后乙醇混合液的浓度是68±0.5%，醇沉体系静止过夜。
（3）溶解精制
将步骤（2）中醇沉体系中的上清液转移到乙醇回收处，向沉淀物中加入氯化钠溶液（浓度为1.5%，m/v），将沉淀物完全溶解并转移精致釜中，升温48±2℃，用20%的naoh溶液调节料液的ph值10.5±0.2，加入双氧水（双氧水的浓度在溶液中的浓度为3%）。静止6小时。
（4）二次醇沉
将步骤（3）中精制完成的溶液用板框式过滤机过滤，滤液转移至二次醇沉釜中，加入乙醇（浓度≥90%）进行醇沉，乙醇混合液的浓度是68±0.5%，醇沉体系静止过夜。
（5）脱水、干燥
将步骤（4）中醇沉体系中上清液转移至乙醇回收处，先将沉淀物脱水，再在90±2℃环境下干燥既得硫酸软骨素。
二：胶原蛋白肽的制备方法
（6）酶解、过滤
向步骤（1）中剩余软骨中加入规定量的纯化水，升温至50±2℃,用20%的naoh溶液调节ph值9.5±0.2，加入2‰碱性蛋白酶（以软骨的重量计算）酶解5小时（酶解过程中保持ph值不变）。酶解结束后再次调节温度为55±2℃，用20%的naoh调节ph值6.0±0.2，加入1.5‰风味蛋白酶（以软骨的重量计算），酶解1.5小时（酶解过程中保持ph值不变）。酶解结束调节ph值4.5±0.2，升温80±2℃，静止3小时。静止结束，用板框式过滤机过滤得酶解液b。
（7）活性炭吸附
将步骤（6）中酶解液b转移到反应釜中，调节温度60±2℃，用盐酸调节ph值为4.5±0.2。加入活性炭（活性碳重量：酶解液体积=15g:1l）反应1小时。反应结束后用板框过滤机过滤并收集滤液。
（8）纳滤
将步骤（7）中滤液用纳滤机（纳滤膜为300da）进行纳滤,当滤出液的电导率≤200μs/cm时，纳滤结束。
（9）双效、灭菌
将步骤（8）中的截留液通过双效浓缩器浓缩，浓缩到料液浓度为≥350g/l停止双效浓缩，得浓缩液。
（10）灭菌
将步骤（10）中的所得浓缩液巴氏灭菌法灭菌处理，得无菌浓缩液。
（11）干燥
将步骤（10）中所得无菌浓缩液喷雾干燥（喷雾设备的进风温度220℃，出风温度100℃）既得食品级胶原蛋白肽。
实施例1
一种利用动物软骨分别生产硫酸软骨素和胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）软骨处理：将4500kg鲜牛鼻骨投入到10000l的反应釜中，加纯化水，至9000l，将料液的温度调节到36.9℃。
（2）用乙酸调整料液的ph值4.5，在36.9℃下抽提8小时（抽提过程中用乙酸维持ph值为4.5±0.2），抽提结束，转移抽提液并用板框式过滤机过滤得抽提液，抽提液进入下一个工序。剩余的软骨进入另一个工序。
抽提液的处理：
（2a）将抽提液用超滤机超滤浓缩至滤液体积为抽提液体积的1/4时停止浓缩，将滤液液转移到醇沉釜中，开启搅拌加入乙醇（浓度为92.6%）至醇沉体系中乙醇的浓度为68.2%。静止过夜。将醇沉混合体系中上清乙醇转移至乙醇回收处，得到一次沉淀硫酸软骨素。
（2b）将一次沉淀硫酸软骨素用1.5%的氯化钠溶液溶解，通过调节调节氯化钠溶液的量使硫酸软骨素的浓度在11%。用20%的naoh溶液调节溶液的ph值为10.6，调节溶液温度为48.5℃，加入双氧水（双氧水浓度为溶液浓度的3%），静止6小时。
（2c）将静止结束后的溶液用板框式过滤机过滤，滤液转移到醇沉釜中，开启搅拌，加入乙醇（浓度为92.6%）至醇沉体系中乙醇的浓度为68.2%。室温静止过夜。将醇沉混合体系中上清乙醇转移至乙醇回收处，得到二次沉淀硫酸软骨素。
（2d）将二次沉淀物用乙醇（浓度为92.6%）进行脱水，脱水三次。将沉淀物离心干燥既得硫酸软骨素。
（3）向步骤（2）中剩余的软骨再次加入纯化水并升温51.2℃，调整ph值为9.6，加入9kg碱性蛋白酶酶解5小时；再次调整温度为56.5℃，调整ph值为6.0，加入6.75kg风味蛋白酶酶解1.5小时，调整ph值4.5，升温至80.6℃，静止3小时。静止结束后用板框式过滤机过滤得酶解液。
（4）将酶解液转移到反应釜中，调节温度为60.8℃，调节ph值为4.6，加入135kg的活性炭吸附，吸附1小时。吸附结束后用板框式过滤机进行过滤并将滤液转移至纳滤釜中。用纳滤机（纳滤膜为300da）进行纳滤。测量纳滤滤出液的电导率186μs/cm时，纳滤结束。
（5）将纳滤滤液用双效浓缩器浓缩，浓缩到物料的浓度为376g/l。停止浓缩得浓缩液。
（6）用巴氏消毒法将浓缩液灭菌，开启并调节喷雾设备的进风温度223℃，出风温度102℃喷雾干燥得胶原蛋白肽。
（7）两种生产工艺所得产品对照表（见下表1）：
实施例2
一种利用动物软骨分别提取硫酸软骨素和胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）软骨处理：将4500kg鲜猪鼻骨投入到10000l的反应釜中，加纯化水，至9000l，。
（2）将料液温度调节为36.8℃，用乙酸调节料液ph值4.4，抽提8小时（抽提过程中用乙酸维持ph值4.5±0.2），抽提结束，转移抽提液用板框式过滤机过滤得抽提液，并进入下一个工序。剩余的软骨进入另一个工序。
抽提液的处理：
（2a）将抽提液用超滤机进行超滤浓缩至滤液体积为抽提液体积的1/4时停止浓缩，将滤液转移到醇沉釜中，开启搅拌加入乙醇（浓度为93.1%）至醇沉体系中乙醇的浓度为68.2%。静止过夜。将醇沉混合体系中上清乙醇转移至乙醇回收处，得到一次沉淀硫酸软骨素。
（2b）将一次沉淀硫酸软骨素用1.5%的氯化钠溶液溶解，通过调节调节氯化钠溶液的量使硫酸软骨素的浓度为10%。用20%的naoh溶液调节溶液ph值为10.6，调节溶液温度为48.1℃，加入双氧水使双氧水浓度为溶液浓度的3%，静止6小时。
（2c）将静止结束后溶液用板框式过滤机过滤，滤液转移到醇沉釜中，开启搅拌，加入乙醇（浓度为93.1%）至醇沉体系中乙醇的浓度为67.8%。静止过夜。将醇沉混合体系中上清乙醇转移至乙醇回收处，得到二次沉淀硫酸软骨素。
（2d）将二次沉淀硫酸软骨素用乙醇（浓度93.1%）进行脱水，脱水三次。将沉淀硫酸软骨素离心干燥即得硫酸软骨素。
（3）向步骤（2）中剩余的软骨再次加入纯化水并升温至51.0℃，调节ph值为9.7，加入9kg碱性蛋白酶酶解5小时（酶解过程中保持料液ph值为9.5±0.2）；再次调节温度为56.5℃，调节ph值为6.0，加入6.75kg风味蛋白酶酶解1.5小时（酶解过程中保持料液ph值为6.0±0.2），调节料液ph值4.4，升温至80.5℃，静止3小时。静止结束后用板框式过滤机过滤得酶解液。
（4）将酶解液转移到反应釜中，调整温度为61.0℃，调整ph值为4.5，加入135kg活性炭反应1小时。反应结束后用板框式过滤机过滤并将滤液转移至纳滤釜中。用纳滤机（纳滤膜为300da）纳滤浓缩。当纳滤滤出液的电导率192μs/cm时，纳滤结束。
（5）将纳滤滤液用双效浓缩器进行浓缩，浓缩到物料的浓度为367g/l。停止浓缩液。
（6）用巴氏消毒法将浓缩液灭菌，开启并调节喷雾设备进风温度220℃，出风温度103℃喷雾干燥得胶原蛋白肽。
（7）两种生产工艺所得产品对照表（见下表2）：
实施例3
一种利用动物软骨分别提取硫酸软骨素和胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）软骨处理：将4500kg新鲜鲨鱼末骨投入到10000l的反应釜中，加纯化水，至9000l。
（2）将料液的温度调节为37.1℃，用乙酸调节料液的ph值4.6，抽提8小时（抽提过程中保持料液的ph值为4.5±0.2），抽提结束，转移抽提液并用板框式过滤机过滤得抽提液，进入下一个工序。剩余的软骨进入另一个工序。
抽提液的处理：
（2a）将抽提液用超滤机超滤浓缩至滤液体积为抽提液体积的1/4时停止浓缩，将滤液转移到醇沉釜中，开启搅拌加入乙醇（浓度为92.2%）至醇沉体系中乙醇的浓度为68.7%，静止过夜。将醇沉混合体系中上清乙醇转移至乙醇回收处，得到一次沉淀硫酸软骨素。
（2b）将一次沉淀硫酸软骨素用1.5%的氯化钠溶液溶解，通过调节氯化钠溶液的量使硫酸软骨素浓度是11%。用20%的naoh溶液调节溶液的ph值为10.7，调节溶液温度为48.4℃，加入双氧水（双氧水的浓度为溶液浓度的3%），静止6小时。
（2c）将静止结束后的溶液用板框式过滤机过滤，滤液转移到醇沉釜中，开启搅拌，加入乙醇（浓度为92.2%）至醇沉体系中乙醇的浓度为67.0%。静止过夜。将醇沉混合体系中上清乙醇转移至乙醇回收处，得到二次沉淀硫酸软骨素。
（2d）将二次沉淀硫酸软骨素用乙醇（浓度为92.2%）进行脱水，脱水三次。将沉淀硫酸软骨素离心干燥即得硫酸软骨素。
（3）向步骤（2）中剩余的软骨再次加入纯化水并升温51.4℃，调节ph值为9.6，加入9kg碱性蛋白酶酶解5小时（酶解过程中保持料液的ph值为9.5±0.2）；再次调节温度为56.0℃，调节ph值为5.9，加入6.75kg风味蛋白酶酶解1.5小时（酶解过程中保持料液的ph值为6.0±0.2），酶解结束调节料液ph值4.7，升温至80.1℃，静止3小时。静止结束后用板框式过滤机过滤得酶解液。
（4）将酶解液转移到反应釜中，调节温度为61.2℃，调节ph值为4.6，加入活性炭进反应1小时。反应结束后用板框式过滤机过滤并将滤液转移至纳滤釜中。用纳滤机（纳滤膜为300da）进行纳滤。当纳滤滤出液的电导率189μs/cm时，纳滤结束。
（5）将纳滤滤液用双效浓缩器浓缩，浓缩到物料的浓度为370g/l。停止浓缩液。
（6）用巴氏消毒法将浓缩液灭菌，调节喷雾设备进风温度218℃，出风温度101℃喷雾干燥得胶原蛋白肽。
（7）两种生产工艺所得产品对照表（见下表3）：
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中；对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。