一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统及其构建方法与流程

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种以在whnv衣壳vlps表面高效展示人禽流感病毒抗原的展示系统的构建方法，还涉及一种以在whnv衣壳vlps表面高效展示人禽流感病毒抗原的展示系统，该系统将为禽流感疫苗的研发打下基础，同时建立稳定高效的whnv异源多肽与蛋白展示系统将极大推动对其他新型疫苗及解毒剂的研发，具有相当的应用前景，极大推动生物医学的发展。

背景技术：

利用病毒衣壳vlps，在其表面展示异源多肽及蛋白抗原的表面展示技术，因其在研发广谱抗病毒疫苗，建立高效、通用性疫苗及药物研发平台方面的重要价值，成为目前国际生物医药研发的热点与前沿。在这一领域，国外科学家及制药公司投入了大量的兴趣与精力[kushnirnetal.2012；garcearletal.2004]。

近十几年来，噬菌体表面展示技术已被应用于分子生物学各个领域并推进了生命科学与生物医学的发展；然而，作为一种原核表达系统，其展示的抗原在翻译后修饰、蛋白质正确折叠等方面存在相当大的局限性，很难作为一个有效的疫苗开发平台。相比之下，在真核体系中制备的病毒衣壳表面展示系统使得复杂的翻译后修饰、糖基化等成为可能，从而尽可能保持异源抗原的正确构象及免疫原性。在这一方面，包括人乳头瘤病毒16型（hpv16）vlps、johnsongrassmosaicvirus（jgmv）vlps、hbvcore蛋白vlps等，均被用于多肽抗原的表面展示与疫苗研发[sadeyenjretal.2003；sainimetal.2003；stornitetal.2004]，2008年，加拿大科学家利用木瓜花叶病毒（papmv）的vlps，成功展示了h1n1流感病毒m2抗原的2-24位氨基酸多肽（m2e），并证明其对小鼠强毒株致死攻击具有良好的免疫保护作用，有可能成为开发流感病毒广谱疫苗的新方法[denisjetal.2008]，然而，这类病毒vlp表面展示技术也存在着局限性，大部分情况下仅能展示异源抗原的几个到几十个氨基酸的肽段，从而影响其完整的免疫原性，并在产生持久的免疫效果上有所欠缺[lópez-macíascetal.2012]。

近年来，野田村病毒科中的fhv因独特的衣壳空间结构特征，成为一种国际上广泛认可的新型高效表面展示系统及疫苗药物开发平台[destitogetal.2009；venterpaetal.2008；manayanidjetal.2007]。野田村病毒是单链正义rna病毒，基因组全长约为4.6kb，包括rna1（3.1kb）和rna2（1.5kb）。其中rna2编码衣壳蛋白前体proα，在装配过程中180个拷贝的proα组装成t=3的正二十面体对称结构，经过自我切割后成为成熟的具有感染性的病毒粒子[venterpaetal.2008]，野田村病毒衣壳有一个中心的β桶状结构，这个结构的反平行链由几个大小和形状不同的裸露在表面的茎环连接。这个β桶状结构在所有的野田村病毒中都高度保守，但是表面的茎环结构（loop）却差别很大、且具有很强的柔韧性（flexibility）。因此，野田村病毒衣壳能够容忍较大的异源多肽或完整蛋白插入到这些茎环结构中，而病毒衣壳蛋白以及插入的异源多肽或蛋白的结构特征均不会有大的影响，从而能有效组装成展示具有天然构象抗原的vlps。同时，其vlps表面展示的抗原在正二十面体对称球形颗粒表面以高效价（180个衣壳蛋白拷贝）及高度有序化进行排列。这一特征使得抗原能够与b细胞受体高效结合，从而诱发更为快速而强烈的b细胞增殖及抗体产生。fhv衣壳蛋白包含6个茎环结构，目前在这些茎环中成功融合并展示到其vlps表面的异源多肽包括hiv包膜蛋白gp41、乙型肝炎病毒表面抗原hbsag124-147片段、丙型肝炎病毒e1蛋白315-328片段、flag蛋白标签、神经递质npy、流感病毒ha抗原a螺旋结构域等[destitogetal.2009；venterpaetal.2008；bachmannmfetal.1993；bachmannmfetal.1997；pengmetal.2005；schiappacassimetal.1997；burattieetal.1996；schneemannaetal.2012]，而成功展示的完整蛋白（或结构域）则包括松天蛾ω病毒（nωv）衣壳蛋白的免疫球蛋白类似结构域（14kda）及人炭疽热毒性受体antxr2（20kda）[manayanidjetal.2007]，这些研究成果发表在包括《journalofvirology》、《plospathogens》在内的多篇权威国际学术期刊上，并获得了多项美国及国际专利。其中，利用fhvvlps展示炭疽热毒性受体antxr2及流感病毒ha抗原a螺旋结构域的工作，是近期炭疽热解毒剂及高效疫苗、以及广谱流感病毒疫苗研发方面的重要或突破性进展[manayanidjetal.2007；schneemannaetal.2012]，展现了野田村病毒衣壳展示系统作为高效、高通用性疫苗及药物研发平台的重要价值。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统的构建方法，该方法易行，操作简便。

本发明的另一目的是在于提供了一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统，该系统的优点为：（1）该系统的主要组成部分武汉野田村病毒whnv基因组，其具有结构简单（4.6kb），便于体外的基因操作的特点，目前申请人已经建立了whnv的反式遗传操作系统，可直接用于异源多肽和蛋白展示系统的构建；（2）使用whnvvlp进行疫苗开发具有较高的生物安全性；（3）与传统的蛋白表面展示系统相比，whnv衣壳蛋白展示系统具有更高的异源蛋白拷贝数(180个拷贝)，这使得基于该系统构建的疫苗相比传统的疫苗制备方法能够引起更强烈的免疫反应，从而极大的提高了其医用价值；（4）与fhv蛋白展示系统相比，whnv衣壳蛋白的容量更大，茎环结构区域也更广，测定结果表明，whnv衣壳蛋白茎环结构域包含约24个可插入位点，这为筛选高效的疫苗和功能性中和解毒剂提供了广阔的空间；（5）whnv是发明人所在的研究室独立在我国发现的病毒，拥有其完整独立的知识产权，相比为美国所掌握的fhv展示系统，whnv展示系统更适应我国公共卫生及国防安全的需要；（6）武汉野田村病毒（whnv）作为异源多肽和蛋白展示系统在许多方面具有明显的优势。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统的构建方法，其步骤是：

（1）异源蛋白插入位点的确定：根据生物信息学手段分析whnv衣壳蛋白的结构，找出其中β桶状结构和表面茎环结构loop的位置区域，确定loop中适合插入异源多肽和蛋白的潜在位点；

（2）融合增强型绿色荧光蛋白（egfp）的whnv重组类病毒粒子（vlp）库的构建：对loop区域的插入位点两端添加一小段氨基酸序列作为连接子（linker），通过插入酶切位点等基因改造手段，构建可供方便操作的载体，将egfp通过以linker序列以及不以linker序列为介导的方式插入whnv衣壳蛋白中所有loop区域的可插入位点，构建两种融合方式的whnv重组vlp库，通过免疫荧光观察，蔗糖密度梯度离心，电镜观察等方法初步筛选出既能够展示正确构象的egfp，又保持病毒粒子正确组装的whnv重组vlp库，利用egfp作为报告基因，获得插入异源蛋白后不会影响其结构和抗原性并能形成类病毒粒子的稳定系统；

（3）融合人禽流感病毒h5抗原蛋白50-204位氨基酸的whnv重组vlp库的构建：在所述的步骤（2）中使用egfp初步筛选出合适的候选插入位点的基础上，结合生物信息学分析，进一步筛选可插入位点，同样将人禽流感病毒h5抗原蛋白50-204氨基酸结构域通过以linker序列以及不以linker序列为介导的方式插入可插入位点，构建融合人禽流感病毒h5抗原蛋白50-204氨基酸结构域的whnv重组vlp库，运用电镜技术以及免疫反应活性实验筛选出能够正确折叠的并且具有高免疫活性的vlp；

（4）whnv展示系统的建立：结合所述的步骤（3）中的结果，通过对不同细胞系、培养基、培养条件的摸索，优化重组vlp的表达系统，对优化后的重组vlp进行免疫反应活性实验，并初步对其作为可能的新型疫苗进行评测，通过所述的步骤（2）与所述的步骤（3）的筛选，进一步确定whnvloop上可插入位点，结合优化的重组vlp表达系统，建立稳定的whnv异源多肽和蛋白展示系统。

所述的步骤（2）、步骤（3）中的linker序列为“gly4-ser-gly4”。

通过上述几个步骤的技术措施，最关键的是步骤1：进行了whnv衣壳蛋白表面茎环位置的预测，选择了5个插入位点；之后又改进了linker肽段，使得egfp蛋白筛选顺利进行，得到了可以表面展示人禽流感病毒h5抗原蛋白50-204氨基酸结构域的病毒vlps，构建融合人禽流感病毒h5、n1及m1抗原的重组vlp库，并筛选出既能够表面展示人禽流感病毒抗原，又能保持vlps正确组装的重组vlps。

一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统，包括：（1）武汉野田村病毒whnv衣壳，（2）作为异源蛋白插入whnv衣壳蛋白中的融合蛋白，（3）连接子linker，其特征在于：在所述的融合蛋白的n端与c端分别添加小段氨基酸序列作为linker与whnv衣壳连接。

进一步的，所述的融合蛋白为增强型绿色荧光蛋白egfp。

进一步的，所述的小段氨基酸序列为“gly4-ser-gly4”。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

（1）建立了一种以whnv病毒衣壳vlps为基础，在其表面展示异源多肽及蛋白抗原的表面展示技术，本发明以whnv衣壳蛋白茎环结构域包含约24个可插入位点，为筛选高效疫苗提供了广阔的空间；以昆虫病毒vlps作为展示系统不存在生物安全性的问题，可行性强；与传统vlp表面展示系统相比，whnv衣壳展示系统具有更高的异源抗原拷贝数(180~540个拷贝)，并且可以展示较大的完整蛋白或结构域，这使得基于该系统构建的疫苗相比传统的疫苗制备方法能够引起更强烈的免疫反应，从而极大的提高了其医用价值；

（2）利用重组whnvvlps展示人禽流感病毒抗原，将有望开发出高效安全的h5n1人禽流感病毒vlps疫苗；使用昆虫细胞制备生产vlps疫苗，可以克服禽流感流行对生产传统疫苗所需的鸡胚产量的威胁；

（3）昆虫细胞表达体系安全，不含哺乳动物病原微生物，无致癌性，适于疫苗的生产；

（4）在h5n1疫苗研发成功的基础上，可以在较短的时间完成流感病毒新毒株疫苗的研发，建立通用性的流感疫苗研发平台；

（5）whnv异源多肽和蛋白抗原展示系统的建立与优化，为其在疫苗及靶向药物研发等多个领域中的应用打下了坚实的基础。

附图说明

图1为一种武汉野田村病毒whnv衣壳蛋白核心区域三维结构预测示意图。

图2为一种荧光显微镜观察融合egfp的病毒类似粒子示意图。

图3为一种荧光显微镜观察带有linker的融合egfp的病毒类似粒子示意图。

图4为一种插入禽流感病毒抗原的cp蛋白结构预测示意图。

图5为一种野生型和重组whnv衣壳蛋白的真核表达及蔗糖密度梯度离心纯化示意图。

图6为一种插入型vlps的电镜观察示意图。将重组衣壳蛋白样品磷钨酸负染后进行电镜观察，发现重组衣壳蛋白能够正确组装成插入型vlps。

具体实施方式

实施例1：

一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统的构建方法，其步骤是：

1、武汉野田村病毒whnv衣壳蛋白三维结构的预测：运用蛋白质数据库（proteindatabank，简称pdb），swi（swiss-model是一项预测蛋白质三级结构的服务，它利用同源建模的方法实现对一段未知序列的三级结构的预测，采用一系列工作软件，从经典的布鲁克海文蛋白质结构数据库（brookhavenpdb）中提取蛋白质查询序列的模拟结构信息，用具有蛋白质相似性的已知结构蛋白建立的未知结构蛋白的分子模型，具体为模板选择、目标序列模板序列比对、建模、能量最小化四个步骤）等多种不同的预测方法，对whnv衣壳蛋白三维结构进行预测，对预测结果进行拟合后发现：与fhv相似，whnv衣壳蛋白具有一个由7个β折叠结构组成的β桶状结构，并模拟出whnv衣壳蛋白的三维结构（图1），同时，确定了茎环位置，并初步分析了可以作为潜在异源蛋白插入位点的5个loop。

如图1所示，loop1包括武汉野田村衣壳蛋白127-134位氨基酸，loop2包括143-155位，loop3包括179-185位，loop4包括188-199位，loop5包括207-214位。这些区域提供了大量的潜在外源蛋白插入位点，为筛选具有高免疫原性的重组vlps提供了基础。

2、利用免疫荧光技术对融合增强型绿色荧光蛋白（egfp）的whnvvlp库进行筛选：在步骤（1）预测出可插入位点的基础上，利用插入egfp的方法，初步筛选出5个（loop1131-132、loop2148-149、loop3180-181、loop4191-192、loop5209-210）可以使插入的蛋白展示其天然构象的位点。

如图2所示，将egfp插入loop1中的氨基酸131-132区域以及loop4中的氨基酸191-192区域都能检测出荧光信号，而其它融合egfp的vlps的荧光信号几乎检测不到，说明插到这几个位点影响了egfp的结构与功能（展现绿色荧光）。

3、初步检验可提高茎环柔韧性及插入效率的连接子（linker）肽段在抗原展示中的作用，利用高柔韧性的linker肽段序列，可以进一步提高茎环结构的柔韧性及插入容量，帮助异源抗原展示其正确构象。

采用这一设计，通过在egfp两端添加linker序列，使得egfp在vlps表面可以获得更为自由的伸展空间，使之能够正确折叠从而展现更强的活性。

将一段氨基酸序列（gly4-ser-gly4）的肽段作为linker添加在egfp的n端与c端（图3a），然后将其分别插入loop2的148-149，loop3的180-181以及loop5的209-210。在图2中，这些没有添加linker的病毒类似粒子不能发生荧光，而加入了linker以后，通过荧光电镜观察，发明人发现插入到loop2的148-149与loop5的209-210均可以产生荧光信号，其中loop2的148-149位点的信号最强（图3b）。

因此，利用linker序列可以有效地保持异源蛋白在whnvvlps表面的天然构象。这为对linker肽段在whnvvlps展示系统的后续应用及优化打下了很好的基础。

4、预测融合禽流感病毒h5、n1及m1抗原的whnv衣壳蛋白的结构，运用生物信息学方法（同源模建），进一步预测融合禽流感病毒的一个或三个抗原后的whnv衣壳蛋白（cp）的三维结构。将拟插入的抗原氨基酸序列，按照软件（pdb）预测及前期筛选确定的插入位点整合进whnvcp的氨基酸序列中，应用穿线法（threading）及同源建模（swi，expdb：模板数据库，从pdb中提取高质量的数据文件组成、exnrl-3d：序列数据库，是expdb模板数据库中的序列部分，用于blastp2模板搜索。环状序列文库looplibrary：实验数据得到的无规则卷曲结构汇集。旋转异构体文库rotamerlibrary：用于非主干氨基酸的空间构型的确定）分析其整体结构。如图4a-c所示，在空间结构上，禽流感病毒的h5、n1或m1抗原完全可以插入cp的loop区域（h5插入loop1的131-132、n1插入loop2的148-149、m1插入loop1的131-132）中，并保持其正确折叠。此外，还预测了同时在三个不同loop区域插入三个禽流感病毒抗原的whnvcp蛋白的结构。如图4d所示，同时插入禽流感病毒的h5、n1和m1抗原后的cp也能够保持其正确的折叠。这一预测结果预示了在whnvvlps表面同时展示2-3种禽流感病毒抗原的可能性，有希望利用本展示系统开发高效人禽流感vlps疫苗。

5、插入外源h5抗原的重组vlps的纯化及电镜观察：发明人在whnvvlps表面插入了人禽流感病毒h5抗原蛋白50-204氨基酸结构域（为h5抗原核心结构域）。通过蔗糖密度梯度离心的方法，分离纯化了野生型（未插入）及插入以上抗原的whnvcp蛋白，经westernblot检测，条带大小与预期结果一致（图5）。将重组cp蛋白样品磷钨酸负染后进行电镜观察，发现重组衣壳蛋白能够正确组装成插入型vlps(图6)。上述的vlps纯化以及电镜观察为后续工作提供了良好的技术支持。

通过上述技术措施，有如下效果：

1）优化茎环柔韧性提高，插入效率的连接肽段（linker）序列设计；显著的提高了茎环结构的柔韧性及插入容量，帮助异源抗原展示其正确构象。

2)构建融合人禽流感病毒h5、n1及m1抗原的重组vlp库，并筛选了出既能够表面展示人禽流感病毒抗原，又能保持vlps正确组装的重组vlps；

3)利用冷冻电镜三维重构技术，对展示异源多肽或蛋白的whnvvlps进行结构分析；

4)优化展示人禽流感病毒抗原的whnvvlps的制备与提纯条件；

5)建立稳定的whnvvlps异源抗原展示系统，使之成为高效、通用性疫苗（及药物）研发的新技术平台。

实施例2：

一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统，包括：（1）武汉野田村病毒whnv衣壳，（2）作为异源蛋白插入whnv衣壳蛋白中的融合蛋白，（3）连接子linker，其特征在于：在所述的融合蛋白的n端与c端分别添加小段氨基酸序列作为linker与whnv衣壳连接。

进一步的，所述的融合蛋白为增强型绿色荧光蛋白egfp。

进一步的，所述的小段氨基酸序列为“gly4-ser-gly4”。