一种二化螟SDR基因及其编码的蛋白质和应用、dsRNA及其扩增的引物对和应用的制作方法

本发明属于昆虫基因工程技术领域，尤其涉及一种二化螟sdr基因及其编码的蛋白质和应用、dsrna及其扩增的引物对和应用。

背景技术：

二化螟chilosuppressalis(鳞翅目：螟蛾科)是一种重要的多食性农业害虫，主要危害水稻、茭白以及玉米等(周睿琦等，二化螟的水稻种群和茭白种群对杀虫剂和cry蛋白的敏感性比较[j].中国科技论文,2014,9(09):1075-1079)。近年来，随着水稻种植结构的变更、耕作制度的改革和密植高肥等栽培措施的推广、气候变暖等因素，二化螟在全国范围内的发生数量和危害程度明显上升，给我国的水稻生产造成严重威胁(srensenjgetal.massrearingofinsectsforpestmanagement:challenges,synergiesandadvancesfromevolutionaryphysiology[j].cropprotection,2012,38:87-94,2012；张扬等,二化螟抗药性检测方法比较和抗药性监测[j/ol].南京农业大学学报,2014,37(06):37-43)。目前对于二化螟的防治还是以施用化学杀虫剂为主，由于长期大量使用化学农药带来的环境压力以及抗药性等问题(唐涛,不同类型杀虫剂对水稻二化螟及稻纵卷叶螟的田间防治效果评价[j/ol].植物保护,2016,42(03):222-228)，开发和利用符合环保、健康、持续发展理念的无公害防治措施成为了当前的防治热点(maetal.,exploringthemidguttranscriptomeandbrushbordermembranevesicleproteomeofthericestemborer,chilosuppressalis(walker).plosone,2012,7:e38151)。

short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)在昆虫细胞中的主要功能是参与蜕皮激素的合成(ryusukeniwaetal.,non-moltingglossy/shroudencodesashort-chaindehydrogenase/reductasethatfunctionsinthe‘blackbox’oftheecdysteroidbiosynthesispathway.development,2010,137:1991-1999(2010))。sdr广泛存在于各种生物体中，是功能性很强的酶，在哺乳动物，植物，细菌以及昆虫中都起着不同的作用(kallberg,yetal.,short-chaindehydrogenases/reductases(sdrs)–coenzyme-basedfunctionalassignmentsincompletedgenomes,eur.j.biochem,2002,269:4409–4417)。目前在昆虫中有过报道的主要膜翅目目(karinaretal.,amemberoftheshort-chaindehydrogenase/reductase(sdr)superfamilyisatargetoftheecdysoneresponseinhoneybee(apismellifera)castedevelopment.apidologie,2004,35:37–47)，双翅目(benachetal.,genesisofdrosophilaadh:theshapingoftheenzymaticactivityfromasdrancestor,chem.biol.info,2001,130–132,405–415)，鳞翅目(ryusukeniwaetal.,non-moltingglossy/shroudencodesashort-chaindehydrogenase/reductasethatfunctionsinthe‘blackbox’oftheecdysteroidbiosynthesispathway.development,2010,137:1991-1999(2010)；hajimetakeuchietal.,regulationofecdysteroidsignalling:molecularcloning,characterizationandexpressionof3-dehydroecdysone3a-reductase,anoveleukaryoticmemberoftheshort-chaindehydrogenases/reductasessuperfamilyfromthecottonleafworm,spodopteralittoralis.biochem.j,2000,349:239-245)。

目前，对于昆虫中short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)的研究主要集中在其分子机理和作用上，对于sdr的应用方面的研究较少。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种二化螟sdr基因及其编码的蛋白质和应用、dsrna及其扩增的引物对和应用，本发明提供的二化螟sdr基因参与了二化螟的生长发育过程，该基因的缺失显著提高了二化螟幼虫的死亡率。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种二化螟sdr基因，所述二化螟sdr基因具有seqidno.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种上述技术方案所述的二化螟sdr基因编码的蛋白，所述蛋白具有seqidno.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了上述技术方案所述的二化螟sdr基因的缺失在提高二化螟死亡率中的应用。

本发明还提供了一种上述技术方案所述的二化螟sdr基因的dsrna，所述dsrna具有seqidno.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述技术方案所述的dsrtna在抑制二化螟sdr基因的表达中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的dsrna在制备转基因抗二化螟植物中的应用。

优选的，所述应用包括：将所述dsrna导入植物表达载体中，再导入植物中，得到转基因抗二化螟植物。

本发明还提供了一种扩增上述技术方案所述的dsrna的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物；

所述上游引物具有seqidno.4所示的核苷酸序列；

所述下游引物具有seqidno.5所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种二化螟sdr基因及其编码的蛋白质和应用、dsrna及其扩增的引物对和应用，所述二化螟sdr基因具有seqidno.1所示的核苷酸序列。本发明提供的二化螟sdr基因参与了二化螟的生长发育过程，该基因的缺失显著提高了二化螟幼虫的死亡率。在本发明中，所述二化螟sdr基因的dsrna抑制二化螟sdr基因的表达。

本发明的有益效果为：

(1)本发明首次发现short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)基因参与了二化螟的生长发育过程，short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)表达的缺失显著提高了二化螟幼虫的死亡率，最终抑制种群的发展。

(2)本发明提供了一种二化螟short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)基因的干扰序列(dsrna)，该序列可显著抑制short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)基因的表达，可利用该序列干扰short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)基因的表达，抑制二化螟的生长，最终控制其种群的发展。可用于开发绿色环保的抗虫植物，最终达到绿色防治害虫的目的。

(3)利用基因工程技术，可以将干扰序列导入植物表达的载体，然后导入植物细胞或植物中，可以获得抗虫的转基因细胞和转基因植株。

附图说明

图1为short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)基因功能验证流程图；

图2为peasy-t1克隆载体结构示意图；

图3为pet-2p表达载体结构示意图；

图4为饲喂sdr基因的dsrna后，二化螟sdr基因的沉默效率，其中“*”表示p<0.05；“**”表示p<0.01；“***”表示p<0.001，图中英文缩写含义：“sdr”表示饲喂sdr基因dsrna的处理组；“egfp”表示饲喂egfp基因dsrna的对照组；“h2o”表示饲喂ddh2o的对照组；

图5为饲喂sdr基因的dsrna对二化螟幼虫死亡率的影响；其中“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01，图中英文缩写含义：“sdr”表示饲喂sdr基因dsrna的处理组；“egfp”表示饲喂egfp基因dsrna的对照组；“h2o”表示饲喂ddh2o的对照组。

具体实施方式

本发明提供了一种二化螟sdr基因，所述二化螟sdr基因具有seqidno.1所示的核苷酸序列，具体序列如下：

atgaaaacaattctaattactggtgctaatagaggcttgggtctgggaatggttaagtatctaaccagacagggcagagccgaaaaaatcattgctacatgccgaaaaccttcagaggaactagaaaaaattgctcaagaatcaaacaaactacaaatagtacatttagatgtcacagatttggctagttacggtgacgtgacaactaaaattgccaacgcagtaggcagctccggtctcaatttactcattaacaacgctggaatcgcaacaaaattcactaaactcaatttggtgaaagctgagcagctgctagaaaacctcacagtcaacaccgtcgcaccgataatgctaaccaagtcgatgctgccgctgctgaagcaagccgcggaggcgaacagcagctcgccggtgggcgcagcgcgcgccgccgtcatcaacatgagctccgtgctcggctccatcgcgcagaacgaccagggtggcttctacccctacaggtgttctaaggccgcattgaacgcagcgaccaaatcaatgagcatagacctgaagaaggagcacatactggtggcgtcgatacaccccggctgggttcgcaccgacatgggcggcaagggcgcgccgctcgacgtggtcaccagcgtcgagagcatattcgaaaccatagagaagctgggcgaggcagattcgggcaagttcctgcagtacgacggcgctgagctaccgtggtga。

在本发明中，所述二化螟sdr基因参与了二化螟的生长发育过程，该基因的表达缺失显著提高了二化螟幼虫的死亡率，最终抑制二化螟种群的发展。

本发明还提供了上述技术方案所述的二化螟sdr基因编码的蛋白，所述蛋白具有seqidno.2所示的氨基酸序列，具体序列如下所示：

mktilitganrglglgmvkyltrqgraekiiatcrkpseelekiaqesnklqivhldvtdlasygdvttkianavgssglnllinnagiatkftklnlvkaeqllenltvntvapimltksmlpllkqaaeanssspvgaaraavinmssvlgsiaqndqggfypyrcskaalnaatksmsidlkkehilvasihpgwvrtdmggkgapldvvtsvesifetieklgeadsgkflqydgaelpw。

在本发明中，所述二化螟sdr基因编码的蛋白的分子质量为59.756kd，等电点为5.10。

本发明还提供了上述技术方案所述二化螟sdr基因的缺失在提高二化螟死亡率中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的二化螟sdr基因的dsrna，所述dsrna具有seqidno.3所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：

ccgataatgctaaccaagtcgatgctgccgctgctgaagcaagccgcggaggcgaacagcagctcgccggtgggcgcagcgcgcgccgccgtcatcaacatgagctccgtgctcggctccatcgcgcagaacgaccagggtggcttctacccctacaggtgttctaaggccgcattgaacgcagcgaccaaatcaatgagcatagacctgaagaaggagcacatactggtggcgtcgatacaccccggctgggttcgcaccgacatgggcggcaagggcgcgccgctcgacgtggtcaccagcgtcgagagcatattcgaaaccatagagaagctgggcgaggcagattcgggcaagttcctgcagtacgacggc。

本发明还提供了上述技术方案所述的dsrna在抑制二化螟sdr基因的表达中的应用。在本发明中，所述dsrna片段能够抑制二化螟sdr基因的表达。

本发明还提供了上述技术方案所述的dsrna在制备转基因抗二化螟植物中的应用。在本发明中，所述应用优选包括：将所述dsrna导入植物表达载体中，再导入植物中，得到转基因抗二化螟植物。本发明对所述植物表达载体没有特殊限定，采用常规即可。本发明对所述将dsrna导入植物表达载体的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。本发明对所述植物的品种没有特殊限定，采用常规植物即可，如水稻。本发明对所述植物表达载体导入植物的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。

本发明还提供了一种扩增上述技术方案所述的dsrna的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物；所述上游引物具有seqidno.4所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：

tggaattcccgataatgctaaccaagtcgatg；

所述下游引物具有seqidno.5所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：

tgaattcgccgtcgtactgcaggaa

本发明优选用http://sidirect2.rnai.jp/在线预测sirna位点，根据sirna位点用https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？link_loc＝blasthome在线合成扩增dsrna的引物。

本发明还提供了上述技术方案所述的dsrna编码蛋白在制备防治二化螟的药物中的应用。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用常规剂型即可。本发明对所述药物的使用方法和使用剂量没有特殊限定，采用常规即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

二化螟short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)基因的克隆与分析

1.二化螟总rna的提取：称取20mg的二化螟样品置于1.5ml无酶管中，利用一次性无酶研磨棒及液氮充分研磨后，使用promega公司的svtotalrnaisolationsystem提取试剂盒提取总rna，详细步骤参照该试剂盒说明书。

2.cdna的合成：使用宝生物工程大连有限公司的primescripttmrtmastermix反转录试剂盒将上述1中提取的总rna合成cdna模板(详细步骤参照该试剂盒说明书)。

3.引物设计：利用转录组测序得到short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)基因核酸序列(见seqidno：1)，设计引物验证预测的开放阅读框。设计并合成如下引物：

上游引物序列sdr-f(seqidno.6)：

5'-atgaaaacaattctaattactggtgcta-3'；

下游引物序列sdr-r(seqidno.7)：

5'-tcaccacggtagctcagcg-3'。

以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

4.pcr扩增：利用上述引物sdr-f和sdr-r进行pcr扩增，pcr体系参照宝生物工程大连有限公司的extaq酶使用说明书。pcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸2min，38个循环；72℃延伸10min。扩增完毕后，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶并利用axygen公司的的dna凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。

5.pcr产物的克隆：利用transgen公司的的peasy-t1simplecloningkit，按照说明书将pcr产物连接到peasy-t1载体(见图2)上，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞中，筛选阳性克隆子送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

序列分析：利用ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)将测序所得的heatshockproteins(hsps)基因核苷酸序列与转录组测序所得的核苷酸序列比对验证其正确性，结果显示，测序结果一致。利用expasy(http://web.expasy.org/translate/)预测并分析该基因的蛋白序列(见seqidno.2)，结果显示，sdr-r基因开放阅读框架全长735bp，编码244个氨基酸残基，预测分子质量为59.756kd，理论等电点为5.10。本发明进一步将其与其它昆虫的short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)氨基酸序列进行比对，确认本发明分离的蛋白具有典型的short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)蛋白特征。

实施例2

dsrna合成

1.dsrna模板的制备：

根据实施例1中所获得的short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)基因序列，通过sidirectversion2.0预测dsrna区域，并利用ncbiprimer-blast

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？link_loc＝blasthome)设计特异性扩增引物(5'-端加上适当的酶切位点)，用于heatshockproteins(hsps)基因的dsrna片段(seqidno.3)的扩增，设计的特异性引物如下：

上游引物序列dssdr-f(seqidno.4)：

tggaattcccgataatgctaaccaagtcgatg

下游引物序列dssdr-r(seqidno.5)：

tggaattcgccgtcgtactgcaggaa。

注：划线部分系列为ecori酶切位点

利用上述引物dssdr-f和dssdr-r进行pcr扩增，pcr反应体系参照宝生物工程大连有限公司的extaq酶使用说明书。

pcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸2min，38个循环；72℃延伸10min。扩增完毕后，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶并利用axygen的dna凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。最后通过ta克隆将其连接到peasy-t1载体(见图2)上。

2.表达载体构建

1)利用axygen的axyprepplasmidminiprepkit试剂盒提取含有目的片段的质粒并酶切。

酶切，试剂按照表1体系配制：

表1酶切体系

37℃反应30min，85℃反应5s以终止反应。1.2％琼脂糖凝胶电泳切下目的片段并回收。

2)酶切的目的片段与pet-2p载体的连接反应体系按照表2顺序配制：

表2连接体系

重组载体转化入感受态细胞ht115的过程：将ht115从-80℃超低温冰箱中取出至于冰上融化5min，然后将连接产物用移液枪加入到ht115感受态细胞中，轻轻吸打混匀，冰上放置30min，然后于42℃水浴热激45s，再于冰上复苏2-3min，加入已灭菌的lb液体培养基至1ml，然后于37℃、150rpm摇床培养1h。取200μl菌液均匀涂布在卡那霉素抗性的lb培养基平板上，37℃倒置过夜培养。隔天挑取圆润饱满的单菌落，在卡那霉素抗性的lb液体培养基中扩大培养，将新鲜菌液于-80℃保存在30％已灭菌的甘油中，备用。

实施例3

饲喂short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)基因的dsrna后基因的沉默效率及其对二化螟生长发育的影响。

取100ml大肠杆菌中表达好的菌液，5000rpm离心5min，弃上清，用5ml(20:1)ddh2o悬浮菌液沉淀，4℃冰箱保存待用或直接用于饲喂实验。

1)提前两天用脱脂棉加水浸泡水稻种子mh63，饲喂实验时种子发芽。

2)用浓缩后的菌液均匀涂抹水稻种子，将三粒mh63水稻种子置于u形管中并保持环境湿润，取30头二化螟初孵幼虫接种于每个u形管中，饲喂二化螟幼虫72h。每个饲喂实验设置5个重复，分别用ddh2o、dsrna(gfp、hsps)饲喂。

3)饲喂72h后，取一部分干扰的幼虫收集作为定量样品来检测干扰效率，每个处理3个重复，每个重复15头幼虫。

4)7天后统计虫子的死亡率，并记录实验结果。

试验结果及分析：

(1)饲喂short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)基因的dsrna后该基因的沉默效率

qrt-pcr检测结果显示：与对照组相比，饲喂short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)基因的dsrna显著抑制了short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)在二化螟体内(见图4)的表达。由此可见，该二化螟short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)基因的干扰序列可显著抑制short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)基因的表达。

(2)饲喂short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)基因dsrna对二化螟死亡率的影响

在实验室内，申请人观察饲喂处理7天后二化螟生长情况，统计了死亡率和，结果显示，与对照组相比，饲喂short-chaindehydrogenases/reductases(sdr)基因dsrna处理组的二化螟死亡率提高了38.88％(见图5)。因此本发明提供的rna干扰序列可应用于转基因抗二化螟植物的开发如转基因抗二化螟的水稻。进一步开发其蛋白可应用于二化螟的生物防治。

由以上实施例可以得出，本发明提供的二化螟sdr基因参与了二化螟的生长发育过程，该基因的缺失显著提高了二化螟幼虫的死亡率。在本发明中，所述二化螟sdr基因的dsrna抑制二化螟sdr基因的表达。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种二化螟sdr基因及其编码的蛋白质和应用、dsrna及其扩增的引物对和应用

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>735

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgaaaacaattctaattactggtgctaatagaggcttgggtctgggaatggttaagtat60

ctaaccagacagggcagagccgaaaaaatcattgctacatgccgaaaaccttcagaggaa120

ctagaaaaaattgctcaagaatcaaacaaactacaaatagtacatttagatgtcacagat180

ttggctagttacggtgacgtgacaactaaaattgccaacgcagtaggcagctccggtctc240

aatttactcattaacaacgctggaatcgcaacaaaattcactaaactcaatttggtgaaa300

gctgagcagctgctagaaaacctcacagtcaacaccgtcgcaccgataatgctaaccaag360

tcgatgctgccgctgctgaagcaagccgcggaggcgaacagcagctcgccggtgggcgca420

gcgcgcgccgccgtcatcaacatgagctccgtgctcggctccatcgcgcagaacgaccag480

ggtggcttctacccctacaggtgttctaaggccgcattgaacgcagcgaccaaatcaatg540

agcatagacctgaagaaggagcacatactggtggcgtcgatacaccccggctgggttcgc600

accgacatgggcggcaagggcgcgccgctcgacgtggtcaccagcgtcgagagcatattc660

gaaaccatagagaagctgggcgaggcagattcgggcaagttcctgcagtacgacggcgct720

gagctaccgtggtga735

<210>2

<211>244

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metlysthrileleuilethrglyalaasnargglyleuglyleugly

151015

metvallystyrleuthrargglnglyargalaglulysileileala

202530

thrcysarglysproserglugluleuglulysilealaglngluser

354045

asnlysleuglnilevalhisleuaspvalthraspleualasertyr

505560

glyaspvalthrthrlysilealaasnalavalglyserserglyleu

65707580

asnleuleuileasnasnalaglyilealathrlysphethrlysleu

859095

asnleuvallysalagluglnleuleugluasnleuthrvalasnthr

100105110

valalaproilemetleuthrlyssermetleuproleuleulysgln

115120125

alaalaglualaasnserserserprovalglyalaalaargalaala

130135140

valileasnmetserservalleuglyserilealaglnasnaspgln

145150155160

glyglyphetyrprotyrargcysserlysalaalaleuasnalaala

165170175

thrlyssermetserileaspleulyslysgluhisileleuvalala

180185190

serilehisproglytrpvalargthraspmetglyglylysglyala

195200205

proleuaspvalvalthrservalgluserilephegluthrileglu

210215220

lysleuglyglualaaspserglylyspheleuglntyraspglyala

225230235240

gluleuprotrp

<210>3

<211>375

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ccgataatgctaaccaagtcgatgctgccgctgctgaagcaagccgcggaggcgaacagc60

agctcgccggtgggcgcagcgcgcgccgccgtcatcaacatgagctccgtgctcggctcc120

atcgcgcagaacgaccagggtggcttctacccctacaggtgttctaaggccgcattgaac180

gcagcgaccaaatcaatgagcatagacctgaagaaggagcacatactggtggcgtcgata240

caccccggctgggttcgcaccgacatgggcggcaagggcgcgccgctcgacgtggtcacc300

agcgtcgagagcatattcgaaaccatagagaagctgggcgaggcagattcgggcaagttc360

ctgcagtacgacggc375

<210>4

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tggaattcccgataatgctaaccaagtcgatg32

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tgaattcgccgtcgtactgcaggaa25

<210>6

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

atgaaaacaattctaattactggtgcta28

<210>7

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

tcaccacggtagctcagcg19