一种植物microRNA表达载体、构建方法及应用与流程

文档序号：18477227发布日期：2019-08-20 21:22阅读：560来源：国知局

本发明涉及一种载体的构建方法，特别涉及一种植物microrna表达载体、构建方法及应用。

背景技术：

micrornas(mirnas)是表观遗传学研究的热点问题之一，广泛参与调控植物的生长、发育及逆境耐受性等生命活动。而mirnas功能的行使主要依赖于其对相关靶基因的转录后调控，因此，解析mirnas调控相关生命活动的机理，首要任务即为明确mirnas对其靶基因在相关生命活动中的调控模式。

目前，针对mirnas对其靶基因调控模式的研究方法主要包括：qrt-pcr、rna原位杂交及靶基因启动子驱动靶基因/抗剪切靶基因连gfp报告基因的载体构建。比较上述三种方法，qrt-pcr法难以对靶基因转录前后细胞水平的表达模式进行定位分析；rna原位杂交可以实现对mirnas及其靶基因的原位表达分析，但操作繁琐，工作量大；常规的载体构建方法，可通过比较报告基因的信号展示靶基因转录前后的表达水平，但就载体构建而言，需要同时克隆基因的启动子、基因编码序列和突变后的编码序列，工作量较大，另外不可避免基因本身编码的蛋白对报告基因蛋白空间构象的影响，容易出现构建好的载体，却看不到报告基因的信号。

综上，现有技术存在的问题是常规的载体构建方法步骤繁琐，工作量大，且基因本身的蛋白对报告基因蛋白空间构象的影响，导致构建好的载体，看不见报告基因的信号。

技术实现要素：

本发明简化了常规的载体构建方法，通过载体报告基因信号的观察可以展示靶基因转录前后的表达模式。

本发明的第一个目的是提供一种植物microrna表达载体的构建方法，包括如下步骤：

针对靶基因启动子序列设计引物组合f/r1，用f/r1引物克隆靶基因启动子序列，测序验证，将测序正确的扩增片段通过ncoⅰ/ncoⅰ双酶切、t4dna连接酶连接的方法连接到pgfpgusplus载体上，即靶用克隆的基因启动子序列替换pgfpgusplus载体上的gfp上游的35s序列，验证片段连接至pgfpgusplus载体的方向，正向连接至pgfpgusplus载体的质粒即为构建成功的1#载体，靶基因启动子驱动gfp；

针对下游含目的microrna的靶基因启动子序列设计引物组合f/r2，用f/r1引物克隆下游含目的microrna的靶基因启动子序列，测序验证，对测序正确的扩增片段通过ncoⅰ/ncoⅰ双酶切、t4dna连接酶连接的方法连接到pgfpgusplus载体上，即用下游含一段microrna结合的靶基因启动子序列替换pgfpgusplus载体上的gfp上游的35s序列，进一步验证片段连接至pgfpgusplus载体的方向，正向连接至pgfpgusplus载体的质粒即为构建成功的2#载体，microrna结合靶基因启动子序列gfp。

本发明的第二个目的是提供一种上述构建方法构建得到的1#和2#载体。

本发明的第三个目的是提供一种上述载体在分析植物microrna对其靶基因调控模式的应用。

优选地，所述植物为拟南芥。

优选地，所述引物f序列如seqidno：1所示；引物r1序列如seqidno：2所示；引物r2序列如seqidno：3所示。

本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明简化了常规的载体构建方法，通过载体报告基因信号的观察可以展示靶基因转录前后的表达模式，大大简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率；本专利构建的载体，可直观展示靶基因受micrornas调控前后的组织细胞表达水平，为植物micrornas对靶基因的调控模式研究提供了一种新方法。

附图说明

图1为本发明实施例1的构建方法示意图(a：pgfpgusplus载体；b：靶基因启动子替代35s启动子后，获得的用于分析靶基因转录水平表达模式的载体；c：靶基因启动子后连接一段mirna剪切结合的靶基因的序列)。

图2为本发明实施例1构建载体的启动子克隆电泳检测结果。

图3为本发明实施例1构建载体连接方向的电泳检测结果。

图4为本发明实施例2构建成功的两个载体分别转化拟南芥获得的转基因苗的筛选(a为1#载体pmyb33-gfp转化，b为2#载体pmyb33-mir159-gfp转化)。

图5为本发明实施例2两种载体gfp信号观察图(a：myb33在拟南芥根尖分生组织区域的转录水平，b：myb33受mir159剪切的转录后水平的表达模式)。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的方法，通常按照常规条件操作，未注明的材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。

实施例1

一种植物microrna表达载体的构建方法

本实施例选取拟南芥mir159的靶基因myb33进行载体的构建(构建方法如图1所示)，表达载体为pgfpgusplus载体(购买至普如汀生物技术(北京)有限公司)，选取myb33基因atg上游2051bp序列进行引物设计；

引物f序列如seqidno：1所示：

引物r1序列如seqidno：2所示；

引物r2序列如seqidno：3所示；

(1)克隆myb33启动子序列

以拟南芥的基因组dna为模板，利用f/r1引物组合进行扩增，pcr体系为：1μl模板dna、两条引物各1μl且浓度均为10μmol/l、10μl的5×buffer、2.5mmol/l的dntps取4μl、1μltranstaqhifidnapolymerase、ddh2o补足50μl；

pcr反应条件：94℃5min，94℃30s、53℃30s、72℃2min，35次循环，72℃8min、4℃保存。

(2)克隆下游含目的microrna的靶基因启动子序列

以拟南芥的基因组dna为模板，利用f/r2引物组合进行扩增，pcr体系为：1μl模板dna、两条引物各1μl且浓度均为10μmol/l、10μl的5×buffer、2.5mmol/l的dntps取4μl、1μltranstaqhifidnapolymerase、ddh2o补足50μl；

pcr反应条件：94℃5min，94℃30s、53℃30s、72℃2min，35次循环，72℃8min、4℃保存。

将上述扩增产物进行电泳检测并测序验证，电泳结果为图2所示，myb33启动子克隆测序验证为seqidno.4所示，记做片段1；myb33启动子连接一段mir159剪切结合myb33的21bp序列克隆测序验证为seqidno.5所示，记做片段2。

将测序验证正确的扩增片段通过ncoⅰ酶切、t4dna连接酶连接的方法连接到pgfpgusplus载体上。

为了验证片段1和片段2连接入pgfpgusplus载体的方向，筛选出正向插入的目标载体，我们设计了一对引物(靠近myb33启动子3’端设计引物f2，序列如seqidno：6所示；靠近gfp5’端设计引物r3，序列如seqidno7：所示)，以连接片段1和片段2的pgfpgusplus载体dna为模板，通过pcr进行筛选验证，能够成功扩增出目标大小片段的克隆即为构建成功的载体。

pcr体系为：模板dna1μl、两条引物各1μl且浓度均为10μmol/l、10μl的2×taqmix、ddh2o补足20μl；

pcr反应条件：94℃5min，94℃30s、55℃30s、72℃40s，35次循环，72℃5min、4℃保存，电泳检测验证。

验证结果如图3所示，泳道1-5为pmyb33-gfp的克隆验证结果，其中克隆1，3，5均为启动子正向插入，构建成功的1#载体；泳道6-11为pmyb33-mir159-gfp的克隆验证结果，其中克隆10，11均为启动子正向插入，即构建成功的2#载体。

实施例2

载体pmyb33-gfp和pmyb33-mir159-gfp在分析拟南芥microrna对其靶基因调控模式的应用。

利用实施例1构建成功的载体(构建成功的1#载体pmyb33-gfp和2#载体pmyb33-mir159-gfp)分别转化拟南芥，经潮霉素筛选，均获得转基因拟南芥阳性苗，结果如图4所示，进一步观察转基因株系主根根尖分生组织区域的gfp信号，如图5所示，对比分析gfp信号，pmyb33-gf载体的gfp信号代表靶基因的转录水平的表达，pmyb33-mir159-gfp的gfp信号代表靶基因受mirna剪切的转录后水平的表达，通过比较两种载体转基因系的gfp信号差异，可清晰展示myb33在拟南芥根尖分生组织区域受mir159调控前后的表达模式。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>淮北师范大学

<120>一种用于分析植物microrna对其靶基因调控模式的载体构建方法

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ccatggctcgaggtggaggcgacgtgttc29

<210>2

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ccatggctcttttctaattaaaccactgaca31

<210>3

<211>52

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ccatggattggaatgaagggagctccactcttttctaattaaaccactgaca52

<210>4

<211>2156

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gctccggccgccatggcggccgcgggaattcgattccatggctcgaggtggaggcgacgt60

gttcgtcagggaagagcccttatgacgtggctaactatgtacagagaatcttggcagcta120

cgttaggctttgagtgtactaactttacgaggaaggataagtatagagttctcgcaggga180

acgacggaaccgtgtcgtatttgtcgtttctcgatcaagtcaagaaggtcgtcaccactt240

tcaaaccttttttgcattaatttacaagttattttgataattatatactctaaattacgc300

gatcactgattgcttaagttttcatttttaaagatttttttgttgaaagtatattatgac360

tacggttttgtgttttttttttccttactttataaattgtcgaatgtaatcgcaagtata420

ttaacctttttgttaaaagttgaaattaaatacatgacaacgtttttacatatctttcaa480

aagagagcccaatagaataatttccttgggacattttcgctttatgaaaatacgttgaca540

aaattgtccaaatattctatatatctaactacttgttagttaaatttggttatgtttaat600

ttacatcacatcttaaaagaatgtatagaattgttttcaatcatacaaactaagggtgag660

aaaaataatggttggtaatgcacagacgattaatagtttggtggtggtagctaagaaatt720

gattaaggaaacttgagctgcaaatatcatcttataacttttttgatcaaataatagtta780

attgcgtatttggttggatgatgacaatctctttgaccgccaaatttttagctgccgcct840

tcccgttagagttggccaacttttagattcgccacattaacaaaatagttaatagtacat900

gcttcagaaaacagttaacattataaaattttctagattaattaggttaataatactaaa960

gaaaaatgttttatttgtttgttttattcttaagaagaagaaacgtaatgggctttagta1020

tctctaacttgaattctgttgtgggcttttctttaggatcagaagtaggtttcgtaagcc1080

tagtgttgtccttatacgggaatatacatacgtataaacatacgacacaacatgaaatga1140

gataaagagagtgaccaaaaaaggctgcaaaaaggtgaccaattcaactctatttctttc1200

ttacaagttacaactctttcaaatcaattattcaatctcactcttttactatctgaatgc1260

atttcagttaataaaccaaaaggattgtcttcataagctgcttttatttttgcttaagct1320

ttgatttagtaaaaactctgattaatttttagtaacataattacaatgctaataacaata1380

ataaaatagttaattttcacaagttatcgtattataatatatttaagaaaacgttttaga1440

aaaagaaaaatgggatagaaagtagaaaagagtaaaaggaagagaaagagctaagcttct1500

ctccctccttccatttccactcgatgttcagctgcccaagctaagctcggatctctatcc1560

agctttggtattttccttagccttgagcttctctccgcgtaaatataattttttgtttct1620

agattatctttccgtttctatctcgaattgctgcttttcatggatctatgattgattagt1680

ccttaggatctttaaaaactttcaatttcagcttagatttcaaatcaggttttctgtttt1740

ttcatattcataatctgatagtatcttctttgtgcgttctgatctatttcagctgatctt1800

tatctgcgctttcgattgatgtttgcatcagctttgttgttgatcttcttcgtaatagac1860

tactaatcttctcaatctaatttttattctctgttggttttcaggtatccagcgtctgac1920

agttctggattttgttttttttttctttccttatttagggtttgttttcctctttcgtct1980

cttttaattctttatgactatgaactttctttatttcaagctgaagtttttggtgtttag2040

gtgggagcttgatgtctaaattgttactgtcagtggtttaattagaaaagagccatggaa2100

tcactagtgaattcgcggccgcctgcaggtcgaccatatgggagagctcccaacgc2156

<210>5

<211>2174

<212>dna

<213>人工序列

<400>5