一种检测叶酸代谢相关基因多态性的方法与流程

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种检测叶酸代谢相关基因多态性的方法。

背景技术：

叶酸是人体细胞生长、分裂和繁殖过程中必需的物质。研究显示，叶酸在胚胎发育早期出现的两次表观在遗传编程当中起着重要的作用。亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydrofolatereductase，mthfr)和甲硫氨酸合成还原酶(methioninesynthasereductase，mtrr)是叶酸代谢途径的关键酶。现已发现mthfr及mtrr基因存在多种基因多态性位点，这些基因多态性影响着编码酶的活性，导致血清中的叶酸发生改变。

目前，在通过mthfr基因和mtrr基因的多态性位点检测患者体内叶酸的代谢能力时，通常采用聚合酶链式反应pcr-直接测序法进行检测。

但是，pcr-直接测序法检测患者体内叶酸代谢能力的周期较长，从而导致患者体内叶酸代谢能力的检测效率低。

技术实现要素：

本发明实施例提供了一种检测叶酸代谢相关基因多态性的方法，能够提高患者体内叶酸代谢能力的检测效率。

本发明实施例提供了一种检测叶酸代谢相关基因多态性的方法，包括：

预先合成亚甲基四氢叶酸还原酶mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和甲硫氨酸合成还原酶mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物与单碱基延伸引物；

从待测样本中提取出待测样本基因组dna，并将所述待测样本基因组dna作为dna模板；

配置包含所述特异性扩增引物和所述dna模板的聚合酶链式反应pcr扩增体系；

利用pcr仪对所述pcr扩增体系进行扩增反应，获得第一反应体系；

对所述第一反应体系进行消化处理，获得第二反应体系；

配置包含所述单碱基延伸引物的单碱基延伸反应体系；

向所述第二反应体系中加入所述单碱基延伸反应体系，并对加入所述单碱基延伸反应体系的所述第二反应体系进行延伸反应，获得第三反应体系；

对所述第三反应体系进行脱盐纯化处理，获得纯化产物；

利用包括有质谱仪的检测仪器检测所述纯化产物，确定所述待测样本的mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的基因多态性。

优选地，

所述mthfr基因的c677t位点的特异性扩增引物中的正向引物序列为：5’-acgttggatgctcacctggatgggaaagatcc-3’；

所述mthfr基因的c677t位点的特异性扩增引物中的反向引物序列为：5’-acgttggatgctcttcatccctcgccttgaac-3’；

所述mthfr基因的a1298c位点的特异性扩增引物中的正向引物序列为：5’-acgttggatgcagaccttccttgcaaatacatc-3’；

所述mthfr基因的a1298c位点的特异性扩增引物中的反向引物序列为：5’-acgttggatgcatcactcactttgtgaccattc-3’；

所述mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物中的正向引物序列为：5’-acgttggatgggctctaaccttatcggattcactaat-3’；

所述mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物中的反向引物序列为：5’-acgttggatggaagtgatgaggaggtttctgttacta-3’。

优选地，

所述mthfr基因的c677t位点的单碱基延伸引物序列为：5’-gaaggtgtctgcgggag-3’；

所述mthfr基因的a1298c位点的单碱基延伸引物序列为：5’-gaggagctgaccagtgaag-3’；

所述mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸引物序列为：5’-gccatcgcagaagaaat-3’。

优选地，

所述pcr扩增体系，包括：

蒸馏水8～10份，10*pcrbuffer4～6份，25mmol的mgcl23～5份，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物1～2份，所述mthfr基因的c677t位点、所述a1298c位点和所述mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物的混合物9～11份、dna聚合酶1～2份和dna模板19～21份，其中，各组分按体积比计，9～11份的特异性扩增引物的混合物中的所述mthfr基因的c677t位点、所述a1298c位点和所述mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物的浓度均为0.1～2μmol，1～2份的所述dna聚合酶的浓度为0.5～2u/μl，19～21份的所述dna模板的量为5～500ng。

优选地，

所述单碱基延伸反应体系，包括：

蒸馏水5～7份，10*pcrbuffer1～3份，20mmol的双脱氧核苷三磷酸混合物1～3份，所述mthfr基因的c677t位点、所述a1298c位点和所述mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸引物的混合物8～10份，以及dna聚合酶0.3～0.5份，其中，各组分按体积比计，0.3～0.5份的所述dna聚合酶的浓度为0.5～2u/μl，8～10份的单碱基延伸引物的混合物中的所述mthfr基因的c677t位点、所述a1298c位点和所述mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸引物的浓度均为1～20μmol。

优选地，

所述利用pcr仪对所述pcr扩增体系进行扩增反应，获得第一反应体系，包括：

利用pcr仪执行：

步骤a1：在90～98℃下，对所述pcr扩增体系预热0.5～10min；

步骤a2：在90～95℃下，对预热后的所述pcr扩增体系进行变性反应0.17～2min；

步骤a3：在50～65℃下，对变性反应后的所述pcr扩增体系进行退火反应0.17～3min；

步骤a4：在68～72℃下，对退火反应后的所述pcr扩增体系进行延伸反应0.17～10min；

步骤a5：将步骤a2、步骤a3和步骤a4循环25～45次，对延伸反应后的所述pcr扩增体系进行循环反应；

步骤a6：在68～80℃下，对循环反应后的所述pcr扩增体系进行终延伸反应0～15min，获得第一反应体系，并在2～8℃下保存所述第一反应体系；

优选地，

所述对加入所述单碱基延伸反应体系的所述第二反应体系进行延伸反应，获得第三反应体系，包括：

利用所述pcr仪执行：

步骤b1：在90～98℃下，对加入所述单碱基延伸反应体系的所述第二反应体系预热0.5～10min；

步骤b2：在90～98℃下，对预热后的所述第二反应体系进行变性反应5s；

步骤b3：在50～60℃下，对变性反应后的所述第二反应体系进行退火反应5～30s；

步骤b4：在65～82℃下，对退火反应后的所述第二反应体系进行延伸反应5～30s；

步骤b5：将步骤b3至步骤b4循环5次，对所述延伸反应后的所述第二反应体系进行退火、延伸循环反应；

步骤b6：将步骤b2至步骤b5循环40次，对变性、退火循环反应后的所述第二反应体系进行扩增循环反应；

步骤b7：在68～75℃下，对扩增循环反应后的所述第二反应体系进行终延伸反应0～10min，获得第三反应体系，并在2～8℃下，保存所述第三反应体系。

优选地，

所述对所述第三反应体系进行脱盐纯化处理，获得纯化产物，包括：

向所述第三反应体系中加入树脂，再加入蒸馏水，并将加入所述树脂和所述蒸馏水的所述第三反应体系混匀，将混匀后的所述第三反应体系的上清液作为纯化产物。

优选地，

所述对所述第三反应体系进行脱盐纯化处理，获得纯化产物，包括：

通过层析、超滤和分子筛中的任意一种或多种方式去除所述第三反应体系中的盐离子，获得纯化产物。

优选地，

所述对所述第一反应体系进行消化处理，获得第二反应体系，包括：

向所述第一反应体系中加入0.5～2u的碱性磷酸酶和所述碱性磷酸酶对应的碱性磷酸酶缓冲液；

利用所述pcr仪，在20～40℃下，对加入所述碱性磷酸酶和所述碱性磷酸酶缓冲液的所述第一反应体系进行消化处理10～60min，并在70～85℃下，对消化处理后的所述第一反应体系进行加热变性处理5～30min，获得第二反应体系，最后在2～8℃下，保存所述第二反应体系。

优选地，

所述碱性磷酸酶，包括：虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、大肠杆菌碱性磷酸酶、大鼠碱性磷酸酶和热敏性碱性磷酸酶中的任意一种。

优选地，

所述利用包括有质谱仪的检测仪器检测所述纯化产物，确定所述待测样本的mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的基因多态性，包括：

利用包括有质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件对所述纯化产物进行测试，获得谱图；

对于所述纯化产物中mthfr基因的c677t位点，当所述谱图中只存在分子量为5576±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的c677t位点的基因型为cc型；当所述谱图中只存在分子量为5656±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的c677t位点的基因型为tt型；当所述谱图中同时存在分子量为5576±3da和5656±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的c677t位点的基因型为ct型；

对于所述纯化产物中mthfr基因的a1298c位点，当所述谱图中只存在分子量为6195±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的a1298c位点的基因型为aa型；当所述谱图中只存在分子量为6171±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的a1298c位点的基因型为cc型；当所述谱图中同时存在分子量为6195±3da和6171±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的a1298c位点的基因型为ac型；

对于所述纯化产物中mtrr基因的a66g位点，当所述谱图中只存在分子量为5481±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的a66g位点的基因型为aa型；当所述谱图中只存在分子量为5497±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的a66g位点的基因型为gg型；当所述谱图中同时存在分子量为5481±3da和5497±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的a66g位点的基因型为ag型；

其中，所述检测条件，包括：所述质谱仪的喷雾电压为3500～4000v，鞘气为25～50arb，辅气为10～50arb，离子传输管温度为260～400℃，离子源雾化温度为300～400℃，离子源温度为300～400℃，分辨率为3000～140000。

优选地，

所述检测仪器，进一步包括：高效液相色谱仪；

所述检测条件，进一步包括：c18反相色谱柱，所述c18反相色谱柱的柱温为：40～70℃，所述纯化产物的进样量为：5～50μl；

所述高效液相色谱仪的流动相为：a相：蒸馏水，b相：甲醇；

其中，色谱梯度为：0-1min，5％-30％b；1-3.5min，30％-50％b；3.5-6.5min，50％-95％b；6.5-7.5min，95％-5％b；7.5-10min，5％b。

在本发明实施例中，将从待测样本中提取出的待测样本基因组dna，加入到包含有mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物中进行扩增反应，可以扩增出包含mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点目的片段的第一反应体系，再顺次进行消化处理，可以去除第一反应体系内多余的dntp，顺次向去除dntp获得第二反应体系中加入，包含有mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸引物，对该体系进行延伸反应可以获得包含有单碱基延伸产物的第三反应体系，再进行脱盐纯化处理，去除第三反应体系中的盐离子，即可获得纯化产物，最后利用包括有质谱仪的检测仪器对纯化产物进行检测，即可确定待测样本的mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的基因多态性。由于包括有质谱仪的检测仪器检测mthfr基因和mtrr基因多态性周期短，因此能够提高患者体内叶酸代谢能力的检测效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一实施例提供的一种检测叶酸代谢相关基因多态性的方法的流程图；

图2是本发明一实施例提供的mthfr基因的c677t位点为c677t-c基因型的lc-ms谱图；

图3是本发明一实施例提供的mthfr基因的c677t位点为c677t-t基因型的lc-ms谱图；

图4是本发明一实施例提供的mthfr基因的a1298c位点为a1298c-a基因型的lc-ms谱图；

图5是本发明一实施例提供的mthfr基因的a1298c位点为a1298c-c基因型的lc-ms谱图；

图6是本发明一实施例提供的mtrr基因的a66g位点为a66g-a基因型的lc-ms谱图；

图7是本发明一实施例提供的mtrr基因的a66g位点为a66g-g基因型的lc-ms谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明实施例提供了一种检测叶酸代谢相关基因多态性的方法，包括：

步骤101：预先合成亚甲基四氢叶酸还原酶mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和甲硫氨酸合成还原酶mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物与单碱基延伸引物；

步骤102：从待测样本中提取出待测样本基因组dna，并将所述待测样本基因组dna作为dna模板；

步骤103：配置包含所述特异性扩增引物和所述dna模板的聚合酶链式反应pcr扩增体系；

步骤104：利用pcr仪对所述pcr扩增体系进行扩增反应，获得第一反应体系；

步骤105：对所述第一反应体系进行消化处理，获得第二反应体系；

步骤106：配置包含所述单碱基延伸引物的单碱基延伸反应体系；

步骤107：向所述第二反应体系中加入所述单碱基延伸反应体系，并对加入所述单碱基延伸反应体系的所述第二反应体系进行延伸反应，获得第三反应体系；

步骤108：对所述第三反应体系进行脱盐纯化处理，获得纯化产物；

步骤109：利用包括有质谱仪的检测仪器检测所述纯化产物，确定所述待测样本的mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的基因多态性。

在本发明实施例中，将从待测样本中提取出的待测样本基因组dna，加入到包含有mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物中进行扩增反应，可以扩增出包含mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点目的片段的第一反应体系，再顺次进行消化处理，可以去除第一反应体系内多余的dntp，顺次向去除dntp获得第二反应体系中加入，包含有mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸引物，对该体系进行延伸反应可以获得包含有单碱基延伸产物的第三反应体系，再进行脱盐纯化处理，去除第三反应体系中的盐离子，即可获得纯化产物，最后利用包括有质谱仪的检测仪器对纯化产物进行检测，即可确定待测样本的mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的基因多态性。由于包括有质谱仪的检测仪器检测mthfr基因和mtrr基因多态性周期短，因此能够提高患者体内叶酸代谢能力的检测效率。

需要说明的是，提取待测样本基因组dna的方式，可以是用口腔拭子收集的口腔脱落细胞，或收集的新鲜外周血/组织样本采用天根口腔拭子基因组dna提取试剂盒(dp322)，或血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304)提取，并采用np80-touch(德国implen)测定dna的浓度及纯度后的待测样本基因组dna，其中，待测样本基因组dna的od260/od280比值位于1.6～2.2范围区间内，且浓度位于5～1000ng/μl范围区间内，以便提取出的待测样本基因组dna的质量符合测试要求。

mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物可以根据需求设计。按照mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点正向引物序列和反向引物序列合成对应的特异性扩增引物，特异性扩增引物的合成可以采用固相合成法或者委托生物合成公司合成并检测正向和反向引物；单碱基延伸引物可以委托生物合成公司合成并检测。

其中，所述mthfr基因的c677t位点的特异性扩增引物中的正向引物序列为：5’-acgttggatgctcacctggatgggaaagatcc-3’，如seqidno.1所示；

所述mthfr基因的c677t位点的特异性扩增引物中的反向引物序列为：5’-acgttggatgctcttcatccctcgccttgaac-3’，如seqidno.2所示；

所述mthfr基因的a1298c位点的特异性扩增引物中的正向引物序列为：5’-acgttggatgcagaccttccttgcaaatacatc-3’，如seqidno.3所示；

所述mthfr基因的a1298c位点的特异性扩增引物中的反向引物序列为：5’-acgttggatgcatcactcactttgtgaccattc-3’，如seqidno.4所示；

所述mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物中的正向引物序列为：5’-acgttggatgggctctaaccttatcggattcactaat-3’，如seqidno.5所示；

所述mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物中的反向引物序列为：5’-acgttggatggaagtgatgaggaggtttctgttacta-3’，如seqidno.6所示。

在本发明实施例中，mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸引物，包含一条单碱基延伸正向引物或一条单碱基延伸反向引物，其中，

所述mthfr基因的c677t位点的单碱基延伸引物序列为：5’-gaaggtgtctgcgggag-3’，如seqidno.7所示；

所述mthfr基因的a1298c位点的单碱基延伸引物序列为：5’-gaggagctgaccagtgaag-3’，如seqidno.8所示；

所述mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸引物序列为：5’-gccatcgcagaagaaat-3’，如seqidno.9所示。

在本发明一实施例中，所述pcr扩增体系，包括：

蒸馏水8～10份，10*pcrbuffer4～6份，25mmol的mgcl23～5份，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物1～2份，所述mthfr基因的c677t位点、所述a1298c位点和所述mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物的混合物9～11份、dna聚合酶1～2份和dna模板19～21份，其中，各组分按体积比计，9～11份的特异性扩增引物的混合物中的所述mthfr基因的c677t位点、所述a1298c位点和所述mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物的浓度均为0.1～2μmol，1～2份的所述dna聚合酶的浓度为0.5～2u/μl，19～21份的所述dna模板的量为5～500ng。

在本发明一实施例中，所述单碱基延伸反应体系，包括：

蒸馏水5～7份，10*pcrbuffer1～3份，20mmol的双脱氧核苷三磷酸混合物1～3份，所述mthfr基因的c677t位点、所述a1298c位点和所述mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸引物的混合物8～10份，以及dna聚合酶0.3～0.5份，其中，各组分按体积比计，0.3～0.5份的所述dna聚合酶的浓度为0.5～2u/μl，8～10份的单碱基延伸引物的混合物中的所述mthfr基因的c677t位点、所述a1298c位点和所述mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸引物的浓度均为1～20μmol。

其中，单碱基延伸反应体系中的dna聚合酶可以包括：大肠杆菌dna聚合酶、klenowfragment、t7dna聚合酶、t4dna聚合酶、修饰过的t7dna聚合酶、逆转录酶和taqdna聚合酶、kodfxneo、kodfx、kodplus、lataq、rtaq、extaq、fastpfuflydna聚合酶、onetaqdna聚合酶、phusionhigh-fidelitydna聚合酶、hotstarttaqdna聚合酶、thermosequenasedna聚合酶中任意一种或多种。

在本发明一实施例中，所述利用pcr仪对所述pcr扩增体系进行扩增反应，获得第一反应体系，包括：

利用pcr仪执行：

步骤a1：在90～98℃下，对所述pcr扩增体系预热0.5～10min；

步骤a2：在90～95℃下，对预热后的所述pcr扩增体系进行变性反应0.17～2min；

步骤a3：在50～65℃下，对变性反应后的所述pcr扩增体系进行退火反应0.17～3min；

步骤a4：在68～72℃下，对退火反应后的所述pcr扩增体系进行延伸反应0.17～10min；

步骤a5：将步骤a2、步骤a3和步骤a4循环25～45次，对延伸反应后的所述pcr扩增体系进行循环反应；

步骤a6：在68～80℃下，对循环反应后的所述pcr扩增体系进行终延伸反应0～15min，获得第一反应体系，并在2～8℃下保存所述第一反应体系。

为了防止在进行pcr扩增反应时，部分pcr扩增体系出现冷凝，可以先对配置的pcr扩增体系进行预热处理，再进行dna模板的变性反应，顺次进行dna模板与各个位点的特异性扩增引物的退火反应，顺次进行各个位点的特异性扩增引物的延伸反应，再重复循环“变性-退火-延伸”25～45次，扩增出mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点目的片段，再对体系进行终延伸反应，以提高完整双链dna的比例。

在本发明一实施例中，所述对所述第一反应体系进行消化处理，获得第二反应体系，包括：

向所述第一反应体系中加入0.5～2u的碱性磷酸酶和所述碱性磷酸酶对应的碱性磷酸酶缓冲液；

利用所述pcr仪，在20～40℃下，对加入所述碱性磷酸酶和所述碱性磷酸酶缓冲液的所述第一反应体系进行消化处理10～60min，并在70～85℃下，对消化处理后的所述第一反应体系进行加热变性处理5～30min，获得第二反应体系，最后在2～8℃下，保存所述第二反应体系。

在第一反应体系加入碱性磷酸酶和碱性磷酸酶缓冲液，在进行“消化-变性”处理，可以去除体系内多余的脱氧核糖核苷三磷酸dntp，最后在2～8℃条件下保存第二反应体系。

其中，碱性磷酸酶，包括：虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、大肠杆菌碱性磷酸酶、大鼠碱性磷酸酶和热敏性碱性磷酸酶中的任意一种。

在本发明一实施例中，所述对加入所述单碱基延伸反应体系的所述第二反应体系进行延伸反应，获得第三反应体系，包括：

利用所述pcr仪执行：

步骤b1：在90～98℃下，对加入所述单碱基延伸反应体系的所述第二反应体系预热0.5～10min；

步骤b2：在90～98℃下，对预热后的所述第二反应体系进行变性反应5s；

步骤b3：在50～60℃下，对变性反应后的所述第二反应体系进行退火反应5～30s；

步骤b4：在65～82℃下，对退火反应后的所述第二反应体系进行延伸反应5～30s；

步骤b5：将步骤b3至步骤b4循环5次，对所述延伸反应后的所述第二反应体系进行退火、延伸循环反应；

步骤b6：将步骤b2至步骤b5循环40次，对变性、退火循环反应后的所述第二反应体系进行扩增循环反应；

步骤b7：在68～75℃下，对扩增循环反应后的所述第二反应体系进行终延伸反应0～10min，获得第三反应体系，并在2～8℃下，保存所述第三反应体系。

为了防止配置的单碱基延伸反应体系在进行延伸反应时，部分体系出现冷凝，可以先对单碱基延伸反应体系进行预热处理，再进行“退火-延伸”以延伸出mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点单碱基延伸引物的延伸产物，再对体系进行“退火-延伸”循环反应，最后进行终延伸反应，以增加单碱基延伸引物的延伸产物的量。

在本发明一实施例中，所述对所述第三反应体系进行脱盐纯化处理，获得纯化产物，包括：

向所述第三反应体系中加入树脂，再加入蒸馏水，并将加入所述树脂和所述蒸馏水的所述第三反应体系混匀，将混匀后的所述第三反应体系的上清液作为纯化产物。

还包括：

通过层析、超滤和分子筛中的任意一种或多种方式去除所述第三反应体系中的盐离子，获得纯化产物。

在进行单碱基延伸反应后获得的第三反应体系进行脱盐处理时，脱盐的方式可以是通过树脂、层析(例如，凝胶过滤层析、高效液相层析、通过ziptip微量层析柱脱盐、通过spe小柱脱盐)、超滤、分子筛去除第三反应体系中的盐离子。

在本发明一实施例中，所述利用包括有质谱仪的检测仪器检测所述纯化产物，确定所述待测样本的mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的基因多态性，包括：

利用包括有质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件对所述纯化产物进行测试，获得谱图；

对于所述纯化产物中mthfr基因的c677t位点，当所述谱图中只存在分子量为5576±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的c677t位点的基因型为cc型；当所述谱图中只存在分子量为5656±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的c677t位点的基因型为tt型；当所述谱图中同时存在分子量为5576±3da和5656±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的c677t位点的基因型为ct型；

对于所述纯化产物中mthfr基因的a1298c位点，当所述谱图中只存在分子量为6195±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的a1298c位点的基因型为aa型；当所述谱图中只存在分子量为6171±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的a1298c位点的基因型为cc型；当所述谱图中同时存在分子量为6195±3da和6171±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的a1298c位点的基因型为ac型；

对于所述纯化产物中mtrr基因的a66g位点，当所述谱图中只存在分子量为5481±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的a66g位点的基因型为aa型；当所述谱图中只存在分子量为5497±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的a66g位点的基因型为gg型；当所述谱图中同时存在分子量为5481±3da和5497±3da的单碱基延伸产物时，所述待测样本的a66g位点的基因型为ag型。

其中，所述检测条件，包括：所述质谱仪的喷雾电压为3500～4000v，鞘气为25～50arb，辅气为10～50arb，离子传输管温度为260～400℃，离子源雾化温度为300～400℃，离子源温度为300～400℃，分辨率为3000～140000。

所述检测仪器，进一步包括：高效液相色谱仪；

所述检测条件，进一步包括：c18反相色谱柱，所述c18反相色谱柱的柱温为：40～70℃，所述纯化产物的进样量为：5～50μl；

所述高效液相色谱仪的流动相为：a相：蒸馏水，b相：甲醇；

其中，色谱梯度为：0-1min，5％-30％b；1-3.5min，30％-50％b；3.5-6.5min，50％-95％b；6.5-7.5min，95％-5％b；7.5-10min，5％b。

根据mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸产物的理论分子量，若在包括高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器对纯化产物进行测试获得的谱图中出现相应的分子量(质荷比)的质谱峰和对应的色谱峰，则可以确定待测样本中存在对应的基因型。由于包括高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器来检测基因多态性的周期短，因此可以缩短mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的基因多态性的检测时长，提高mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的基因多态性检测的效率。并且通过色谱、质谱方式进行基因多态性的检测，还可以特异、简单、高通量的对目标基因的snp位点进行分型。同时，由于包括高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器检测的重现性高，因此可以使得基因多态性的检测结果可重现性高，并且使得检测的自动化程度高，降低mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的基因多态性检测的难度。

图2～图7示出了mthfr基因的部分snp位点的基因型的lc-ms谱图，其中，

图2示出了mthfr基因的c677t位点为c677t-c基因型的lc-ms谱图；

图3示出了mthfr基因的c677t位点为c677t-t基因型的lc-ms谱图；

图4示出了mthfr基因的a1298c位点为a1298c-a基因型的lc-ms谱图；

图5示出了mthfr基因的a1298c位点为a1298c-c基因型的lc-ms谱图；

图6示出了mtrr基因的a66g位点为a66g-a基因型的lc-ms谱图；

图7示出了mtrr基因的a66g位点为a66g-g基因型的lc-ms谱图。

其中，图2～图7中的第一个坐标系均为色谱图，第二坐标系均为质谱图。其中，第一坐标系的横坐标为保留时间，单位为min，纵坐标为电信号强度，单位为mv。第二坐标系的横坐标为例子的质荷比，单位为m/z，纵坐标为离子流的强度。

需要说明的是，质谱仪器可以是基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪，或者是能够检测核酸分子量的质谱仪器。如，q-obitrap质谱、q-tof质谱、maldi-tof质谱、四级杆质谱、三重四级杆质谱。

c18反相色谱柱可以是proteomix-sax色谱柱(5μm,4.6x150mm)，或者是supelcosillc-18-t液相色谱柱，或者是acquityuplcostc181.7μm，或者是dnapacpa100核酸分析柱，或者是xbridgeoligonucleotidebehc18obd色谱柱，或者是tskgeldna-npr色谱柱，或者是shim–packvp-ods色谱柱，或者是tskgeldna-stat色谱柱。

综上可见，通过能够特异性扩增包含snp位点区域的目标基因片段的特异性扩增引物，以及dna聚合酶系进行pcr扩增，pcr结束后加入碱性磷酸酶消化处理，去除反应液中的dntp。之后，在该反应液中加入snp位点特异的单碱基延伸引物及ddntp等相关组分并进行单碱基延伸反应，反应过程中，snp位点特异的延伸引物能够与待测的snp位点的5’端进行特异结合并根据碱基互补配对原则延伸出与目标snp基因型互补的碱基，根据不同的基因型的dna模板可得到不用的单碱基延伸产物。由于不同碱基的分子量不同，因此根据单碱基延伸产物的分子量能够确定所分析snp位点的基因型，实现确定基因多态性的目的。

需要说明的是，下述所用的待测样本基因组dna，均是在患者或患者的监护人知情同意的情况下收集的。

下面通过几个具体的实施例对本发明作进一步的说明：

在实施例1中，一种检测叶酸代谢相关基因多态性的方法可包括：

步骤c1：预先合成mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物。

步骤c2：从待测样本中提取出待测样本基因组dna，并将该待测样本基因组dna作为dna模板，其中，dna模板的浓度为125ng/μl。

其中，待测样本基因组dna为，利用血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒从待测样本的外周血样本中提取，并采用np80-touch测定浓度位于5～1000ng/μl范围区间内，且待测样本基因组dna的od260/od280比值位于1.6～2.2范围区间内。

步骤c3：配置由蒸馏水0.9μl，25mmol的mgcl20.4μl，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.1μl，mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物的混合物1μl，taqdna聚合酶0.1μl，taqdna聚合酶对应的10*pcrbuffer0.5μl，以及dna模板2μl组成的pcr扩增体系，其中，该pcr扩增体系中的mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的每种特异性扩增引物的浓度均为1μmol，taqdna聚合酶的浓度为1.25u/μl，dna模板的量为250ng。

步骤c4：利用pcr仪对pcr扩增体系95℃预热3min，顺次在95℃下变性30s，顺次在54℃下退火30s，顺次在72℃下延伸0.5min，再将95℃变性30s、54℃退火30s和72℃延伸0.5min循环45次，顺次在72℃下终延伸5min，获得包含mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的目的片段的第一反应体系，最后在4℃下保存第一反应体系。

步骤c5：向第一反应体系中加入1u的大肠杆菌碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸缓冲液，利用pcr仪在37℃下消化处理40min，顺次在75℃下加热变性10min，去除体系内多余的dntp，获得消除处理后的第二反应体系，并在4℃下，保存第二反应体系。

步骤c6：配置由蒸馏水0.659μl，20mmol的双脱氧核苷三磷混合物0.2μl，mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸引物的混合物0.9μl，t7dna聚合酶0.041μl，以及对应的10*pcrbuffer0.2μl组成的单碱基延伸反应体系，其中，该单碱基延伸反应体系中的mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸引物的浓度均为10μmol，t7dna聚合酶的浓度为1.25u/μl。

步骤c7：将步骤c6获得的单碱基延伸反应体系加入到步骤c5获得的第二反应体系中，利用pcr仪在94℃下预热30s，顺次在94℃下变性5s，顺次在54℃下退火10s，顺次在80℃下延伸5s，顺次将54℃下退火10s和80℃延伸5s循环5次，顺次将94℃下变性5s与(54℃下退火10s和80℃下延伸5s循环5次)循环40次，最后在72℃下终延伸5min，获得包括mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸产物的第三反应体系，并在4℃下，保存获得的第三反应体系。

步骤c8：将第三反应体系加入25mg的树脂，再加入50μl的蒸馏水，并将加入树脂后和蒸馏水的第三反应体系混匀，并在混匀后的体系中取上清液作为纯化产物。

步骤c9：利用包括有高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件对纯化产物进行测试，确定待测样本中的mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的基因多态性。

其中，步骤c9中的质谱仪的检测条件为喷雾电压为3800v，鞘气为32arb，辅气为30arb，离子传输管温度为320℃，离子源雾化温度为350℃，离子源温度为350℃，分辨率为70000。

其中，步骤c9中的高效液相色谱仪的检测条件为c18反相色谱柱，c18反相色谱柱的柱温为：55℃，纯化产物的进样量为：22.5μl，其中，所述c18反相色谱柱的色谱柱型号为：acquityuplcoligobehc18，柱内径为：1.7μm，柱长为：2.1x50mm；

高效液相色谱仪的流动相为：a相：蒸馏水，b相：甲醇；

色谱梯度为：色谱梯度为：0-1min，5％-30％b；1-3.5min，30％-50％b；3.5-6.5min，50％-95％b；6.5-7.5min，95％-5％b；7.5-10min，5％b。

在实施例2中，一种检测叶酸代谢相关基因多态性的方法可包括：

步骤d1：预先合成mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物。

步骤d2：从待测样本中提取出待测样本基因组dna，并将该待测样本基因组dna作为dna模板，其中，dna模板的浓度为5ng/μl。

其中，待测样本基因组dna为，利用天根口腔拭子基因组dna提取试剂盒(dp322)从待测样本的口腔脱落细胞中提取出的，并采用np80-touch测定浓度位于5～1000ng/μl范围区间内，且od260/od280比值位于1.6～2.2范围区间内的基因组dna。

步骤d3：配置由蒸馏水0.8μl，25mmol的mgcl20.3μl，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.1μl，mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物的混合物0.9μl，taqdna聚合酶0.1μl，taqdna聚合酶对应的10*pcrbuffer0.4μl，以及dna模板1.9μl组成的pcr扩增体系，其中，该pcr扩增体系中的mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的每种特异性扩增引物的浓度均为0.1μmol，taqdna聚合酶的浓度为0.5u/μl，dna模板的量为9.5ng。

步骤d4：利用pcr仪对pcr扩增体系90℃预热0.5min，顺次在90℃下变性0.17min，顺次在50℃下退火0.17min，顺次在68℃下延伸0.17min，再将90℃变性0.17min、50℃下退火0.17min和68℃下延伸0.17min循环25次，获得包含mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的目的片段的第一反应体系，最后在4℃下保存第一反应体系。

步骤d5：向第一反应体系中加入0.5u的热敏性碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸缓冲液，再利用pcr仪进行20℃消化处理10min，顺次在70℃下加热变性5min，去除体系内多余的dntp，获得消化处理后的第二反应体系，最后在4℃下，保存第二反应体系。

步骤d6：配置由蒸馏水0.5μl，20mmol的双脱氧核苷三磷混合物0.1μl，mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸引物的混合物0.8μl，t7dna聚合酶0.03μl，以及t7dna聚合酶对应的10*pcrbuffer0.1μl组成的单碱基延伸反应体系，其中，该单碱基延伸反应体系中的mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸引物的浓度均为1μmol，t7dna聚合酶的浓度为0.5u/μl。

步骤d7：将单碱基延伸反应体系加入到第二反应体系中，利用pcr仪在90℃下预热30s，顺次在90℃下变性5s，顺次在50℃下退火5s，顺次在65℃下延伸5s，顺次将50℃下退火5s和65℃下延伸5s循环5次，顺次将90℃下变性5s与(50℃下退火5s和65℃下延伸5s循环5次)循环40次，获得延伸反应后的第三反应体系，最后在4℃下，保存获得的第三反应体系。

步骤d8：将第三反应体系加入15mg的树脂，再加入40μl的蒸馏水，并将加入树脂后和蒸馏水的第三反应体系混匀，并在混匀后的体系中取上清液作为纯化产物。

步骤d9：利用包括有高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件对纯化产物进行测试，确定待测样本中的mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的基因多态性。

其中，步骤d9中的质谱仪的检测条件为喷雾电压为3500v，鞘气为25arb，辅气为30arb，离子传输管温度为260℃，离子源雾化温度为300℃，离子源温度为300℃，分辨率为3000。

其中，步骤d9中的高效液相色谱仪的检测条件为c18反相色谱柱，c18反相色谱柱的柱温为：40℃，纯化产物的进样量为：5μl，其中，所述c18反相色谱柱的色谱柱型号为：acquityuplcoligobehc18，柱内径为：1.7μm，柱长为：2.1x50mm。

高效液相色谱仪的流动相为：a相：蒸馏水，b相：甲醇；

色谱梯度为：0-1min，5％-30％b；1-3.5min，30％-50％b；3.5-6.5min，50％-95％b；6.5-7.5min，95％-5％b；7.5-10min，5％b。

在实施例3中，一种检测叶酸代谢相关基因多态性的方法可包括：

步骤e1：预先合成mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物和单碱基延伸引物。

步骤e2：从待测样本中提取出待测样本基因组dna，并将该待测样本基因组dna作为dna模板，其中，dna模板的浓度为119ng/μl。

其中，待测样本基因组dna为，利用血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304)从待测样本的组织样本中提取获得，并采用np80-touch测定浓度位于5～1000ng/μl范围区间内，且od260/od280比值位于1.6～2.2范围区间内的基因组dna。

步骤e3：配置由蒸馏水1μl，25mmol的mgcl20.5μl，20mmol的脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.2μl，mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物的混合物1.1μl，大肠杆菌dna聚合酶0.1μl，大肠杆菌dna聚合酶对应的10*pcrbuffer0.6μl，以及dna模板2.1μl组成的pcr扩增体系，其中，该pcr扩增体系中的mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的每种特异性扩增引物的浓度均为2μmol，大肠杆菌dna聚合酶的浓度为2u/μl，dna模板的量为250ng。

步骤e4：利用pcr仪对pcr扩增体系98℃预热10min，顺次在95℃下变性2min，顺次在65℃下退火3min，顺次在72℃下延伸10min，再将95℃变性2min、565℃退火3min和72℃延伸10min循环45次，顺次在72℃下终延伸5min，获得包含mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的目的片段的第一反应体系，最后在4℃下保存第一反应体系。

步骤e5：向第一反应体系中加入2u的大肠杆菌碱性磷酸酶和对应的碱性磷酸缓冲液，再利用pcr仪进行40℃消化处理60min，顺次在85℃下加热变性30min，去除体系内多余的dntp，获得消化处理后的第二反应体系，最后在4℃下，保存第二反应体系。

步骤e6：配置由蒸馏水0.7μl，20mmol的双脱氧核苷三磷混合物0.1μl，mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸引物的混合物1μl，t7dna聚合酶0.05μl，以及t7dna聚合酶对应的10*pcrbuffer0.3μl组成的单碱基延伸反应体系，其中，该单碱基延伸反应体系中的mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸引物的浓度均为20μmol，t7dna聚合酶的浓度为2u/μl。

步骤e7：将单碱基延伸反应体系加入到第二反应体系中，利用pcr仪在98℃下预热10min，顺次在98℃下变性5s，顺次在60℃下退火30s，顺次在82℃下延伸30s，顺次将60℃下退火30s和82℃下延伸30s循环5次，顺次将98℃下变性5s与(60℃下退火30s和82℃下延伸30s循环5次)循环40次，最后在75℃下终延伸10min，获得延伸反应后的第三反应体系，在8℃下，保存第三反应体系。

步骤e8：将第三反应体系加入40mg的树脂，再加入70μl的蒸馏水，并将加入树脂后和蒸馏水的第三反应体系混匀，并在混匀后的体系中取上清液作为纯化产物。

步骤e9：利用包括有高效液相色谱仪和质谱仪的检测仪器，通过预设的检测条件对纯化产物进行测试，确定待测样本的mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的基因多态性。

其中，步骤e9中的质谱仪的检测条件为喷雾电压为4000v，鞘气为50arb，辅气为50arb，离子传输管温度为400℃，离子源雾化温度为400℃，离子源温度为400℃，分辨率为140000；

其中，步骤e9中的高效液相色谱仪的检测条件为c18反相色谱柱，c18反相色谱柱的柱温为：70℃，纯化产物的进样量为：50μl，其中，其中，所述c18反相色谱柱的色谱柱型号为：acquityuplcoligobehc18，柱内径为：1.7μm，柱长为：2.1x50mm；

高效液相色谱仪的流动相为：a相：蒸馏水，b相：甲醇；

色谱梯度为：0-1min，5％-30％b；1-3.5min，30％-50％b；3.5-6.5min，50％-95％b；6.5-7.5min，95％-5％b；7.5-10min，5％b。

本发明各个实施例至少具有如下有益效果：

1、在本发明一实施例中，将从待测样本中提取出的待测样本基因组dna，加入到包含有mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的特异性扩增引物中进行扩增反应，可以扩增出包含mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点目的片段的第一反应体系，再顺次进行消化处理，可以去除第一反应体系内多余的dntp，顺次向去除dntp获得第二反应体系中加入包含有mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的单碱基延伸引物，对该体系进行延伸反应可以获得包含有单碱基延伸产物的第三反应体系，再进行脱盐纯化处理，去除第三反应体系中的盐离子，即可获得纯化产物，最后利用包括有质谱仪的检测仪器对纯化产物进行检测，即可确定待测样本的mthfr基因的c677t位点、a1298c位点和mtrr基因的a66g位点的基因多态性。由于包括有质谱仪的检测仪器检测mthfr基因和mtrr基因多态性周期短，因此能够提高患者体内叶酸代谢能力的检测效率。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

sequencelisting

<110>北京和合医学诊断技术股份有限公司

<120>一种检测叶酸代谢相关基因多态性的方法

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