一株矿化沉淀重金属铅离子及还原六价铬离子的细菌及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株矿化沉淀重金属铅离子及还原六价铬离子的细菌及其应用。

背景技术：

随着染料、电镀等工业的发展，以及人们对金属矿藏的不合理开采，越来越多的重金属进入水体。重金属具有致畸、致癌、致突变作用，由于重金属不易被生物体降解，且能通过食物链传递并富集，可经多种途径进入人体，严重危害人体健康。在我国，铅与铬是两种常见的污染生态环境的重金属。

铅作为强毒性重金属，具有渗透性强、无害化处理困难等特点，是造成食品污染最严重的重金属污染物之一。人体主要通过饮食和呼吸两大途径摄入铅，在体中蓄积到一定限量后，会引发脑、肾脏、肝脏、神经、骨骼等一系列的系统损伤，同时也具有一定致畸、致癌、致突变的作用。食品中的铅主要来源于自然环境释放和人为污染。自然环境释放包括矿区岩石风化和海底火山喷发等，会随着自然沉降作用附着于周边空气、土壤和水体等介质，进而通过植物的表面吸附和渗透作用污染食品原材料，影响食品安全性。全球每年铅接触死亡约15万例，我国近年来“血铅”等重金属污染事件也频频发生。世卫组织已将“铅”定为引起重大公共卫生关注的十种化学品之一。

铬的基态电子构型为[ar]4s13d5，高度自旋，因此它可表现出不同的氧化态，具有广泛的化学和物理性质。它可以根据氧化态形成酸性，碱性或两性氧化物。当氧化态为+3(三价，cr³⁺)和+6(六价，cr⁶⁺)时最稳定。cr⁶⁺主要用作生产纺织染料、油漆、油墨、塑料的颜料、木材保护、镀铬、钢铁工业和鞣制工艺。这些行业的污水是水体环境中cr⁶⁺污染的主要原因之一。cr⁶⁺直接接触皮肤会发生不同程度的钝化、引起皮炎、皮肤坏死和皮肤腐蚀，有研究发现经常接触cr⁶⁺职业的人群，呼吸系统患癌症的概率较大，高度不溶和难溶性铬酸盐被确定为致癌物质。cr⁶⁺还可以通过破坏精子和雄性生殖系统使动物产生生理应激。此外，cr⁶⁺还与植物的养分吸收及光合作用的降低有关，从而导致植物生长缓慢，甚至使植物出现萎黄和坏死现象。由于cr³⁺离子的毒性与迁移性远远小于cr⁶⁺离子，因此采用化学或生物还原法将cr⁶⁺还原为cr³⁺是当前铬污染修复的常用方法。

目前，重金属污染的治理方法主要包括三大类：物理法、化学法和生物法。物理法和化学法见效相对较快，但成本偏高，易产生二次污染。生物法主要是利用植物和微生物对重金属的吸附和钝化作用。其中微生物治理重金属污染，具有成本低、高效率、对环境破坏小、无二次污染、适合于大面积修复等优势而备受青睐，具有良好的应用前景。现有微生物处理重金属铅离子(pb²⁺)和铬离子(cr⁶⁺)的效率还不能让人满意。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株从新疆核辐射污染区筛选、驯化后得到的具有多种重金属耐受能力，并可通过磷酸盐代谢矿化沉淀重金属铅离子(pb²⁺)及还原六价铬离子(cr⁶⁺)的细菌，可以用于重金属污染的修复。

本发明的另一目的是提供上述细菌的培养方法，该方法简单高效。

本发明的再一目的是提供上述细菌在铅、铬污染修复中的应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一株矿化沉淀重金属铅离子及还原六价铬离子的细菌，其分类命名为苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-311株，其保藏编号为：gdmccno：60592。hm-311株是从新疆核辐射污染区土壤中分离、筛选，然后在高浓度铅离子存在条件下连续传代培养驯化后得到的。

分离、驯化和鉴定方法如下：将来源于新疆核辐射污染区土壤10g加入到90ml铅离子分离培养基中富集培养，24h后取富集培养液做10^-2、10^-3、10^-4梯度稀释，各取0.1ml分别涂布于铅离子分离培养基平板上，每个梯度3个重复，置30℃、200rpm条件下培养2天。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落。随后将获得的纯化菌株接种于固体lb培养基斜面，放入4℃冰箱中保存备用。经过比较，发现hm-31菌株具有耐受多种重金属压力的特点。通过在含有高浓度(1000mg/l)铅离子的lb培养基中连续传代培养来驯化菌株bacillusthuringiensishm-31，培养条件为30℃，200rpm转速震荡培养，每12小时转接传代一次，在转接30次后，得到具有高浓度铅离子耐受能力的hm-311株。通过pcr获得hm-311菌株的16srdna序列，如seqidno:1所示。经序列测定及blast同源性对比与进化分析，结果表明hm-311菌株与bacillusthuringiensisstrainqzl3816srdna及bacillusthuringiensisstrainc2516srdna的同源性为100％，确定hm-311菌株为苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)，因此hm-311菌株命名为苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-31株。

本发明还提供所述细菌的培养方法，将金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-311株接种到发酵培养基中，在25-37℃、转速100-200rpm条件下震荡培养。

优选的技术方案中，所述发酵培养基为lb培养基。

本发明还提供所述的细菌在铅、铬污染修复中的应用。

在本发明中，所述细菌采用如下方法制备：将金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-311株接种到发酵培养基中，在25-37℃、转速100-200rpm条件下震荡培养。优选的技术方案中，所述发酵培养基为lb培养基。

本发明的有益效果在于：本发明从新疆核辐射污染区分离、筛选、驯化后得到一株新型耐重金属菌株hm-311株，该菌株具有矿化沉淀重金属铅离子(pb²⁺)及还原六价铬离子(cr⁶⁺)的能力，可用于重金属污染治理。该菌株对重金属铅离子的最高耐受浓度为2100mg/l，对六价铬离子的最高耐受浓度为600mg/l。在含有1500mg/l铅离子的培养基中发酵培养两天，可去除培养基中97％的铅离子；在含有100mg/lcr⁶⁺的培养基中发酵培养两天，可还原培养基中70％的六价铬离子(cr⁶⁺)离子。

附图说明

图11000mg/l铅离子浓度条件下菌体生长情况及发酵液上清中铅离子浓度随时间变化曲线。

图21500mg/l铅离子浓度条件下菌体生长情况及发酵液上清中铅离子浓度随时间变化曲线。

图3细菌表面铅离子矿化产物扫描电镜分析图。

图4细菌表面铅离子矿化产物xrd分析图。

图5培养基中六价铬离子浓度及总铬浓度随时间变化曲线。

本发明hm-311菌株，其分类命名为苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-311株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：gdmccno：60592，保藏日期为2019年2月25日，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。

具体实施方式

实施例1：本实施例说明本发明使用到的培养基

lb培养基：将酵母粉5g、蛋白胨10g、nacl10g和蒸馏水1000ml混合均匀，得到lb培养基，其ph为7.2。

铅离子分离培养基：在lb培养基中添加pb(no3)2使得培养基中pb²⁺的终浓度为1000mg/l，即得铅离子分离培养基。

铅离子分离培养基平板：在铅离子分离培养基中添加终浓度为15g/l的琼脂。

实施例2：苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-311的获得

将来源于新疆核辐射污染区土壤10g加入到90ml铅离子分离培养基(配制方法见实施例1)中富集培养，24h后取富集培养液做10^-2、10^-3、10^-4梯度稀释，各取0.1ml分别涂布于铅离子分离培养基平板(配制方法见实施例1)上，每个梯度3个重复，置30℃、200rpm条件下培养2天。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落。随后将获得的纯化菌株接种于固体lb培养基斜面，放入4℃冰箱中保存备用。经过比较，发现hm-31菌株具有耐受多种重金属压力的特点。因此，对hm-31菌株进行进一步的研究。

将hm-31菌株于30℃培养12h，随后进行鉴定。

通过pcr获得hm-31菌株的16srdna序列，如seqidno:1所示。经序列测定及blast同源性对比与进化分析，结果表明hm-31菌株与bacillusthuringiensisstrainqzl3816srdna及bacillusthuringiensisstrainc2516srdna的同源性为100％，确定hm-31菌株为苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)，因此hm-31菌株命名为苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-31株。

通过在含有1000mg/l铅离子的lb培养基中连续传代培养来驯化菌株bacillusthuringiensishm-31，培养条件为30℃、200rpm转速震荡培养，每12小时转接传代一次，在转接30次后，得到具有高浓度铅离子耐受能力菌株hm-311株，经检测hm-311株的16srdna序列仍然如seqidno:1所示，证明hm-311株为苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)，命名为苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-311株。将苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-311株并送广东省微生物菌种保藏中心保藏。

实施例3：苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-311株的耐重金属性能

在lb培养基(液体培养基)中分别添加重金属离子cu²⁺、zn²⁺、cr⁶⁺、cd²⁺、ni²⁺、co²⁺、pb²⁺，调节ph至7.2，每种重金属离子的添加浓度介于100-3000mg/l范围内的多种不同浓度，以考察苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-311株对各种金属离子的耐受能力。以不添加金属离子的lb培养基为对照。以细菌可生长的最大金属离子浓度作为最大耐受浓度。培养48h后，添加重金属离子培养基中细菌生物量的增长(相对于培养初始状态)达到对照中细菌生物量增长的10％，视为细菌可生长。

苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-311株对各金属的最大耐受浓度如表1所示。从表1可见，hm-311株对铅、铜、锌、铬、镉、钴和镍等金属离子具有一定的耐受能力，其中对铅离子耐受能力尤其突出，达到2100mg/l。

表1.hm-311株对不同金属离子的最大耐受浓度(mtc)

实施例4：苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-311株对铅离子的沉淀去除性能

(1)hm-311株对1000mg/l铅离子的去除性能

将bacillusthuringiensishm-31株接种于含1000mg/l铅离子(以pb(no3)2的形式添加)的lb培养基中，在30℃、转速200rpm条件下震荡培养60h，定期取样，得到发酵液。将发酵液离心去除菌体，测试发酵液上清中铅离子浓度。

测试结果如图1所示，经过48h的培养，培养基中铅离子浓度从1000mg/l降低至29.94mg/l，去除率达到97.01％。

(2)hm-311株对1500mg/l铅离子的去除性能

将bacillusthuringiensishm-31株接种于含1500mg/l铅离子(以pb(no3)2的形式添加)的lb培养基中，在30℃、转速200rpm条件下震荡培养60h，定期取样，得到发酵液。将发酵液离心去除菌体，测试发酵液上清中铅离子浓度。

测试结果如图2所示，经过60h的培养，培养基中铅离子浓度从1500mg/l降低至44.22mg/l，去除率达到97.05％。

实施例5：苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-311株对铅离子矿化产物的扫描电镜分析

将菌株hm-311分别在lb培养基和添加有1000mg/l铅离子(以pb(no3)2的形式添加)的lb培养基中培养，在培养12h、24h、36h及48h分别取1ml菌液，在4℃、5000rpm条件下离心10分钟收集菌体，使用无菌生理盐水清洗一次菌体后，加入0.5％的戊二醛溶液，在4℃条件下固定30min，然后4000rpm离心1min，弃去上清后使用2.5％的戊二醛溶液在4℃条件下过夜固定，然后依次用50％、70％、100％乙醇清洗固定后的细胞，经过临界干燥及喷金步骤后，使用扫描电子显微镜观察并拍摄照片。结果如图3所示，在不添加铅离子的培养基中培养的细胞表面干净平整，而培养基中添加铅离子后培养的细菌，在培养24h时，细胞表面依然平整，但是培养36h时，细胞表面出现颗粒状沉淀，并且随着培养时间的增加，颗粒状沉淀也随之增多。这一现象与发酵液中铅离子沉降曲线相吻合。由此推测，在细菌培养的前24h，细菌进行生物量的增长积累，当细菌生长至平稳期后，细胞分泌胞外物质与铅离子反应，生成颗粒状沉淀。

实施例6：苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-311株对铅离子矿化产物的xrd分析

将菌株hm-311分别接种入添加有0、150、1000mg/l铅离子的lb培养基中，在30℃、200rpm转速下培养2天。将发酵液在4℃、5000rpm条件下离心15分钟分离细菌细胞。使用冷冻干燥机对细胞进行脱水，充分研磨后用于xrd分析。xrd分析使用ni滤光片，cukα射线(λ＝0.1546nm)，管电压40kv，管电流30ma，扫描范围20°～60°，扫描步长0.04°。结果如图4所示，从谱图结果分析，发现细胞表面颗粒含有2种铅矿沉淀，分别为pb3(po4)2、pb5(po4)3cl。

实施例7：苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-311株对六价铬离子的还原性能

将苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)hm-31株接种于lb培养基中，30℃、转速200rpm条件下震荡培养12h后，向培养物中添加六价铬离子至终浓度为100mg/l，继续培养菌株60h，定期取样，得到发酵液。将发酵液离心去除菌体，测试培养基上清中的六价铬离子及总铬离子浓度，三价铬离子浓度＝总铬离子浓度-六价铬离子浓度。

测试结果如图5所示，经过48h的培养，培养基中六价铬离子浓度从100mg/l降低至28.2mg/l，还原率达到71.8％。

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<110>南京工业大学

南京师范大学

<120>一株矿化沉淀重金属铅离子及还原六价铬离子的细菌及其应用

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<213>苏云金芽孢杆菌（bacillusthuringiensis）hm-311株

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