本发明属于伽马射线辐照损伤评价技术领域，具体涉及一种利用斑马鱼胚胎脑部frizzled基因的相对表达量评价低剂量伽马射线辐照损伤的方法。
背景技术：
众所周知，核武器爆炸和核电站重大事故产生的高剂量电离辐射会引起急性辐射损伤。然而长期低剂量电离辐射诱导的生物效应，因其程度较低，观察指标多样，观察难度大等原因，目前仍有许多争议，未能建立检测和评估标准。随着辐照治疗、辐照诊断以及核技术的广泛应用，使人们越来越多地处于低剂量电离辐射中，这种辐射对健康的潜在影响引起了民众的广泛关注。因此，建立低剂量伽马射线辐照损伤的评价方法，对阐明、预测和评估低剂量电离辐射对包括人类在内的脊椎动物的影响和潜在风险，对预防和治疗低剂量伽马射线辐照诱导的人类疾病，对确定低剂量伽马射线的辐照损伤效应，对筛查低剂量伽马射线辐照生物标志物，及对保护暴露于低剂量伽马射线辐照的公众和从业人员具有重要的意义。
斑马鱼（daniorerio）是一种经典的脊椎动物模式生物，由于其饲养相对容易，生命力顽强，繁殖能力强，发育速度快，实验周期短，斑马鱼被广泛应用于生理学、毒理学、病理学、环境效应及肿瘤机制等研究领域，研究成果受到越来越多的关注。人类与斑马鱼高度保守的序列及可获取的基因组数据高度的同源性，是斑马鱼作为理想模式生物的主要原因，也是斑马鱼成为研究电离辐射诱导生物学效应理想材料的主要原因。斑马鱼的早期生命阶段被认为是动物生命周期中对毒物暴露最敏感的阶段，曾被提议作为评估γ辐射毒性效应的相关实验模型。在辐射损伤与辐射防护研究领域，斑马鱼及其胚胎也已经被用来筛选辐射防护药物及研究其作用机理。本发明专利利用斑马鱼胚胎对伽马射线辐照非常敏感的特性，以及斑马鱼胚胎脑部frizzled基因的相对表达量与低剂量伽马射线辐照剂量存在剂量-效应关系的特性，采用斑马鱼胚胎脑部frizzled基因的相对表达量对低剂量伽马射线辐照损伤进行综合评价。
技术实现要素：
针对上述情况，本发明提供一种用斑马鱼胚胎脑部frizzled基因的相对表达量对低剂量伽马射线辐照损伤进行评价的方法。本发明利用斑马鱼胚胎frizzled基因对低剂量伽马射线辐照非常敏感的特性，根据斑马鱼胚胎接受的低剂量伽马射线辐照剂量与脑部frizzled基因的相对表达量之间的剂量-效应关系，通过检测斑马鱼胚胎脑部frizzled基因的相对表达量，评估低剂量伽马射线辐照对斑马鱼胚胎的损伤。其原理是，frizzled基因是wnt信号通路中的关键基因，当frizzled基因开始表达时，表明wnt蛋白与frizzled基因表达的受体结合，wnt信号通路被激活，此时，wnt信号通路的中间产物β-连环蛋白就会在核内沉积，胚胎发育后期，核内沉积的β-连环蛋白就会诱导胚胎产生额外体轴，从而导致胚胎畸形。该方法具有操作简便快速、灵敏度高、准确性好等多重优点。
具体步骤是：
（1）受精卵的采集；
（2）受精卵的培养；
（3）伽马射线辐照；
（4）frizzled基因相对表达量的检测；
（5）综合评价。
其进一步的措施是：
所述受精卵的采集的方法是：
采用5~6月龄的斑马鱼进行繁殖产卵。在交配前2d将斑马鱼雌雄分开养在不同的饲养缸中；繁殖产卵的前夜，将1条雌2条雄亲鱼放入同一交配装置中，雌雄鱼之间用挡板隔开。控制光照周期为14∶10（光照14h，黑暗10h）；黑暗10h后，将雌雄亲鱼之间的隔板拿开，雄鱼排精，雌鱼开始产卵。等产卵结束后，将亲鱼放回各自的饲养缸内，用吸管轻轻地将产卵装置中的粪便及呈白色的死卵除尽，并用孵化液及时冲洗盒内的受精卵，在孵化液中加入几滴1‰的亚甲基蓝溶液以预防鱼卵被细菌感染。孵化液的配方是，10l蒸馏水、0.127gkcl、2.867gnacl、0.817gmgso4·7h2o、0.365g无水cacl2。
所述受精卵的培养的方法是：
收集的斑马鱼受精卵冲洗干净后，放入细胞培养板12孔板中培养，每孔5枚受精卵，每板放10孔，共计50个胚胎。采用2ml的吸管对受精卵进行移动。在12孔板中倒入10ml的孵化液,在28℃±0.5℃的温度条件下培养2h。
所述伽马射线辐照的方法是：
待斑马鱼受精卵培养至2hpf，收集受精卵，每组100枚，置于直径3cm的培养皿中，使斑马鱼受精卵在28℃±0.5℃的温度下接受剂量率为0.078-0.310mgy/h的伽马射线辐照96h。
所述frizzled基因相对表达量的检测的方法是：
斑马鱼胚胎辐照培养至96h后，在显微镜下切取斑马鱼头部，提取总rna，进行rt-pcr检测。其具体步骤为，设计引物为accaggagattgagtttg，在rt-pcr仪中，设定程序为（1）95℃，3min；（2）95℃，10s；（3）67.3℃，30s；（2）和（3）进行39个循环。rt-pcr完成后，最后进行熔融曲线分析，确定frizzled基因的表达量。
所述综合评价的方法是：
在96h时，frizzled基因相对表达量按公式（1）进行计算，
采用frizzled基因的相对表达量来评估低剂量伽马射线辐照对斑马鱼胚胎的生物损伤。当斑马鱼胚胎脑部frizzled基因的相对表达量大于0而小于0.5时，此时的低剂量伽马射线辐照的损伤等级为ⅰ级；当斑马鱼胚胎的frizzled基因的相对表达量大于0.5而小于1时，此时的低剂量伽马射线辐照的损伤等级为ⅱ级；当斑马鱼胚胎的frizzled基因相对表达量大于1时，此时的低剂量伽马射线辐照的损伤等级为ⅲ级。当低剂量伽马射线辐照的损伤等级达到
本发明提出的生物损伤评价方法是，利用斑马鱼胚胎对低剂量伽马射线辐照非常敏感的特性，根据斑马鱼胚胎接受的辐照剂量与frizzled基因相对表达量之间的剂量-效应关系，计算斑马鱼胚胎frizzled基因的相对表达量，采用该相对表达量对低剂量伽马射线辐照的综合毒性进行评估。该方法具有操作简便快速、灵敏度高、准确性好、环境风险小等多重优点。解决了现有低剂量伽马射线辐照损伤评价方法所需周期长、操作复杂、特异性不强等难题。
本发明提供的一种利用斑马鱼胚胎frizzled基因的相对表达量对低剂量伽马射线辐照进行生物损伤评价的方法，与现有技术方法相比，具有以下技术优势：
（1）所选用的斑马鱼取材方便，价格便宜；
（2）所需时间短，96h内即可得到低剂量伽马射线辐照综合毒性效应的评估结果；
（3）操作简便、灵敏度高、准确性好。
具体实施方式
下面将对本发明作进一步说明。
ⅰ材料组成
成年的斑马鱼雌雄鱼，玻璃鱼缸，12孔板，孵化液，1‰的亚甲基蓝溶液，显微镜，伽马射线辐照源。
ⅱ实施方法
采用5~6月龄的斑马鱼进行繁殖产卵。在交配前2d将斑马鱼雌雄分群养在不同的饲养缸中，繁殖产卵的前夜，将雌雄亲鱼按照1∶2的比例放入同一交配装置中，雌雄鱼之间用挡板隔开。控制光照周期为14∶10（光照14h，黑暗10h），黑暗10h后，将雌雄亲鱼之间的隔板拿开，雄鱼会追逐雌鱼，并用身体冲撞雌鱼的腹部，此时雄鱼排精，雌鱼开始产卵。收集的斑马鱼受精卵冲洗干净后，放入细胞培养板12孔板中培养，每孔5枚受精卵，每板放10孔共计50个胚胎。在12孔板中倒入10ml的孵化液,在28℃±0.5℃的条件下进行培养。待斑马鱼受精卵培养至2h，收集受精后2hpf的斑马鱼受精卵，每组100枚，置于直径3cm的培养皿中，使斑马鱼受精卵在28℃±0.5℃的温度下接受剂量率为0.078-0.310mgy/h的伽马射线辐照96h。斑马鱼胚胎发育至96h时，在显微镜下切取斑马鱼头部，提取总rna，进行rt-pcr检测。其具体步骤为，设计引物为accaggagattgagtttg，在rt-pcr仪中，设定程序为（1）95℃，3min；（2）95℃，10s；（3）67.3℃，30s；（2）和（3）进行39个循环。rt-pcr完成后，最后进行熔融曲线分析，确定frizzled基因的表达量。
在96h时，frizzled基因的相对表达量按公式（1）进行计算，
采用frizzled基因的相对表达量来评估低剂量伽马射线辐照对斑马鱼胚胎的生物损伤。当斑马鱼胚胎脑部frizzled基因的相对表达量大于0而小于0.5时，此时的低剂量伽马射线辐照的损伤等级为
ⅲ实施例
实施例1
采用6月龄的斑马鱼进行繁殖产卵。在交配前2d将斑马鱼雌雄分群养在不同的饲养缸中，繁殖产卵的前夜，将雌雄亲鱼按照1∶2的比例放入同一交配装置中，雌雄鱼之间用挡板隔开。控制光照周期为14∶10（光照14h，黑暗10h），黑暗10h后，将雌雄亲鱼之间的隔板拿开，雄鱼会追逐雌鱼，并用身体冲撞雌鱼的腹部，此时雄鱼排精，雌鱼开始产卵。收集的斑马鱼受精卵冲洗干净后，放入细胞培养板12孔板中培养，每孔5枚受精卵，每板放10孔共计50个胚胎。在12孔板中倒入10ml的孵化液,在28℃±0.5℃的条件下进行培养。待斑马鱼受精卵培养至2h，收集受精后2hpf的斑马鱼受精卵，每组100枚，置于直径3cm的培养皿中，使斑马鱼受精卵在28℃±0.5℃的温度下接受剂量率为0.078mgy/h的伽马射线辐照96h。此时斑马鱼胚胎接受的伽马射线辐照的辐照剂量为7.5mgy。此时，在显微镜下切取斑马鱼头部，提取总rna，进行rt-pcr检测。其具体步骤为，在rt-pcr仪中，设定程序为设计引物为accaggagattgagtttg，设定程序为（1）95℃，3min；（2）95℃，10s；（3）67.3℃，30s；（2）和（3）进行39个循环。rt-pcr完成后，最后进行熔融曲线分析，确定frizzled基因的表达量。测定完成后，按公式（1）计算frizzled基因的相对表达量。当斑马鱼胚胎在0.078mgy/h的剂量率下辐照96h，接受7.5mgy的低剂量伽马射线辐照后，frizzled基因的相对表达量为0.12，此时低剂量伽马射线辐照的损伤等级为
实施例2
采用6月龄的斑马鱼进行繁殖产卵。在交配前2d将斑马鱼雌雄分群养在不同的饲养缸中，繁殖产卵的前夜，将雌雄亲鱼按照1∶2的比例放入同一交配装置中，雌雄鱼之间用挡板隔开。控制光照周期为14∶10（光照14h，黑暗10h），黑暗10h后，将雌雄亲鱼之间的隔板拿开，雄鱼会追逐雌鱼，并用身体冲撞雌鱼的腹部，此时雄鱼排精，雌鱼开始产卵。收集的斑马鱼受精卵冲洗干净后，放入细胞培养板12孔板中培养，每孔5枚受精卵，每板放10孔共计50个胚胎。在12孔板中倒入10ml的孵化液,在28℃±0.5℃的条件下进行培养。待斑马鱼受精卵培养至2h，收集受精后2hpf的斑马鱼受精卵，每组100枚，置于直径3cm的培养皿中，使斑马鱼受精卵在28℃±0.5℃的温度下接受剂量率为0.156mgy/h的伽马射线辐照96h。此时斑马鱼胚胎接受的伽马射线辐照的辐照剂量为15mgy。此时，在显微镜下切取斑马鱼头部，提取总rna，进行rt-pcr检测。其具体步骤为，在rt-pcr仪中，设定程序为设计引物为accaggagattgagtttg，设定程序为（1）95℃，3min；（2）95℃，10s；（3）67.3℃，30s；（2）和（3）进行39个循环。rt-pcr完成后，最后进行熔融曲线分析，确定frizzled基因的表达量。测定完成后，测定完成后，按公式（1）计算frizzled基因的相对表达量。当斑马鱼胚胎在0.156mgy/h的剂量率下辐照96h，接受15mgy的低剂量伽马射线辐照后，frizzled基因的相对表达量为0.78，此时低剂量伽马射线辐照的损伤等级为
实施例3
采用6月龄的斑马鱼进行繁殖产卵。在交配前2d将斑马鱼雌雄分群养在不同的饲养缸中，繁殖产卵的前夜，将雌雄亲鱼按照1∶2的比例放入同一交配装置中，雌雄鱼之间用挡板隔开。控制光照周期为14∶10（光照14h，黑暗10h），黑暗10h后，将雌雄亲鱼之间的隔板拿开，雄鱼会追逐雌鱼，并用身体冲撞雌鱼的腹部，此时雄鱼排精，雌鱼开始产卵。收集的斑马鱼受精卵冲洗干净后，放入细胞培养板12孔板中培养，每孔5枚受精卵，每板放10孔共计50个胚胎。在12孔板中倒入10ml的孵化液,在28℃±0.5℃的条件下进行培养。待斑马鱼受精卵培养至2h，收集受精后2hpf的斑马鱼受精卵，每组100枚，置于直径3cm的培养皿中，使斑马鱼受精卵在28℃±0.5℃的温度下接受剂量率为0.310mgy/h的伽马射线辐照96h，此时斑马鱼胚胎接受的伽马射线辐照的辐照剂量为30mgy。此时，在显微镜下切取斑马鱼头部，提取总rna，进行rt-pcr检测。其具体步骤为，在rt-pcr仪中，设定程序为设计引物为accaggagattgagtttg，设定程序为（1）95℃，3min；（2）95℃，10s；（3）67.3℃，30s；（2）和（3）进行39个循环。rt-pcr完成后，最后进行熔融曲线分析，确定frizzled基因的表达量。测定完成后，按公式（1）计算frizzled基因的相对表达量。当斑马鱼胚胎在0.310mgy/h的剂量率下辐照96h，接受30mgy的低剂量伽马射线辐照后，frizzled基因相对表达量为1.45，此时低剂量伽马射线辐照的损伤等级为
以上仅仅是本发明的较佳实施方式，根据本发明的上述构思，本领域的熟练人员还可对此作出各种修改和变换。例如，变换辐照射线的类型、变换斑马鱼的种类、斑马鱼胚胎的培养时间、调整辐照剂量率、采用不同辐照时间和辐照剂量、变换综合毒性评价体系等等。然而，类似的这种变换和修改均属于本发明的实质。