检测新城疫病毒抗体的多肽及其ELISA检测试剂盒的制作方法

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种检测新城疫病毒抗体的多肽及其elisa检测试剂盒。

背景技术：

新城疫(newcastledisease，nd)是由新城疫病毒引起的鸡和多种禽类的急性高度接触性传染病，该病传播迅速，病死率高，是危害养禽业的重大疫病之一。本病的主要特征是呼吸困难、腹泻、神经紊乱、黏膜和浆膜出血。该病可造成重大的经济损失，被oie规定为必须报告的疫病，因此世界各国对本病的发生和流行均高度重视。

新城疫病毒(newcastlediseasevirus，ndv)属于副黏病毒科、禽腮腺炎病毒属，完整病毒粒子近圆形，直径为100～500nm。该病毒具有囊膜结构，病毒核酸类型为单股不分节段的rna，在ndv基因组上依次排列着np、p、m、f、hn和l基因，分别编码核衣壳蛋白(np)、磷蛋白(p)、基质蛋白(m)、融合蛋白(f)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(hn)和大分子蛋白(l)。np蛋白是一种与病毒增殖密切相关的蛋白，对病毒核衣壳的形成至关重要，它可以包裹基因组rna形成一个螺旋的核衣壳，对病毒rna有保护作用。p蛋白位于核衣壳内，是rna依赖的rna聚合酶的两个亚单位之一，主要作用是参与病毒基因组的复制和转录。此外，p蛋白还通过其n端与新城疫病毒的n蛋白结合，抑制n蛋白的自我装配，从而防止不含病毒rna的核衣壳的形成。m蛋白是存在于病毒囊膜内层的一种非糖基化蛋白，在病毒装配的过程中对病毒囊膜的形成、核衣壳与囊膜之间的识别、维持病毒粒子结构完整性有着重要的作用。f蛋白为ndv主要的结构蛋白，位于病毒囊膜上，负责病毒与易感细胞发生融合，从而使病毒进入细胞并产生溶血现象，其蛋白裂解位点与病毒毒力有关。hn蛋白是一种既有血凝素(ha)活性又有神经氨酸酶(na)活性的糖蛋白，是ndv重要的毒力蛋白和保护性抗原，与f基因共同决定着ndv的毒力强弱。l蛋白为ndv最大的蛋白，它是rna依赖性的rna聚合酶的主要组成部分，可与np蛋白和p蛋白共同构成病毒复制复合体，该复合体参与病毒基因组的转录和复制。

目前，我国对于新城疫的防控采取了以疫苗免疫为主的综合性防控措施。长期以来对疫苗免疫效果的评估主要采用血凝抑制试验的方法，认为血凝抑制效价大于或等于4log2判定为抗体水平阳性，免疫合格；血凝抑制效价小于4log2则判定为抗体水平阴性；通常认为血凝抑制效价达到1:8log2及以上时，则具有高抗体水平。但该方法需要新鲜制备的鸡红细胞，从而涉及复杂的生物材料获取，而且鸡红细胞的质量对结果的评定影响较大；操作时需要倍比稀释血清且步骤较多，导致该方法操作时比较复杂，尤其常规检测或监测抗体水平时通常涉及非常多的样品，从而导致该方法需要极大的工作量，造成很大的困难；另外，该方法的结果判定时受红细胞质量、人为主观判定因素等影响较大，导致结果判定通常存在一定的差异性。

长期以来，研究人员一直试图开发一种简便、易于标准化、适合大量血清样品检测的方法。elisa技术是一种常用的、标准化、较为灵敏、且适合大量血清样品检测的技术。但长期以来，前期开发的检测新城疫病毒血清抗体水平的elisa检测试剂盒其要么灵敏度不能达到临床要求(血凝抑制效价4log2)，要么特异性不佳(与其他鸡病原的抗体有交叉反应)。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种检测新城疫病毒抗体的多肽及其elisa检测试剂盒，该多肽和试剂盒能高灵敏度和高特异性地检测血清中新城疫病毒的抗体水平；适合作为新城疫疫苗免疫后抗体水平检测和监测的工具，具有重要意义和价值，也是临床的迫切需求。

为了实现第一目的，本发明提供了一种检测新城疫病毒抗体的多肽，所述多肽为ndv-f、ndv-h1、ndv-h2、ndv-h3和ndv-h4中任意一种，其中，

ndv-f的氨基酸序列为lnkleesnrkldkvn，如seqidno.1所示；

ndv-h1的氨基酸序列为

savfdstsrsritrvsssstkaayttstcfk，如seqidno.2所示；

ndv-h2的氨基酸序列为pdeqdyqir，如seqidno.3所示；

ndv-h3的氨基酸序列为

pdeqdyqirmakssykpgrfggkriqqails，如seqidno.4所示；

ndv-h4的氨基酸序列为

ryndtcpdeqdyqirmakssykpgrfggkriqqails，如seqidno.5所示。

作为优选方案，所述多肽为ndv-h4，其氨基酸序列为ryndtcpdeqdyqirmakssykpgrfggkriqqails，如seqidno.5所示。

上述五个检测新城疫病毒抗体的多肽是在分析鸡新城疫病毒hn蛋白和f蛋白序列的基础上，根据序列保守性、序列亲水性、b细胞表位预测等分析，筛选了5种多肽。其中，ndv-h4反应性最好。

为了实现第二个目的，本发明还提供了一种检测新城疫病毒抗体的elisa检测试剂盒，其特征在于：所述elisa检测试剂盒包含有与牛血清白蛋白bsa偶联的多肽的酶标板。

作为优选方案，所述elisa检测试剂盒还包括辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鸡igγ，血清稀释液，洗涤液，标准阳性对照，阴性对照，底物液a，底物液b和终止液。

作为优选方案，所述洗涤液每升中含有kh2po40.2g，na2hpo4·12h2o2.9g，nacl8.0g，kcl0.2g，tween-200.5ml；

所述封闭液：脱脂乳5g，加洗涤缓冲液至100ml；

所述血清稀释液：牛血清白蛋白(bsa)2g，脱脂乳5g，加洗涤缓冲液至100ml；

所述酶标抗体：将辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鸡igγ使用血清稀释液稀释8000倍制备；

所述底物液a：0.2mna2hpo425.7ml，0.1m柠檬酸24.3ml，加蒸馏水至50ml，使用前加入3％h2o2150μl；

所述底物液b：0.2mna2hpo425.7ml，0.1m柠檬酸24.3ml，加蒸馏水至50ml，使用前加入2mg/ml的tmb乙醇溶液2.5ml；

所述底物液：底物液a与底物液b等比例混匀，现配现用；

所述终止液：2.5ml氢氟酸(hf)加到900ml注射用水中，并定容至1000ml；

所述标准阳性对照：新城疫病毒疫苗免疫spf鸡制备的血清，其血凝抑制效价为10log2；

所述阴性对照：一月龄spf鸡采集的血清。

上述检测新城疫病毒抗体的elisa检测试剂盒检测鸡血清中新城疫抗体的方法，包括以下步骤：

1)待测样品的准备：取动物全血，待血液充分凝固后，4000r/min离心10min，收集上清；得到待测样品

2)各样品的稀释：

a.待检样品的稀释：取待测样品，用样品稀释液按1:40稀释，并充分混匀；

b.阴性血清的稀释：取1份阴性血清，用样品稀释液按1:40稀释，并充分混匀；

c.标准阳性血清的稀释：取已知hi效价的1份ndv标准阳性血清，用样品稀释液按1：40～1：2560倍比稀释，充分混匀后依次加入至酶标板孔中；

3)取-20℃保存的含有与bsa偶联的多肽的酶标板，先用1×洗涤液洗涤抗原包被板1次，取100μl稀释好的待检样品加至抗原包被板中，37℃温育45min；

4)弃去孔中液体，每孔加入1×洗涤液200μl，重复洗涤3次，每次静置3min，最后一次拍干；

5)每孔加入羊抗鸡igγ二抗100μl，37℃温育30min；

6)弃去孔中液体，用1×洗涤液重复洗板5次，每次静置3min，最后一次拍干；

7)每孔加入100μl底物显色液，37℃避光显色15min；

8)待显色完成后每孔加入50μl终止液终止反应，10min内在酶标仪上测od630nm值；

9)结果判定：通过标准阳性血清倍比稀释所得od值绘制标准曲线，并进行od值与hi效价换算，通过比较检测血清的换算hi效价是否达到临床hi试验阴阳性的判定标准(临床中以hi效价≥4log2的抗体判定为ndv阳性抗体，反之即为阴性)，从而确定检测血清的阴阳性：

当所述待检血清检测结果为换算的hi效价≥4log2时，判定为待检血清中存在抗新城疫病毒的抗体(即阳性)；

反之，当所述待检血清检测结果为换算的hi效价<4log2时，判定为待检血清中不存在抗新城疫病毒的抗体(即阴性)。

本发明的有益效果：

本发明一种应用多肽检测新城疫病毒抗体的elisa检测试剂盒是一种易于标准化、较为灵敏、且适合大量血清样品检测的技术。应用该elisa试剂盒对临床来源的449份鸡血清样本进行检测，同时使用hi试验进行平行检测。相比较于hi试验，该方法检测临床样品的阳性符合率为98.8％；阴性符合率为97％；阴阳性总符合率为98.7％。该方法具有良好的敏感性和特异性，与hi试验所判定的阴阳性有较高的符合率，能够有效监测评估新城疫疫苗免疫后的鸡血清抗体水平，对nd的防控具有重要意义和价值。

附图说明

图1为ndv标准阳性血清的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

实施例1检测鸡新城疫病毒抗体的多肽分析

根据鸡新城疫病毒hn蛋白的氨基酸序列，通过blast软件分析其相对的保守位点，并结合蛋白序列的亲水性分析(hydrophilicity)、柔性(flexibility)、非遮蔽性(accessibility)等综合分析蛋白的b细胞表位(http://crdd.osdd.net/raghava/bcepred/)，选取了4种序列作为候选多肽序列，即：ndv-h1，ndv-h2、ndv-h3和ndv-h4。

根据鸡新城疫病毒f蛋白的氨基酸序列，通过blast软件分析其相对的保守位点，并结合蛋白序列的亲水性分析(hydrophilicity)、柔性(flexibility)、非遮蔽性(accessibility)等综合分析蛋白的b细胞表位(http://crdd.osdd.net/raghava/bcepred/)，选取了1种序列作为候选多肽序列，即：ndv-f。

将这些候选多肽序列在ncbi网站上做序列特异性分析，发现这几种多肽序列除了在禽新城疫病毒中存在外，另外只在xanthomonascitri中发现有同源序列，并不干扰该多肽作为鸡新城疫病毒抗体检测的特异性。

因此，将这些多肽委托武汉百意欣生物技术有限公司合成，并通过色谱对其进行了纯化。多肽序列如下：

seqidno.1:lnkleesnrkldkvn，命名为ndv-f，如seqidno.1所示；

seqidno.2:savfdstsrsritrvsssstkaayttstcfk，命名为ndv-h1，如seqidno.2所示；

seqidno.3:pdeqdyqir，命名为ndv-h2，如seqidno.3所示；

seqidno.4:pdeqdyqirmakssykpgrfggkriqqails，命名为ndv-h3，如seqidno.4所示；

seqidno.5:ryndtcpdeqdyqirmakssykpgrfggkriqqails，命名为ndv-h4，如seqidno.5所示；

实施例2检测鸡新城疫病毒抗体的多肽的筛选

将上述人工合成的多肽采用戊二醛法将其与bsa载体蛋白偶联，以提高多肽包被效率。具体方法为：2mg载体bsa溶解于2mlpbs缓冲液(0.01mol/l，ph7.4)中，于pbs缓冲液中室温透析过夜；取1mg/ml多肽加至2ml的载体bsa溶液中，边加边搅拌，向上述混合液中滴加1ml0.2％戊二醛溶液，边加边搅拌。室温条件下搅拌4h，向上述混合液中加入400μl1mol/l甘油，继续搅拌1h，使之终止反应；将上述混合液装入透析袋，置于pbs缓冲液中4℃透析过夜；收集多肽载体偶联物，-80℃保存。

将上述得到的偶联后多肽分别使用包被液按1:40稀释后加入酶标板中，每条多肽各加1列，每孔100μl，置2～8℃下作用15h。弃去包被液，每孔加入200μl封闭液，置37℃温育1h，弃孔内封闭液。通过样品稀释液对ndv阳性血清和阴性血清分别做1:40、1:80、1:160、1:320稀释，将阴性、阳性血清每个稀释度分别加至不同抗原多肽包被孔中，测定各孔od630nm值，并计算p/n值，选择p/n值最大的多肽作为最佳反应多肽，用于检测ndv抗体间接elisa方法的建立，结果如表1所示。

表1检测ndv抗体的多肽与bsa偶联物的筛选结果(od630nm值)

将以上得到的4种偶联多肽作为抗原，检测其与ndv阳性血清与阴性血清的反应性，通过p/n值选择最佳反应多肽。通过检测发现，ndv-h4多肽的p/n值最大，因此选择ndv-h4多肽用于检测ndv抗体elisa方法的建立。

实施例3新城疫病毒elisa抗体检测试剂盒的抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

按方阵滴定法进行抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定，用包被液将ndv-h4多肽与bsa偶联物按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600稀释后，分别加入到酶标板中，每个稀释度加1列，每孔100μl，置2～8℃下作用15小时。弃去包被液，每孔加入200μl封闭液(5％脱脂乳)，置37℃下温育1小时，弃孔内封闭液。用样品稀释液将新城疫病毒阳性血清做1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120稀释，阴性血清做1:40、1:80稀释，将阳性血清、阴性血清的每个稀释度分别加入到不同抗原浓度的包被孔中进行elisa检测，测定各孔od630nm值。根据各孔读值选择最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释浓度。结果如表2所示。

表2确定最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度的方阵滴定结果(od630nm值)

方阵滴定结果显示，当抗原稀释度为1:800，阳性血清稀释度为1:40时，其hi效价为10log2，将阳性血清稀释至hi效价为4log2时的od630nm值为0.4736(临床上通常以hi效价<4log2时判定该血清为阴性)，明显大于1:40稀释的阴性血清的od630nm值0.088。因此选择抗原最佳稀释浓度为1:800稀释，血清最佳稀释度为1:40稀释。

因此，该elisa试剂盒的抗原包被板采用的是在酶标板上加入上述ndv-h4多肽与bsa偶联物溶液，2～8℃孵育15小时后，弃去孔中的包被液，每孔加封闭液200μl，37℃温育1小时，-20℃保存。检测抗体的稀释浓度为1:40。

实施例4阴阳性判定标准的确定及敏感性、特异性、与hi阴阳性符合率的检测

通过对已知hi效价的ndv阳性血清进行测定，根据其倍比稀释血清的od值绘制标准曲线，并进行od值与hi效价换算。该方法对hi效价在4log2～8log2之间的阳性血清的检测呈明显线性关系，r²＝0.9902，表明该线性关系良好，结果如图1所示。根据阳性血清hi效价在4log2的od值确定阴阳性判定标准，通过od值与hi效价进行换算，当检测血清的换算hi效价≥4log2时判定该血清为阳性；检测血清的换算hi效价<4log2时判定该血清为阴性。

应用该elisa试剂盒对5份ndv阴性血清进行检测，其od630nm值依次为0.0918、0.1685、0.055、0.0206、0.1332，其换算的hi效价均小于4log2，说明该方法检测结果与hi试验检测结果一致，即5份血清均为阴性。

为了确定elisa试剂盒的敏感性，对随机挑选的5份已知hi效价的临床阳性血清做1：40～1：2560倍比稀释进行检测，其结果如表3所示，表明该elisa试剂盒可以准确检测到hi效价为4log2及以上的血清。即可以区分hi试验所区分的阴阳性血清，与hi试验的敏感性基本一致。

表3elisa方法检测倍比稀释临床阳性血清的结果(od630nm值)

为了确定elisa试剂盒的特异性，应用该elisa方法对禽流感病毒h5亚型(aiv-h5)、禽流感病毒h7亚型(aiv-h7)、禽流感病毒h9亚型(aiv-h9)、鸡传染性支气管炎病毒(ibv)、鸡传染性法氏囊病毒(ibdv)阳性血清进行检测，其od630nm值分别为0.116、0.1716、0.2134、0.0969、0.1612，其换算的hi效价均低于4log2，说明ndv-h4多肽特异性良好，与其他鸡主要传染病阳性血清不存在交叉反应。

为了进一步确定试剂盒临床检测时与hi试验的符合率，应用该试剂盒与hi试验平行检测临床来源的449份鸡血清样本，检测结果如表4所示。相比较于hi试验，该试剂盒检测临床样品的阳性符合率为(411÷416)×100％＝98.8％；阴性符合率为(32÷33)×100％＝97％；阴阳性总符合率为(443÷449)×100％＝98.7％。

表4试剂盒与hi试验检测临床样品的阴阳性符合率

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。