本发明属于合成药物化学
技术领域：
，具体是新型的含有手性脯氨酸结构的异吲哚酮并环六肽类似物的制备方法，还涉及该衍生物在抗肿瘤领域的用途。
背景技术：
：肽类化合物在自然界中广泛存在，呈现多种多样的药理作用，特别是在抗菌和抗肿瘤领域有重要应用。基于肽药物的研究已成为开发新药的重要方向。天然环七肽phakellistatin6是从phakella属海绵中分离得到的一类富含脯氨酸残基的环肽化合物，化学名为环-(pro-phe-pro-trp-leu-pro-ile)七肽，细胞测试研究显示其对p388白血病细胞有很强的生长抑制作用(ic50＝0.18μg/ml)，因此phakellistatin6有望成为新型抗肿瘤药物的先导化合物，在抗癌领域具有非常好的开发前景。但天然产物中含量极低，提取分离较为困难，不能满足科研和社会的需要，而目前已有资料中未见有关该化合物的合成报道。更重要的是，很多环肽的构象对其抗肿瘤活性有极其重要的影响，其中氨基酸的构型尤其值得关注。因此进一步探索手性结构对活性的影响，深入研究其药理作用，对phakellistatin6进行结构修饰并合成其类似物显得尤为重要。因此，基于药物设计的原理，设计结构新颖的phakellistatin6的环肽类似物，保留其结构的关键氨酸酸序列，去除先导物中的易氧化变质的色氨酸残基，并引入刚性较强的异吲哚酮片断，改变序列中脯氨酸的构型，从而有效提高目标化合物的稳定性和抗肿瘤活性。系统研究类似物的体外抗肿瘤活性，并与上市药物如紫杉醇进行对照，非常有希望开发出新型的抗肿瘤药物。技术实现要素：本发明目的是在于提供手性异吲哚酮并环六肽衍生物、其制备办法及用途，解决现有phakellistatin6环肽提取分离困难，难以满足实际需要的问题。本发明手性异吲哚酮并环六肽衍生物的化学名称为3-羟基-异吲哚酮并环(甘氨酰-脯氨酰-l-亮氨酰-脯氨酰-l-异亮氨酰-脯氨酰苄胺)，其中脯氨酸构型为纯的l型或d型，其c-3位为纯的r构型或s构型，结构式为：其中r&s表示该碳原子的手性为r或s型。本发明所述的手性异吲哚酮并环六肽衍生物的制备方法通过如下反应过程实现：手性异吲哚酮并环六肽衍生物的制备方法是按以下步骤进行：一、①将boc-脯氨酸溶解在溶剂ⅰ中，在缩合剂ⅰ催化下与n-三甲基硅甲基苄胺缩合，再采用三氟乙酸脱去氨基端的boc保护，得到中间产物ⅰ；②将boc-l-异亮氨酸溶解在溶剂ⅱ中，在缩合剂ⅱ催化下与中间产物ⅰ缩合，再采用三氟乙酸脱去氨基端的boc保护，得到中间产物ⅱ；③将boc-脯氨酸溶解在溶剂ⅲ中，在缩合剂ⅲ催化下与中间产物ⅱ缩合，再采用三氟乙酸脱去氨基端的boc保护，得到中间产物ⅲ；④将boc-l-亮氨酸溶解在溶剂ⅳ中，在缩合剂ⅳ催化下与中间产物ⅲ缩合，再采用三氟乙酸脱去氨基端的boc保护，得到中间产物ⅳ；⑤将boc-脯氨酸溶解在溶剂ⅴ中，在缩合剂ⅴ催化下与中间产物ⅳ缩合，再采用三氟乙酸脱去氨基端的boc保护，得到线性肽n-末端三甲基硅甲基苄基取代的五肽；步骤①中boc-脯氨酸与缩合剂ⅰ的摩尔比为1:(1～3)，步骤①中所述boc-脯氨酸与n-三甲基硅甲基苄胺的量的关系为等当量；步骤①中boc-脯氨酸的构型为纯的l-或d-脯氨酸；步骤②中boc-l-异亮氨酸与缩合剂ⅱ的摩尔比为1:(1～3)，步骤②中boc-l-异亮氨酸与中间产物ⅰ的量的关系为等当量；步骤③中boc-脯氨酸与缩合剂ⅲ的摩尔比为1:(1～3)，步骤③中boc-脯氨酸与中间产物ⅱ的量的关系为等当量，步骤③中boc-脯氨酸的构型为纯的l-脯氨酸或d-脯氨酸；步骤④中boc-l-亮氨酸与缩合剂ⅳ的摩尔比为1:(1～3)，步骤④中boc-l-亮氨酸与中间产物ⅲ的量的关系为等当量；步骤⑤中boc-脯氨酸与缩合剂ⅴ的摩尔比为1:(1～3)，步骤⑤中boc-脯氨酸与中间产物ⅳ的量的关系为等当量；步骤⑤中boc-脯氨酸的构型为纯的l-脯氨酸或d-脯氨酸；所述溶剂ⅰ为卤代烃或四氢呋喃，所述溶剂ⅱ为卤代烃或四氢呋喃，所述溶剂ⅲ为卤代烃或四氢呋喃，所述溶剂ⅳ为卤代烃或四氢呋喃，所述溶剂ⅴ为卤代烃或四氢呋喃；所述缩合剂ⅰ为2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉或二环己基碳二亚胺，所述缩合剂ⅱ为2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉或二环己基碳二亚胺，所述缩合剂ⅲ为2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉或二环己基碳二亚胺，所述缩合剂ⅳ为2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉或二环己基碳二亚胺，所述缩合剂ⅴ为2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉或二环己基碳二亚胺；二、将线性肽n-末端三甲基硅甲基苄基取代的五肽和缚酸剂溶于溶剂中，得到反应液，将反应液的温度从室温冷却至0℃后，在温度为-10～40℃和搅拌的条件下将邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液滴入到反应液中，然后反应1～1.5h，用水洗涤反应液3～5次，有机层用无水硫酸钠干燥，真空除去溶剂，所得粗产品采用柱层析分离纯化，得到白色固体，即为n-三甲基硅甲基-n-苄基-邻苯二甲酰甘氨酰-d-脯-l-亮-d-脯-l-异亮-d-脯氨酰胺；所述线性肽n-末端三甲基硅甲基苄基取代的五肽与缚酸剂的摩尔比1:(4～6)；所述邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液的浓度为(0.5～5mol/l)；所述邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液与线性肽n-末端三甲基硅甲基苄基取代的五肽的体积比为1:(4～10)；邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液中的溶剂为二氯甲烷或1,4-二氧六环；三、将n-三甲基硅甲基-n-苄基-邻苯二甲酰甘氨酰-d-脯-l-亮-d-脯-l-异亮-d-脯氨酰胺溶解在溶剂中，通入氮气10～50min，在氮气保护下用紫外光照射5～120min，撤光源并结束反应；反应液浓缩后，残余物用溶剂稀释，氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，残余物用硅胶柱层析分离纯化得到一对目标环肽化产物；所述溶剂为卤代烷或醇类溶剂；所述的紫外光源为pyrex管过滤的紫外光线，其波长λ>290nm；所述的一对目标环肽化产物为c-3-r型产物和c-3-s型产物。手性异吲哚酮并环六肽衍生物的用途是将手性异吲哚酮并环六肽衍生物用于抑制人肝癌hepg2细胞和人宫颈癌hela细胞。本发明的优点：本发明提供了phakellistatin6类似物的合成方法，其操作方便，反应条件较为简便；本发明所述化合物去掉了先导物结构中的易氧化的色氨酸，在相应位置引入了异吲哚酮片断，从而得到新型结构的产物，其手性特征对活性有明显影响，有很高的医学价值；活性实验表明，与紫杉醇相比，本发明所得部分产物具有更好的抗肿瘤活性，其手性特征对活性有明显影响，对药物开发有重要的推动作用。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式手性异吲哚酮并环六肽衍生物的化学名称为3-羟基-异吲哚酮并环(甘氨酰-脯氨酰-l-亮氨酰-脯氨酰-l-异亮氨酰-脯氨酰苄胺)，其中脯氨酸构型为纯的l型或d型，其c-3位为纯的r构型或s构型，结构式为：其中r&s表示该碳原子的手性为r或s型。本实施方式所述c-3位为手性碳原子。具体实施方式二：本实施方式手性异吲哚酮并环六肽衍生物的制备方法是按以下步骤进行：一、①将boc-脯氨酸溶解在溶剂ⅰ中，在缩合剂ⅰ催化下与n-三甲基硅甲基苄胺缩合，再采用三氟乙酸脱去氨基端的boc保护，得到中间产物ⅰ；②将boc-l-异亮氨酸溶解在溶剂ⅱ中，在缩合剂ⅱ催化下与中间产物ⅰ缩合，再采用三氟乙酸脱去氨基端的boc保护，得到中间产物ⅱ；③将boc-脯氨酸溶解在溶剂ⅲ中，在缩合剂ⅲ催化下与中间产物ⅱ缩合，再采用三氟乙酸脱去氨基端的boc保护，得到中间产物ⅲ；④将boc-l-亮氨酸溶解在溶剂ⅳ中，在缩合剂ⅳ催化下与中间产物ⅲ缩合，再采用三氟乙酸脱去氨基端的boc保护，得到中间产物ⅳ；⑤将boc-脯氨酸溶解在溶剂ⅴ中，在缩合剂ⅴ催化下与中间产物ⅳ缩合，再采用三氟乙酸脱去氨基端的boc保护，得到线性肽n-末端三甲基硅甲基苄基取代的五肽；步骤①中boc-脯氨酸与缩合剂ⅰ的摩尔比为1:(1～3)，步骤①中所述boc-脯氨酸与n-三甲基硅甲基苄胺的量的关系为等当量；步骤①中boc-脯氨酸的构型为纯的l-或d-脯氨酸；步骤②中boc-l-异亮氨酸与缩合剂ⅱ的摩尔比为1:(1～3)，步骤②中boc-l-异亮氨酸与中间产物ⅰ的量的关系为等当量；步骤③中boc-脯氨酸与缩合剂ⅲ的摩尔比为1:(1～3)，步骤③中boc-脯氨酸与中间产物ⅱ的量的关系为等当量，步骤③中boc-脯氨酸的构型为纯的l-脯氨酸或d-脯氨酸；步骤④中boc-l-亮氨酸与缩合剂ⅳ的摩尔比为1:(1～3)，步骤④中boc-l-亮氨酸与中间产物ⅲ的量的关系为等当量；步骤⑤中boc-脯氨酸与缩合剂ⅴ的摩尔比为1:(1～3)，步骤⑤中boc-脯氨酸与中间产物ⅳ的量的关系为等当量；步骤⑤中boc-脯氨酸的构型为纯的l-脯氨酸或d-脯氨酸；所述溶剂ⅰ为卤代烃或四氢呋喃，所述溶剂ⅱ为卤代烃或四氢呋喃，所述溶剂ⅲ为卤代烃或四氢呋喃，所述溶剂ⅳ为卤代烃或四氢呋喃，所述溶剂ⅴ为卤代烃或四氢呋喃；所述缩合剂ⅰ为2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉或二环己基碳二亚胺，所述缩合剂ⅱ为2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉或二环己基碳二亚胺，所述缩合剂ⅲ为2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉或二环己基碳二亚胺，所述缩合剂ⅳ为2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉或二环己基碳二亚胺，所述缩合剂ⅴ为2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉或二环己基碳二亚胺；二、将线性肽n-末端三甲基硅甲基苄基取代的五肽和缚酸剂溶于溶剂中，得到反应液，将反应液的温度从室温冷却至0℃后，在温度为-10～40℃和搅拌的条件下将邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液滴入到反应液中，然后反应1～1.5h，用水洗涤反应液3～5次，有机层用无水硫酸钠干燥，真空除去溶剂，所得粗产品采用柱层析分离纯化，得到白色固体，即为n-三甲基硅甲基-n-苄基-邻苯二甲酰甘氨酰-d-脯-l-亮-d-脯-l-异亮-d-脯氨酰胺；所述线性肽n-末端三甲基硅甲基苄基取代的五肽与缚酸剂的摩尔比1:(4～6)；所述邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液的浓度为(0.5～5mol/l)；所述邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液与线性肽n-末端三甲基硅甲基苄基取代的五肽的体积比为1:(4～10)；邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液中的溶剂为二氯甲烷或1,4-二氧六环；三、将n-三甲基硅甲基-n-苄基-邻苯二甲酰甘氨酰-d-脯-l-亮-d-脯-l-异亮-d-脯氨酰胺溶解在溶剂中，通入氮气10～50min，在氮气保护下用紫外光照射5～120min，撤光源并结束反应；反应液浓缩后，残余物用溶剂稀释，氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，残余物用硅胶柱层析分离纯化得到一对目标环肽化产物；所述溶剂为卤代烷或醇类溶剂；所述的紫外光源为pyrex管过滤的紫外光线，其波长λ>290nm；所述的一对目标环肽化产物为c-3-r型产物和c-3-s型产物。采用mtt法研究本实施方式制备的n-三甲基硅甲基-n-苄基-邻苯二甲酰甘氨酰-l-thc-d-缬-l-色-d-亮-l-缬-d-缬-l-缬酰胺体外抗肿瘤活性，其检测原理为活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能把外源性mtt还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒沉积在细胞中，而死细胞并无此功能。加入二甲基亚砜溶解将甲瓒溶解，之后用酶标仪在490nm处测其吸光度值，可间接反映活细胞数量。其具体操作步骤为：测试分为空白组、紫杉醇对照组和实验组：将对数生长期(4000个/ml)的人肝癌hepg2细胞用胰蛋白酶消化后,用质量分数为10％的小牛血清培养基配成细胞浓度为6000个/ml的细胞悬液,接种于96孔培养板中.实验组分别给予不同浓度的样品.每个剂量重复做六个孔。给药后培养48h,每孔加入mtt溶液(100μl,0.5mg/ml),继续在37℃培养4h,弃去上清液,加入150μldmso溶解甲臜沉淀,用振荡器混匀后,在酶标仪上于490nm波长处,测定光密度(od)值。细胞存活率(％)用下面的公式计算:存活率(％)＝a490(样品)/a490(对照)×100％在a490(样品)代表不同浓度样品处理细胞的吸光度值，a490(对照)代表用dmem+10％胎牛血清细胞的吸光度值。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤一①～⑤所述缩合的反应温度均为10～50℃。其它与具体实施方式二相同。具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三之一不同的是：步骤二中所述柱层析分离纯化中的洗脱液为乙酸乙酯与石油醚按体积比1:(1～5)的混合。其它与具体实施方式二或三相同。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：步骤三中所述硅胶柱层析分离纯化中的洗脱液为乙酸乙酯与石油醚按体积比1:(1～5)的混合。其它与具体实施方式二至四之一相同。具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是：步骤三中所述卤代烃均为二氯甲烷、三氯甲烷或1,2-二氯乙烷，所述醇为甲醇或乙醇。其它与具体实施方式二至五之一相同。具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是：步骤二中所述缚酸剂为三乙胺。其它与具体实施方式二至六之一相同。具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二至七之一不同的是：所用氨基酸均为手性化合物。其它与具体实施方式二至七之一相同。具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二至八之一不同的是：步骤三中得到的目标环肽化产物为光学纯化合物。其它与具体实施方式二至八之一相同。具体实施方式十：本实施方式手性异吲哚酮并环六肽衍生物的用途是将手性异吲哚酮并环六肽衍生物用于抑制人肝癌hepg2细胞和人宫颈癌hela细胞。通过以下实施例验证本发明的有益效果：实施例一：①将boc-d-脯氨酸(2.15g，0.01mol)溶于30ml二氯甲烷中，加入等当量的eedq(3.78g，15mmol)和n-(三甲基硅基甲基)苄胺(1.93g，10mmol)，室温搅拌过夜。减压除去二氯甲烷，加入15ml水，用60ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机层并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到浅黄色油状物；将上步产物溶于10ml二氯甲烷中，加入10ml三氟乙酸，室温搅拌2h脱去boc保护。产物经柱层析纯化(洗脱液∶v乙酸乙酯:v正己烷＝1:2)得2.75g浅黄色油状物n-(三甲基硅基甲基)苄基-d-脯氨酰胺。②将boc-l-异亮氨酸(1.62g，7mmol)溶解在20ml二氯甲烷中，加入10.5mmoleedq，和上步产物n-(三甲基硅基甲基)苄基-d-脯氨酰胺，室温搅拌10h，减压除去溶剂，加入10ml水，用乙酸乙酯萃取，合并浓缩有机层得到浅黄色油状物，再采用三氟乙酸室温搅拌2h，脱去boc保护，以柱层析方法纯化产物，得到2.35g白色固体ile-d-pro-si(ch3)3。③将boc-d-脯氨酸(5.6mmol)溶解在16ml二氯甲烷中，加入等当量eedq和上步产物，室温搅拌12h，减压除去溶剂，加入10ml水，用乙酸乙酯萃取，浓缩有机层得到浅黄色油状物，再采用三氟乙酸脱去boc保护，以柱层析方法纯化产物，得到白色固体d-pro-ile-d-pro-si(ch3)3，产率85.0％。④将boc-l-亮氨酸(4.7mmol)溶解在二氯甲烷中，加入等当量eedq和上步产物，室温搅拌12h，减压除去溶剂，加入15ml水，用乙酸乙酯萃取，浓缩有机层得到油状物，再采用三氟乙酸脱去boc保护，以柱层析方法纯化产物，得到白色固体l-leu-d-pro-ile-d-pro-si(ch3)3，产率71.0％。⑤将boc-d-脯氨酸(3.3mmol)溶解在二氯甲烷中，加入等当量eedq和上步产物，室温搅拌10h，减压除去溶剂，加入10ml水，用乙酸乙酯萃取，浓缩有机层，粗品再采用三氟乙酸脱去boc保护，以柱层析方法纯化产物，得到n-末端三甲基硅甲基苄基取代的五肽d-pro-l-leu-d-pro-l-ile-d-pro-si(ch3)3(白色固体)，产率76％。⑥将线性肽n-末端三甲基硅甲基苄基取代的五肽(0.75g，10mmol)和三乙胺(3ml)溶于20ml干燥二氯甲烷中，冷却到0℃，在搅拌下将邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液(0.25g，10mmol先溶于3ml二氧六环)滴入到反应液中。然后搅拌1h，反应液用20ml水洗两次，用无水硫酸钠干燥有机层，减压浓缩，粗产品用柱层析分离纯化(洗脱液∶v乙酸乙酯:v正己烷＝1:1)，得到白色固体5，即为n-三甲基硅甲基-n-苄基-邻苯二甲酰甘氨酰-d-脯-l-亮-d-脯-l-异亮-d-脯氨酰胺，产率86％。⑦取所得的n-三甲基硅甲基-n-苄基-邻苯二甲酰甘氨酰-d-脯-l-亮-d-脯-l-异亮-d-脯氨酰胺0.5g溶解在甲醇中，通氮气20min，在氮气保护下用pyrex管过滤中压汞灯照射20min，撤光源并结束反应。反应液浓缩，用硅胶柱层析分离提纯化得一对目标环肽化产物3-s-羟基-异吲哚酮并环(甘-d-脯-l-亮-d-脯-l-异亮-d-脯氨酰苄胺)(化合物a)和3-r-羟基-异吲哚酮并环(甘-d-脯-l-亮-d-脯-l-异亮-d-脯氨酰苄胺)(化合物b)。3-s-羟基-异吲哚酮并环(甘-d-脯-l-亮-d-脯-l-异亮-d-脯氨酰苄胺)(化合物a):whitesolid(yield40％).1hnmr(cdcl3,400mhz)δ:0.72～1.00(m,12h,ch3),1.15～1.35(m,2h,ch2ch)3),1.37～1.47(m,1h,chch3),1.49～1.72(m,3h,ch(ch3)2andchch2ch),1.75～1.85(m,6h,(nch2ch2ch2ch)3),1.90～2.20(m,2h,nch2ch2ch2ch),2.25～2.45(m,4h,(nch2ch2ch2ch)2),3.28～3.40(m,2h,ch2ph),3.45～3.85(m,6h,(nch2ch2ch2ch)3),3.90～4.28(m,3h,nch2coandnch2ch2ch2ch),4.30～4.45(m,1h,nch2ch2ch2ch),4.47～4.58(m,1h,nch2ch2ch2ch),4.60～4.75(m,1h,hnchco),4.78～4.82(m,2h,nch2co(oh)),4.85～4.99(m,1h,hnchco),7.01～7.79(m,9h,arh)；13cnmr(cdcl3,400mhz)δ:11.0,11.3,16.0,16.2,22.6,22.9,24.2,24.4,25.4,30.2,33.3,37.0,43.5,44.7,47.8,48.6,49.5,50.2,52.5,56.0,57.6,60.2,90.3,122.1,124.5,126.9,127.2,128.2,129.0,129.5,130.2,133.2,139.0,170.0,170.4,170.7,171.0,171.9,173.2,173.8.hrms(esi)m/zcalcdforc45h60n7o8+(m+h)+826.44979,found826.44950.(c2.1g/100ml,ch2cl2)；3-r-羟基-异吲哚酮并环(甘-d-脯-l-亮-d-脯-l-异亮-d-脯氨酰苄胺)(化合物b):whitesolid(yield45％).1hnmr(cdcl3,400mhz)δ:0.75～0.95(m,12h,ch3),1.10～1.28(m,4h,chch2ch(ch3)andch2ch)3),1.30～1.404(m,2h,ch(ch3)2andchch2ch3),1.45～1.62(m,4h,(nch2ch2ch2ch)2),1.63～1.90(m,4h,nch2ch2ch2chandnch2ch2ch2ch),1.95～2.25(m,4h,(nch2ch2ch2ch)2),3.28～3.82(m,6h,(nch2ch2ch2ch)3),3.85～3.91(m,1h,hnchco),3.92～4.20(m,2h,ch2ph),4.21～4.42(m,2h,(nch2ch2ch2ch)2),4.43～4.52(m,1h,nch2ch2ch2ch),4.53～4.62(m,1h,hnchco),4.68～4.77(m,2h,nch2co),4.80～4.90(m,2h,nch2co(oh)),6.94～7.74(m,9h,arh)；13cnmr(cdcl3,400mhz)δ:0.02,11.8,12.2,15.8,16.8,23.5,24.1,24.6,24.8,25.0,25.9,26.3,26.4,33.3,34.3,34.7,48.2,48.7,48.9,49.5,50.3,50.9,53.3,56.2,56.8,58.3,61.1,62.1,90.7,123.4,125.1,127.8,128.1,128.6,129.1,129.9,130.4,131.3,134.2,171.5,171.8,172.6,172.8,174.1,174.6,177.7.hrms(esi)m/zcalcdforc45h60n7o8+(m+h)+826.44979,found826.44952.(c2.4g/100ml,ch2cl2).实施例二：①将boc-d-脯氨酸(2.15g，0.01mol)溶于30ml二氯甲烷中，加入等当量的eedq(3.78g，15mmol)和n-(三甲基硅基甲基)苄胺(1.93g，10mmol)，室温搅拌过夜。减压除去二氯甲烷，加入15ml水，用60ml乙酸乙酯萃取三次,合并有机层并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到浅黄色油状物；将上步产物溶于10ml二氯甲烷中,加入10ml三氟乙酸,室温搅拌2h脱去boc保护。产物经柱层析纯化(洗脱液∶v乙酸乙酯:v正己烷＝1:2)得2.76g浅黄色油状物n-(三甲基硅基甲基)苄基-d-脯氨酰胺。②将boc-l-异亮氨酸(1.62g，7mmol)溶解在20ml二氯甲烷中，加入10.5mmoleedq，和上步产物n-(三甲基硅基甲基)苄基-d-脯氨酰胺，室温搅拌10h，减压除去溶剂，加入10ml水，用乙酸乙酯萃取，合并浓缩有机层得到浅黄色油状物，再采用三氟乙酸室温搅拌2h，脱去boc保护，以柱层析方法纯化产物，得到2.32g白色固体ile-d-pro-si(ch3)3。③将boc-l-脯氨酸(5.5mmol)溶解在16ml二氯甲烷中，加入等当量eedq和上步产物，室温搅拌12h，减压除去溶剂，加入10ml水，用乙酸乙酯萃取，浓缩有机层得到浅黄色油状物，再采用三氟乙酸脱去boc保护，以柱层析方法纯化产物，得到白色固体l-pro-ile-d-pro-si(ch3)3，产率85.0％。④将boc-l-亮氨酸(4.67mmol)溶解在二氯甲烷中，加入等当量eedq和上步产物，室温搅拌12h，减压除去溶剂，加入15ml水，用乙酸乙酯萃取，浓缩有机层得到油状物，再采用三氟乙酸脱去boc保护，以柱层析方法纯化产物，得到白色固体l-leu-d-pro-ile-d-pro-si(ch3)3，产率71.0％。⑤将boc-d-脯氨酸(3.26mmol)溶解在二氯甲烷中，加入等当量eedq和上步产物，室温搅拌10h，减压除去溶剂，加入10ml水，用乙酸乙酯萃取，浓缩有机层，粗品再采用三氟乙酸脱去boc保护，以柱层析方法纯化产物，得到n-末端三甲基硅甲基苄基取代的五肽d-pro-l-leu-l-pro-l-ile-d-pro-si(ch3)3(白色固体)，产率76％。⑥将线性肽n-末端三甲基硅甲基苄基取代的五肽(0.75g，9.3mmol)和三乙胺(3ml)溶于20ml干燥二氯甲烷中，冷却到0℃，在搅拌下将邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液(0.23g，9.3mmol，先溶于3ml二氧六环)滴入到反应液中。然后搅拌1h，反应液用20ml水洗两次，用无水硫酸钠干燥有机层，减压浓缩，粗产品用柱层析分离纯化(洗脱液∶v乙酸乙酯:v正己烷＝1:1)，得到白色固体5，即为n-三甲基硅甲基-n-苄基-邻苯二甲酰甘氨酰-d-脯-l-亮-l-脯-l-异亮-d-脯氨酰胺，产率86％。⑦取所得的n-三甲基硅甲基-n-苄基-邻苯二甲酰甘氨酰-d-脯-l-亮-l-脯-l-异亮-d-脯氨酰胺0.5g溶解在甲醇中，通氮气20min，在氮气保护下用pyrex管过滤中压汞灯照射20min，撤光源并结束反应。反应液浓缩，用硅胶柱层析分离提纯化得一对目标环肽化产物3-s-羟基-异吲哚酮并环(甘-d-脯-l-亮-l-脯-l-异亮-d-脯氨酰苄胺)(化合物c)和3-r-羟基-异吲哚酮并环(甘-d-脯-l-亮-l-脯-l-异亮-d-脯氨酰苄胺)(化合物d)。3-s-羟基-异吲哚酮并环(甘-d-脯-l-亮-l-脯-l-异亮-d-脯氨酰苄胺)(化合物c):whitesolid(yield42％).1hnmr(cdcl3,400mhz)δ:0.59～0.90(m,12h,ch3),0.92～1.01(m,1h,ch(ch3)2),1.10～1.30(m,7h,chch3and(nch2ch2ch2ch)3),1.32～1.46(m,2h,chch2ch),1.48～1.58(m,2h,ch2ch)3),1.60～1.87(m,4h,(nch2ch2ch2ch)2),1.89～2.00(m,2h,nch2ch2ch2ch),3.38～3.58(m,2h,ch2ph),3.60～3.71(m,2h,nch2co),3.73～3.87(m,2h,nch2ch2ch2ch),3.89～4.20(m,4h,(nch2ch2ch2ch)2),4.25～4.36(m,2h,nch2co(oh)),4.37～4.50(m,2h,hnchcoandhnchco),4.51～4.89(m,3h,(nch2ch2ch2ch)3),6.86～7.64(m,9h,arh)；13cnmr(cdcl3,400mhz)δ:12.3,15.4,16.8,23.0,23.9,24.6,25.2,25.6,25.8,26.4,30.9,38.4,40.0,40.5,42.6,48.7,50.4,54.4,56.3,57.6,58.8,61.1,61.9,66.3,68.3,86.1,123.7,125.1,127.8,128.9,130.2,131.4,132.9,133.6,137.7,138.3,170.1,170.6,171.1,171.9,172.2,172.8,173.3.hrms(esi)m/zcalcdforc45h60n7o8+(m+h)+826.44979,found826.44940.(c2.5g/100ml,ch2cl2).3-r-羟基-异吲哚酮并环(甘-d-脯-l-亮-l-脯-l-异亮-d-脯氨酰苄胺)(化合物d):whitesolid(yield46％).1hnmr(cdcl3,400mhz)δ:0.65～0.95(m,12h,ch3),0.98～1.08(m,1h,ch(ch3)2),1.10～1.27(m,1h,chch3),1.35～1.75(m,4h,chch2chandch2ch)3),1.77～1.85(m,2h,nch2ch2ch2ch),1.87～1.95(m,4h,(nch2ch2ch2ch)2),1.97～2.17(m,2h,nch2ch2ch2ch),2.18～2.45(m,4h,(nch2ch2ch2ch)2),3.25～3.45(m,2h,ch2ph),3.46～3.85(m,6h,(nch2ch2ch2ch)3),4.32～4.70(m,6h,(nch2ch2ch2ch)3,hnchcoandnch2co),4.72～4.95(m,3h,nch2co(oh)andhnchco),7.16～7.72(m,9h,arh)；13cnmr(cdcl3,400mhz)δ:12.5,15.6,17.0,19.8,20.6,23.2,24.1,25.9,26.6,28.0,29.4,33.4,38.6,40.2,42.8,48.9,50.6,54.6,56.5,57.8,58.9,62.1,66.5,68.5,91.3,123.9,125.2,128.0,129.1,130.0,130.4,131.6,133.1,133.8,134.5,165.9,170.8,171.3,172.1,172.4,173.0,173.5.hrms(esi)m/zcalcdforc45h60n7o8+(m+h)+826.44979,found826.44951.(c2.6g/100ml,ch2cl2).实施例三：①将boc-l-脯氨酸(2.15g,10.2mol)溶于30ml二氯甲烷中，加入等当量的eedq(3.85g，15.3mmol)和n-(三甲基硅基甲基)苄胺(1.97g，10mmol)，室温搅拌过夜。减压除去二氯甲烷，加入15ml水，用60ml乙酸乙酯萃取三次,合并有机层并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到浅黄色油状物；将上步产物溶于10ml二氯甲烷中,加入10ml三氟乙酸,室温搅拌2h脱去boc保护。产物经柱层析纯化(洗脱液∶v乙酸乙酯:v正己烷＝1:2)得2.8g浅黄色油状物n-(三甲基硅基甲基)苄基-l-脯氨酰胺。②将boc-l-异亮氨酸(1.85g，8mmol)溶解在20ml二氯甲烷中，加入10.5mmoleedq，和上步产物n-(三甲基硅基甲基)苄基-l-脯氨酰胺，室温搅拌10h，减压除去溶剂，加入10ml水，用乙酸乙酯萃取，合并浓缩有机层得到浅黄色油状物，再采用三氟乙酸室温搅拌2h，脱去boc保护，以柱层析方法纯化产物，得到2.75g白色固体l-ile-l-pro-si(ch3)3。③将boc-l-脯氨酸(6mmol)溶解在16ml二氯甲烷中，加入等当量eedq和上步产物，室温搅拌12h，减压除去溶剂，加入10ml水，用乙酸乙酯萃取，浓缩有机层得到浅黄色油状物，再采用三氟乙酸脱去boc保护，以柱层析方法纯化产物，得到白色固体l-pro-ile-l-pro-si(ch3)3，产率85.0％。④将boc-l-亮氨酸(5.1mmol)溶解在二氯甲烷中，加入等当量eedq和上步产物，室温搅拌12h，减压除去溶剂，加入15ml水，用乙酸乙酯萃取，浓缩有机层得到油状物，再采用三氟乙酸脱去boc保护，以柱层析方法纯化产物，得到白色固体l-leu-l-pro-ile-l-pro-si(ch3)3，产率71.0％。⑤将boc-d-脯氨酸(3.5mmol)溶解在二氯甲烷中，加入等当量eedq和上步产物，室温搅拌10h，减压除去溶剂，加入10ml水，用乙酸乙酯萃取，浓缩有机层,粗品再采用三氟乙酸脱去boc保护，以柱层析方法纯化产物，得到n-末端三甲基硅甲基苄基取代的五肽d-pro-l-leu-l-pro-l-ile-l-pro-si(ch3)3(白色固体)，产率76％。⑥将线性肽n-末端三甲基硅甲基苄基取代的五肽(0.6g，8mmol)和三乙胺(2.5ml)溶于20ml干燥二氯甲烷中，冷却到0℃，在搅拌下将邻苯二甲酰甘氨酰氯溶液(0.2g，8mmol，先溶于2ml二氧六环)滴入到反应液中。然后搅拌1h，反应液用20ml水洗两次，用无水硫酸钠干燥有机层，减压浓缩，粗产品用柱层析分离纯化(洗脱液∶v乙酸乙酯:v正己烷＝1:1)，得到白色固体5，即为n-三甲基硅甲基-n-苄基-邻苯二甲酰甘氨酰-d-脯-l-亮-l-脯-l-异亮-l-脯氨酰胺，产率86％。⑦取所得的n-三甲基硅甲基-n-苄基-邻苯二甲酰甘氨酰-d-脯-l-亮-l-脯-l-异亮-l-脯氨酰胺0.5g溶解在甲醇中，通氮气20min，在氮气保护下用pyrex管过滤中压汞灯照射20min，撤光源并结束反应。反应液浓缩，用硅胶柱层析分离提纯化得一对目标环肽化产物3-s-羟基-异吲哚酮并环(甘-d-脯-l-亮-l-脯-l-异亮-l-脯氨酰苄胺)(化合物e)和3-r-羟基-异吲哚酮并环(甘-d-脯-l-亮-l-脯-l-异亮-l-脯氨酰苄胺)(化合物f)。3-s-羟基-异吲哚酮并环(甘-d-脯-l-亮-l-脯-l-异亮-l-脯氨酰苄胺)(化合物e):whitesolid(yield41％).1hnmr(cdcl3,400mhz)δ:0.55～1.11(m,12h,ch3),1.18～1.30(s,4h,ch2ch3andchch2ch),1.32～1.41(s,1h,ch(ch3)2),1.50～1.69(m,1h,chch3),1.72～1.80(m,4h,(nch2ch2ch2ch)2),1.82～2.07(s,4h,nch2ch2ch2chandnch2ch2ch2ch),2.09～2.35(m,4h,(nch2ch2ch2ch)2),3.05～3.35(m,2h,nch2co),3.39～3.58(m,2h,nch2ch2ch2ch),3.59～3.80(m,2h,nch2ch2ch2ch),3.82～4.05(m,2h,nch2ch2ch2ch),4.18～4.32(m,2h,ch2ph),4.38～4.50(m,2h,nch2co(oh)),4.57～4.90(m,5h,hnchco,hnchcoand(nch2ch2ch2ch)3),7.23～7.76(m,9h,arh)；13cnmr(cdcl3,400mhz)δ:12.2,12.5,15.3,16.7,19.6,22.6,23.0,24.5,25.3,26.0,30.9,33.1,38.7,38.8,40.4,42.6,43.4,48.4,54.4,56.2,57.7,61.1,61.5,64.6,66.7,85.2,122.7,123.2,124.2,126.9,127.0,127.9,128.0,129.2,130.5,132.6,132.8,137.0,170.2,170.5,170.8,170.9,171.1,172.1,172.7.hrms(esi)m/zcalcdforc45h60n7o8+(m+h)+826.44979,found826.44934.(c2.0g/100ml,ch2cl2).3-r-羟基-异吲哚酮并环(甘-d-脯-l-亮-l-脯-l-异亮-l-脯氨酰苄胺)(化合物f):whitesolid(yield45％).1hnmr(cdcl3,400mhz)δ:0.53～0.90(m,12h,ch3),0.95～1.15(m,2h,ch(ch3)2andchch3),1.18～1.32(m,2h,ch2ch)3),1.38～1.47(m,2h,chch2ch),1.62～1.82(m,4h,(nch2ch2ch2ch)2),1.85～2.29(m,6h,nch2ch2ch2chand(nch2ch2ch2ch)2),2.30～2.50(m,2h,nch2ch2ch2ch),3.05～3.39(m,2h,ch2ph),3.41～3.79(m,4h,(nch2ch2ch2ch)2),3.82～3.96(m,2h,nch2ch2ch2ch),4.00～4.32(m,3h,(nch2ch2ch2ch)3),4.38～4.50(m,2h,nch2co),4.52～4.85(m,2h,nch2co(oh)),4.88～5.11(m,2h,hnchcoandhnchco),7.13～7.70(m,9h,arh)；13cnmr(cdcl3,400mhz)δ:12.2,12.5,15.3,16.7,19.6,22.6,23.0,24.4,25.2,27.1,28.0,29.5,33.1,38.8,40.4,42.6,48.4,54.4,56.2,57.7,59.5,61.1,61.4,61.5,64.6,66.7,87.4,125.0,127.7,128.8,130.0,131.3,131.4,133.4,133.6,137.8,166.1,166.2,171.0,171.3,171.6,171.7,172.0.hrms(esi)m/zcalcdforc45h60n7o8+(m+h)+826.44979,found826.44983.(c2.6g/100ml,ch2cl2).本发明制备的手性异吲哚酮并环六肽衍生物具有较好的抗肿瘤活性，其制备方法简单，易操作，有潜力开发新型抗肿瘤药物。实施例四：化合物抗肿瘤活性实验：选择人肝癌hepg2细胞和hela细胞，以四唑盐比色法(mtt法)，计算本发明所得药物与对照药物紫醇作用hela细胞48小时后的细胞存活率，以此计算化合物的半数抑制浓度(ic50)。表1为采用基于本发明制备的六个化合物进行抗肿瘤活性实验时，对照药物浓度、本发明所要求药物浓度与肝癌细胞hepg2细胞、宫颈癌hela细胞、鼠成纤维细胞l929生存率的柱状对比图。肝癌细胞hepg2细胞和宫颈癌hela细胞用来评价药物对肿瘤的抑制活性，鼠成纤维细胞l929则用以评价药物对正常细胞的毒性。生存率的柱状对比图细胞存活率(％)用下面的公式计算：存活率(％)＝a490(样品)/a490(对照)×100％；在a490(样品)代表不同浓度样品处理细胞的吸光度值，a490(对照)代表用dmem+10％胎牛血清细胞的吸光度值。通过药理活性数据的对比表明，本发明所述的手性异吲哚酮并环六肽衍生物多数对肝癌细胞hepg2细胞和hela细胞有很好的抑制作用，显示优于对照药物紫杉醇。特别是不同手性化合物活性数据有明显差异，如化合物c、化合物e的抑制能力明显优于其相应的异构体，更优于对照品紫杉醇，具有很好的应用潜能。另外，对照品紫杉醇对正常的l929细胞显示较强毒性，其ic50为34.96μg/ml，对两种肿瘤细胞的活性比对正常细胞的活性显示较差的活性，其ic50为102.05μg/ml和409.95μg/ml，而本发明所述的化合物则显示对肿瘤细胞较强的活性，而对正常细胞l929则显示较弱的毒性，因而本发明所述环肽具有很好的应用开发价值。表1.不同化合物对hela、hepg-2cells和l929细胞的ic50值(μg/ml)cellsabcdef紫杉醇hepg-285.2950.2011.10113.917.7948.48102.05hela45.05169.5023.3682.7026.3245.55409.95l92968.86184.9369.8677.44128.7199.2634.96当前第1页12