一种联合接种AM和DSE真菌的促进植物生长的方法及其使用的微生物菌剂与流程

本发明属于微生物领域，具体涉及一种联合接种am和dse真菌的促进植物生长的方法及其使用的微生物菌剂。
背景技术：
：丛枝菌根(arbuscularmycorrhiza，am)真菌是广泛分布于自然生态系统中的一类土壤真菌，能与大多数高等植物形成互惠共生体。研究表明，am真菌能够扩大植物根系的吸收范围，增强寄主根系对土壤水分和矿质营养的吸收和利用，促进植物生长。同时，am真菌侵染植物后，在植物根系形成的庞大菌丝网络系统、am真菌分泌的黏性物质,对于稳定土壤结构、固定沙丘，特别是对退化生态系统的植被恢复和生态重建具有重要意义。深色有隔内生真菌(darkseptateendophytes，dse)泛指一类定殖在植物根细胞间隙或植物根细胞内的小型土壤真菌，一般在健康植物根的表皮、皮层的细胞内和细胞间隙形成典型的有隔菌丝和微菌核，但不会在根组织内形成病原菌所引起的病理学特征，具有广泛的生态分布。越来越多的研究表明,dse在植物适应干旱、寒冷、重金属污染等胁迫环境中起着重要作用,并能与宿主植物形成互惠共生的关系，在植被恢复和生物防治领域可能具有与丛枝菌根真菌类似的生态学功能。随着对dse根内形态特征、分类鉴定、地理资源分布及生态功能等研究的逐渐深入，dse的应用与推广成为研究的热点与难点。技术实现要素：本发明的目的是促进植物生长。本发明首先保护微生物菌剂，其可包括链格孢(alternariasp.)真菌和地表球囊霉；所述微生物菌剂的功能为促进植物生长。所述微生物菌剂的活性成分可为链格孢(alternariasp.)真菌和地表球囊霉。所述微生物菌剂具体可由链格孢(alternariasp.)真菌和地表球囊霉组成。上述任一所述微生物菌剂中，链格孢(alternariasp.)真菌和地表球囊霉的比例可为(30-140)mg链格孢(alternariasp.)真菌的干物质：1300个孢子(如(30-62)mg链格孢(alternariasp.)真菌的干物质：1300个孢子、(62-140)mg链格孢(alternariasp.)真菌的干物质：1300个孢子、30mg链格孢(alternariasp.)真菌的干物质：1300个孢子、31.1mg链格孢(alternariasp.)真菌的干物质：1300个孢子、62mg链格孢(alternariasp.)真菌的干物质：1300个孢子、62.2mg链格孢(alternariasp.)真菌的干物质：1300个孢子、124.4mg链格孢(alternariasp.)真菌的干物质：1300个孢子或140mg链格孢(alternariasp.)真菌的干物质：1300个孢子)。上述任一所述微生物菌剂中，链格孢(alternariasp.)真菌可为链格孢(alternariasp.)001，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmccno.17463。上述任一所述微生物菌剂中，地表球囊霉可为地表球囊霉(glomusversiforme，g.v)。地表球囊霉(glomusversiforme，g.v)具体可由北京市农林科学院植物营养与资源研究所提供，菌株编号为bgcnm04b。上述任一所述微生物菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。上述任一所述微生物菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体和/或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料和/或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石、草炭土和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述高分子化合物为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂为癸烷和/或十二烷。所述粘土具体可为凹凸棒粘土。所述凹凸棒粘土是一种以凹凸棒石为主要成分的粘土矿物，主要化学成分是水合镁铝硅酸盐，含有k、na、ca、fe、al、mg、mn、ti等元素，具有独特的分散能力和吸附能力。本发明还保护上述任一所述的微生物菌剂在促进植物生长中的应用。本发明还保护上述任一所述的微生物菌剂在制备促进植物生长的产品中的应用。上述应用中，所述产品可为微生物肥料。本发明还保护一种产品，其可含有上述任一所述的微生物菌剂。所述产品的功能可为促进植物生长。所述产品可为微生物肥料。本发明还保护一种促进植物生长的方法，可为向植物根系施加上述任一所述的微生物菌剂，从而促进植物生长。上述方法中，所述“向植物根系施加上述任一所述的微生物菌剂”可在种植植物的同时向土壤中施加上述任一所述的微生物菌剂，也可在植物生长至一定阶段时再向土壤中施加上述任一所述的微生物菌剂。上述任一所述方法中，当植物为玉米品种中糯一号时，每株玉米施加的微生物菌剂包括1300个地表球囊霉孢子和干物质质量为30-140mg(如31.1mg、62.2mg或124.4mg)的链格孢(alternariasp.)001cgmccno.17463。上述任一所述促进植物生长可表现为(a1)和/或(a2)：(a1)株高、地径、叶面积、生物量、蒸腾速率、spad、气孔导度、净光合速率和植物激素含量中的至少一种增加；(a2)胞间co2浓度的降低。上述任一所述生物量可为根鲜重、茎鲜重、叶鲜重、根干重、茎干重和叶干重中的至少一种。上述任一所述植物激素可为iaa、ctk和ga中的至少一种。上述任一所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)玉米；c5)玉米品种中糯一号。上述任一所述微生物肥料可为复合微生物肥料或生物有机肥。所述复合微生物肥可为微生物菌剂、营养物质和有机质复合而成的肥料。所述复合微生物肥既有微生物的作用，又有化肥的作用。所述生物有机肥可为微生物菌剂和腐熟的有机肥复合而成的一类肥料。复合微生物肥料或生物有机肥的剂型可为颗粒剂。在种植中糯一号的同时向土壤中施加上述任一所述微生物菌剂，每株玉米施加的微生物菌剂包括1300个地表球囊霉孢子和干物质质量为31.1mg、62.2mg或124.4mg的链格孢(alternariasp.)001cgmccno.17463。结果表明，与未施加微生物菌剂的中糯一号相比，施加微生物菌剂的中糯一号的株高、地径、叶面积、根鲜重、茎鲜重、叶鲜重、根干重、茎干重、叶干重、蒸腾速率、spad、气孔导度、净光合速率、iaa含量、ctk含量和ga含量均有一定程度的增加，胞间co2浓度有一定程度的降低；且链格孢(alternariasp.)001cgmccno.17463的施加量越多，中糯一号生长的效果越好。由此可见，上述任一所述微生物菌剂具有促进植物生长的作用。本发明具有重要的应用价值。附图说明图1为dse菌落的生长状态。图2为出苗60d后，部分玉米植株的生长状态。图3为出苗60d后，部分玉米植株根的形态。保藏说明菌种名称：链格孢拉丁名：alternariasp.菌株编号：001保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：cgmcc地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2019年04月08日保藏中心登记入册编号：cgmccno.17463具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。玉米品种中糯一号(以下简称中糯一号)的种子为北京中农作科技发展有限公司的产品，认证号为0103006-2000。pda固体培养基：取去皮马铃薯200g，切成小块，加入1.0l蒸馏水，煮沸30min；纱布过滤后收集滤液，向滤液中加入葡萄糖20.0g、kh2po43.0g、mgso4.7h2o1.5g、维生素b110μg和琼脂15.0g，调节ph值至6.0并用蒸馏水定容至1.0l，然后115℃灭菌15min。pda抗性平板：向冷却至55℃的pda固体培养基中加入氨苄青霉素和硫酸链霉素，得到pda抗性培养基；pda抗性培养基中，氨苄青霉素和硫酸链霉素的浓度均为50mg/l；将pda抗性培养基倒入无菌培养皿(直径为9cm)，自然冷却，得到pda抗性平板。mmn液体培养基：向适量蒸馏水中加入cacl20.05g、mgso40.15g、nacl0.025g、fecl30.01g、kh2po40.5g、vitamibb10.0001g、(nh4)2hpo40.25g、glucose10g、citricacid0.2g和maltextract10g，调节ph值至5.5并用蒸馏水定容至1.0l，然后121℃灭菌30min。地表球囊霉(glomusversiforme，g.v)为北京市农林科学院植物营养与资源研究所提供，菌株编号为bgcnm04b。在下文中，地表球囊霉(glomusversiforme，g.v)简称地表球囊霉。实施例1、链格孢(alternariasp.)001cgmccno.17463的分离、鉴定和保藏一、分离1、用无菌水充分清洗根部样品(采自内蒙古自治区锡林郭勒盟锡林浩特市北电胜利矿区的针茅根系)，然后用75％(v/v)乙醇水溶液浸泡消毒5min，无菌水冲洗2次。2、完成步骤1后，将所述根部样品置于10％(v/v)次氯酸钠水溶液浸泡消毒5min，无菌水冲洗3次。3、完成步骤2后，用滤纸吸去所述根部样品表面的水分，然后剪成长为1cm左右的根段。4、完成步骤3后，将所述根段置于pda抗性平板(每个平板上放置2-3个根段)，28℃黑暗培养14d。将在pda抗性平板上可以生长的菌落进行分离培养并纯化。将筛选到的真菌命名为深色有隔内生真菌001。二、鉴定1、形态学鉴定将深色有隔内生真菌001接种至pda抗性平板，28℃黑暗倒置培养14d，观察菌落特征；然后进行插片培养，观察菌丝体及产孢情况。菌落的生长状态见图1。结果表明，菌落正面颜色为黑灰色，背面无裂痕，中央平整，边缘圆整，同心圆。菌丝体及产孢情况如下：菌丝深灰色，局部膨大，隔间距5-25μm，厚垣孢子，聚合球形。2、分子鉴定(1)采用真菌基因组dna提取试剂盒(axygen公司的产品)提取深色有隔内生真菌001的基因组dna并以其作为模板，采用its1：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′和its4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。反应体系为50μl，由5μl10×extaqbuffer(北京索莱宝科技有限公司的产品)、2μlits1水溶液(浓度为10μmol/l)、2μlits4(浓度为10μmol/l)、2μl模板、4μldntpmix(浓度为2.5mm)和35μlddh2o组成。反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，28个循环。(2)将步骤(1)得到的pcr扩增产物进行测序。测序结果表明，步骤(1)得到的pcr扩增产物中含有序列表中序列1所示的dna分子。将序列表中序列1所示的核苷酸序列提交到genbank数据库进行blast分析，确定其分类地位。然后用mega6构建系统发育树，用于亲缘关系和系统发育分析。结果表明，深色有隔内生真菌001与链格孢(alternariasp.)的同源性最高。因此，深色有隔内生真菌001被鉴定为链格孢(alternariasp.)。三、保藏步骤一分离的深色有隔内生真菌001已于2019年04月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.17463。深色有隔内生真菌001的全称为链格孢(alternariasp.)001cgmccno.17463，简称为dse菌株。实施例2、微生物菌剂的制备一、dse培养菌液的制备1、将dse菌株接种至pda固体培养基，28℃黑暗倒置培养14d，得到dse菌落。2、完成步骤1后，无菌条件下在dse菌落上取一个菌饼，然后置于mmn液体培养基，28℃、170r/min震荡培养15d，得到dse培养菌液。1mldse培养菌液中dse菌株干物质质量为3.11mg。二、地表球囊霉菌剂的制备取地表球囊霉，接种至灭菌沙土基质的玉米植株根部进行扩繁，得到地表球囊霉菌剂。地表球囊霉菌剂包含孢子、根外菌丝和被侵染根段，孢子密度为26个/g，侵染率为87％，菌丝长度为3.12m/g。三、微生物菌剂的制备制备微生物菌剂甲、微生物菌剂乙和微生物菌剂丙。微生物菌剂甲由10mldse培养菌液、40mlmmn液体培养基和50g地表球囊霉菌剂组成。微生物菌剂甲中，dse菌株的干物质质量31.1mg，地表球囊霉的孢子数为1300个。微生物菌剂乙由20mldse培养菌液、30mlmmn液体培养基和50g地表球囊霉培养菌液组成。微生物菌剂乙中，dse菌株的干物质质量62.2mg，地表球囊霉的孢子数为1300个。微生物菌剂丙由40mldse培养菌液、10mlmmn液体培养基和50g地表球囊霉培养菌液组成。微生物菌剂丙中，dse菌株的干物质质量124.4mg，地表球囊霉的孢子数为1300个。实施例3、实施例2制备的微生物菌剂对玉米生长的影响一、玉米芽的制备取中糯一号的种子，先用75％(v/v)乙醇水溶液浸泡消毒5min，无菌水冲洗3次；然后用10％(m/v)次氯酸钠水溶液浸泡消毒10min，无菌水冲洗3次；最后置于铺有湿润的无菌滤纸的培养皿中，25℃黑暗培养3d，挑选长势一致的玉米芽备用。二、dse灭活菌液和地表球囊霉灭活菌剂的制备1、取实施例2步骤一中2制备的dse培养菌液，121℃灭菌30min，得到dse灭活菌液。2、取实施例2中步骤二制备的地表球囊霉菌剂，121℃灭菌30min，得到地表球囊霉灭活菌剂。三、实施例2制备的微生物菌剂对玉米生长的影响1、将粘土和沙土分别粉碎后，过筛(目数为2mm)，然后121℃灭菌2h，自然风干，依次得到风干粘土和风干沙土。2、完成步骤1后，将风干粘土和风干沙土按照质量比为1∶1充分混匀，得到混合土壤。3、完成步骤2后，取12个塑料盆(塑料盆的规格均为外口径23.5cm，内口径20cm，高度21.5cm，底直径15cm)，先用75％(v/v)乙醇水溶液擦拭，然后用无菌水清洗数遍，晾干后装入4kg混合土壤，同时浇水至土壤最大持水量的70％，48h后加入nh4no3、kh2po4和kno3晶体(作为底肥)，混匀，使土壤中n、p、k的质量分数分别为100mg/kg、25mg/kg和150mg/kg。4、完成步骤3后，将12个塑料盆随机分成对照组、试验组1、试验组2和试验组3四组，每组3个塑料盆，进行如下实验：对照组(即ck)：每个塑料盆播种3颗步骤一制备的玉米芽，同时每个塑料盆中加入50mldse灭活菌液和50g地表球囊霉灭活菌剂；试验组1(即am+20％dse)：每个塑料盆播种3颗步骤一制备的玉米芽，同时每个塑料盆中加入微生物菌剂甲；试验组2(即am+40％dse)：每个塑料盆播种3颗步骤一制备的玉米芽，同时每个塑料盆中加入微生物菌剂乙；试验组3(即am+80％dse)：每个塑料盆播种3颗步骤一制备的玉米芽，同时每个塑料盆中加入微生物菌剂丙。5、完成步骤4后，定量浇水并使土壤湿度约为土壤最大持水量的70％。出苗后每盆定苗为1株，将其余两株剪碎放入盆中。玉米出苗后，每隔10d记录其生长情况。待出苗60d后收获，收获前分别测定玉米植株的株高、地径、叶面积、叶绿素含量(采用叶绿素测定仪spad-502plus测定)、气孔导度、蒸腾速率、净光合速率、胞间co2浓度、(气孔导度、蒸腾速率、净光合速率和胞间co2浓度均采用光合仪li-cor6400xt测定)等指标，按组计算平均值；收获后将根、茎、叶分离，分别测定鲜重和干重(80℃烘干48h)，按组计算平均值。此外，培养过程中，取部分玉米新鲜叶片或新鲜根，采用双抗体夹心法测定植物激素(iaa、ctk或ga)的含量，按组计算平均值。测定植物激素的含量具体步骤如下：用纯化的植物激素捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体；在包被的微孔中加入植物激素，再与hrp标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物tmb显色，tmb在hrp酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物激素呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(od值)，通过标准曲线计算样品中植物激素含量。试验结果如下：(1)植物的生长状况表征其生命力强弱和环境适应能力，叶片是植物对环境变化最为敏感的器官之一，是植物进行光合作用的主要器官，叶面积是衡量叶片光合能力的指标，叶面积越大越有利于拦截更多的阳光制造有机物。出苗60d后，部分玉米植株的生长状态见图2(a为全部植株对比，b为不同处理单株对比)。各组玉米植株的株高、地径、叶面积的测定结果见表1。结果表明，随着dse培养菌液的增加，玉米的株高、地径和叶面积均有不同程度的增加。试验组3对促进玉米生长的效果最佳。表1株高(cm)地径(mm)叶面积(cm2)对照组35.47±4.83b0.54±0.02b192.72±33.32d试验组161.33±5.69a1.06±0.07a635.04±52.19c试验组262.4±1.92a1.08±0.02a789.88±8.98b试验组365.63±5.27a1.16±0.11a873.51±45.56a注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。(2)各组玉米的根鲜重、茎鲜重、叶鲜重、根干重、茎干重和叶干重的测定结果见表2。出苗60d后，部分玉米植株根的形态见图3。结果表明，随着dse培养菌液的增加，玉米的根鲜重、茎鲜重、叶鲜重、根干重、茎干重和叶干重均有不同程度的增加。试验组3对促进玉米生长的效果最佳。表2根鲜重(g)茎鲜重(g)叶鲜重(g)根干重(g)茎干重(g)叶干重(g)对照组1.70±0.82c1.89±1.18c6.99±2.38c0.74±0.29b0.24±0.15b1.08±0.24b试验组18.92±0.85b4.52±0.53b21.37±1.86b3.38±0.63b0.58±0.08a3.52±0.89b试验组29.95±0.96ab5.25±0.31b24.03±1.12ab3.65±0.50b0.65±0.09a3.16±0.46b试验组310.78±0.98a8.86±1.23a26.52±3.83a4.15±0.79a1.92±0.84a4.20±0.75a注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。(3)植物叶片中的叶绿素含量(spad)指示了植物本身的长势情况，光合作用是植物生长的重要环节，是植物进行营养交换的重要机制，可以说光合作用与植物生长乃至生物的进化都有密切的关系，因此通过测定一系列光合参数(如气孔导度、蒸腾速率、净光合速率、胞间co2浓度等)，有助于研究植物的生理特性，为植物高产高质提供基础支撑。各组玉米的spad、气孔导度、蒸腾速率、净光合速率和胞间co2浓度的测定结果见表3。结果表明，玉米的spad值在四组之间无显著差异；试验组1、试验组2和试验组3中玉米的气孔导度均显著高于对照组；对照组中玉米的胞间co2浓度均显著高于试验组1、试验组2和试验组3；试验组3中玉米的净光合速率和蒸腾速率均显著高于试验组1、试验组2和对照组；随着dse培养菌液的增加，玉米的气孔导度、净光合速率和蒸腾速率均有不同程度的增加，胞间co2浓度则有不同程度的降低。试验组3对玉米生长促进效果最佳。表3注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)(4)植物激素是植物体内产生的一些微量而能调节(促进、抑制)自身生理过程的有机化合物，植物激素对植物的生长发育有重要的调节控制作用。iaa的作用表现为两重性，即低浓度促进生长，高浓度抑制生长。ga能够促进细胞的伸长，解除种子、块茎的休眠并促进萌发的作用。ctk促进细胞分裂、诱导芽的分化、防止植物衰老。各组玉米新鲜叶片中的植物激素含量测定结果见表4。各组玉米新鲜根中的植物激素含量测定结果见表5。结果表明，试验组1、试验组2和试验组3中玉米新鲜叶片中和新鲜根中的iaa含量、ctk含量和ga含量均显著高于对照组。可见，dse促进了植物激素(iaa、ctk或ga)的产生，有增强植物生长发育的功能。表4iaa(μmol·g-1)ctk(ng·g-1)ga(pmol·g-1)对照组0.098±0.007c330.96±7.99c0.92±0.012d试验组10.126±0.005b482.85±9.8b1.01±0.028c试验组20.148±0.007a491.74±10.71b1.07±0.012b试验组30.154±0.006a520.17±1.73a1.19±0.002a注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。表5注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。<110>中国矿业大学（北京）北京合生元生态环境工程技术有限公司<120>一种联合接种am和dse真菌的促进植物生长的方法及其使用的微生物菌剂<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>608<212>dna<213>链格孢（alternariasp.）<400>1cccttccgtagggtgaacctgcggagggatcattacacaatatgaaagcgggctggatac60tctgtagtagtggattgctttacggcgtgcgctgctggagagcctagccttgctgaatta120ttcacccgtgtcttttgcgtacttcttgtttccttggtgggctcgcccgccacaaggaca180actcataaaccttttgtaatagcaatcagcgtcagtaacaacataataattacaactttc240aacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtagtg300tgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccctttggtatt360ccaaagggcatgcctgttcgagcgtcatttgtaccctcaagctttgcttggtgttgggcg420tcttgtctccagtccgctggagactcgccttaaagtcattggcagccggcctactggttt480cggagcgcagcacaagtcgcactcttttccagccaaggtcagcgtccaacaagccttttt540tcaacttttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcg600gaggaaaa608当前第1页12