细胞贴附装置以及该细胞贴附装置的制造方法与流程

本发明涉及一种细胞贴附的技术，特别是指一种利用物理特征变化交变磁场改变带有磁性粒子的温感高分子产生结构变化使得细胞可以贴附于基板上的细胞贴附装置与方法以及其制造方法。

背景技术：

在正常组织中，原生细胞(homotypiccell)与异生细胞(heterotypiccell)是必须要生长在相对应的位置上才能具有正常组织的功能性。因此细胞图形化排列技术(cellpartterningtechnology)在生医工程领域上是很重要研究课题。细胞图形化排列的概念是在1960年代被提出；基本上细胞图型化排列分成被动式与主动式两种。

被动式主要是依靠基板上排列细胞贴附配体(cell-adhesionligand)与细胞表面接受器(receptor)结合达到细胞排列，此方法的反应时间较久并且无法重复使用。而主动式主要凭借施加一外力像是声波、光钳、介电泳等，来引导细胞到定义的位置来进行图形化排列。这些主动式的细胞排列方法，虽然技术可逆、反应效率佳且操作时间较短，但在应用上还是有些限制，例如，微孔洞结构容易造成细胞在贴附过程中造成细胞内骨架上的改变，且无法筛选标的细胞作图形化排列。介电泳技术虽然可以用来操控群体细胞，但是必须要在低导电性的培养环境下来操作，并且需要高频率的电流来操控细胞避免对细胞膜造成伤害，除此之外，大量微电极制备也增加了使用上的限制；光钳虽可用来操控单一细胞，但是受限于仪器相对昂贵以及操作功率的限制以防止对细胞造成热伤害。

现有技术中，例如tang等人，在2012年发表了“temperature-responsivepolymermodifiedsurfaceforcellsheetengineering”,polymer,15aug,2012,4,1478-1498,一文中提出了一种温感型高分子进行细胞贴附的技术。在细胞贴附层(tissueculturepolystyrene,tcps)表面上形成一层可以利用温度的变化改变亲疏水性的温感高分子层，其由聚n-异丙基丙烯酰胺(poly(n-isopropylacrylamide),poly(nipaam))所构成。不过，虽然温感高分子层可以在高于低临界溶液温度(lowercriticalsolutiontemperature,lcst)时，形成疏水性的状态，使得细胞得以贴附于tcps上，反之，当温度低于lcst时，温感高分子层则转变成亲水性状态，进而使得tcps上的细胞去贴附。

虽然现有技术中，可以产生贴附细胞效果的细胞贴附装置，但是必须维持在高于lcst工作温度时才会有细胞贴附的现象，在常温状态下无法维持细胞贴附效果，此外也难以让这些细胞排成特定图案。虽然前述现有技术中也有细胞排列的技术，不过都有其不足之处，综合前述，因此需要一种细胞贴附装置与方法来解决现有技术的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于：提供一种细胞贴附装置以及该细胞贴附装置的制造方法，解决现有技术中存在的上述技术问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种细胞贴附装置，其特征是包括有：

一基板；

一细胞贴附层，形成于该基板的表面；以及，

一磁性温感层，形成于该细胞贴附层的表面，该磁性温感层具有复数个磁性温感高分子，每一磁性温感高分子具有一温感高分子以及复数个磁性粒子，当作用于该磁性温感层的一物理特征变化时，复数个细胞得以贴附于该细胞贴附层上或由该细胞吸附层去贴附。

所述的细胞贴附装置，其中：该细胞贴附层为聚乙烯亚胺(polyethylenimine)，该温感高分子为聚n-异丙基丙烯酰胺(poly(n-isopropylacrylamide))。

所述的细胞贴附装置，其中：该物体特征为温度、磁场或两者的组合。

所述的细胞贴附装置，其中：还具有一磁性结构，该磁性结构具有一图案结构，该磁性结构设置于该细胞贴附层与该基板之间或于设置于该基板外部的一侧。

所述的细胞贴附装置，其中：该图案结构为具有复数个同心排列的几何图案结构。

一种细胞贴附装置的制造方法，其特征是包括有下列步骤：

制造复数个磁性温感高分子，每一个磁性温感高分子具有一第一温感高分子，每一第一温感高分子具有复数个磁性粒子；

提供一基材，并在该基材上形成一细胞吸附层；以及，

利用该复数个磁性温感高分子于该细胞吸附层上形成一磁性温感层，当作用于该磁性温感层的一物理特征变化时，复数个细胞得以贴附于该细胞贴附层上或由该细胞吸附层去贴附。

所述的细胞贴附装置的制造方法，其中：形成该细胞吸附层之前，还包括有在该基板上形成一磁性薄膜层，其具有一图案结构，并在形成该磁性温感层时，该复数个具有磁性温感高分子相应于该图案结构上的特定位置排列。

所述的细胞贴附装置的制造方法，其中：还包括有在该基板的一侧具有一特定图案的永久磁铁，其具有一图案结构，并在形成该磁性温感层时，该复数个具有磁性粒子的温感高分子沿着该图案结构的轮廓排列。

所述的细胞贴附装置的制造方法，其中：该物体特征为温度与磁场的组合，该细胞贴附装置在一第一温度时该复数个磁性温感高分子为收缩状态，使得细胞吸附于该细胞吸附层上，在一第二温度时，凭借该磁场变化的作用，使得仅有在对应该图案结构上的温感高分子维持收缩状态，使得细胞可以在相应该图案结构的特定区域上被该细胞吸附层吸附。

所述的细胞贴附装置的制造方法，其中：还包括有形成复数个第二温感高分子，并在形成该磁性温感层时，将含有该磁性温感高分子以及该第二温感高分子混合溶液，涂布于该细胞吸附层上，使得对应该图案结构的区域上，具有该磁性温感高分子形成于该细胞吸附层上，以及在其他区域上，具有第二温感高分子形成于该细胞吸附层上。

与现有技术相比较，本发明具有的有益效果是：

本发明提供一种细胞贴附装置与方法，其利用让温感高分子具有磁性粒子以形成磁性温感高分子，该磁性温感高分子除了通过温度的变化贴附细胞，更进一步可以通过交变磁场的控制，使得在低于lcst温度的条件下，细胞仍然可以维持被贴附的状态，以避免现有技术中，通过外力贴附细胞而对细胞产生破坏的问题，以及产生不用在低于lcst的条件下，让细胞贴附或去贴附的效果。

本发明提供一种细胞贴附装置与方法，除了利用控制lcst温度变化的条件下，可以让细胞贴附或去贴附之外，更可以利用外加磁场控制细胞的排列图案，进而可以模拟各种不同的组织细胞，以增加其应用的领域。特别是，通过具有特定图案的磁性薄膜层的结构，使得带有磁性粒子的温感高分子可以被贴附在图案结构的特定位置上，进而可以通过交变磁场，控制贴附细胞贴附的位置与区域，形成特定的细胞图案。

本发明提供一种细胞贴附装置与方法，通过具有磁性的温感层或者是磁性温感层与磁性薄膜层的结构，可以让贴附细胞在不需要注入磁性粒子的条件下产生细胞贴附与去贴附的效果，进而可以维持细胞的完整性，扩大研究开发的应用范围。

附图说明

图1为本发明的细胞贴附装置第一实施例剖面示意图。

图2a与2b为温感高分子在高于lcst温度与低于lcst温度的亲疏水性变化示意图。

图2c与图2d为具有磁性粒子的温感高分子在低于lcst温度时，受到交变磁场作用而产生的亲疏水性变化示意图。

图3a～图3d为本发明的制作细胞贴附装置的一流程示意图。

图4a为本发明的细胞贴附装置第二实施例剖面示意图。

图4b为磁性薄膜的图案结构示意图。

图5a与图5b为本发明的细胞贴附装置贴附细胞与形成特定细胞图案示意图。

图6为本发明的磁性贴附装置另一实施例示意图。

图7a～图7f所示，该图为形成图4a与图4b的细胞贴附装置第二实施例结构流程示意图。

附图标记说明：2、2a-细胞贴附装置；20-基板；21-细胞贴附层；22-磁性温感层；23-磁性温感高分子；230-温感高分子；231-磁性粒子；25-磁性薄膜层；250-图案结构；26-温感层；27-永久磁铁；3、3a-细胞；90-交变磁场。

具体实施方式

在下文将参考随附图式，可更充分地描述各种例示性实施例，在随附图式中展示一些例示性实施例。然而，本发明概念可能以许多不同形式来体现，且不应解释为限于本文中所阐述的例示性实施例。确切而言，提供此等例示性实施例使得本发明将为详尽且完整，且将向熟习此项技术者充分传达本发明概念的范畴。类似数字始终指示类似元件。以下将以多种实施例配合图式来说明所述细胞贴附装置与方法以及该细胞贴附装置的制造方法，然而，下述实施例并非用以限制本发明。

请参阅图1所示，该图为本发明的细胞贴附装置第一实施例剖面示意图。在本实施例中，该细胞贴附装置2包括有一基板20、一细胞贴附层21以及一磁性温感层22。该基板20的材质并无一定限制，可以使用玻璃基板、硅基板或者是可挠性的基板，例如：塑胶基板等，但不以此为限制。该基板20的上方表面上形成有一细胞贴附层21，可以提供细胞附着于其上。在一实施例中，该细胞贴附层21可以为聚乙烯亚胺(polyethylenimine,pei)，但不以此为限制，本领域技术的人可以根据需求选择适当的细胞贴附层材料。

该细胞贴附层21的上表面则形成有该磁性温感层22，其可以通过作用于该细胞贴附装置2的外部物体特征的变化，例如：改变环境温度或者是提供一交变磁场(hac)，而改变其亲水性与疏水性。该磁性温感层22具有复数个磁性温感高分子23，每一磁性温感高分子23具有一磁性温感高分子230，以及复数个磁性粒子231贴附于其表面上或在其内部。在一实施例中，该磁性温感高分子23具有为聚n-异丙基丙烯酰胺(poly(n-isopropylacrylamide),poly(nipaam))，但不以此为限制。该磁性粒子231，在一实施例中为奈米磁性粒子。请参阅图2a与2b所示，在本实施例中，该磁性温感层22具有一低临界溶液温度(lowercriticalsolutiontemperature,lcst)，在一实施例中，其是32～34.4℃之间，本实施例为32℃，要说明的是该lcst温度系根据材料的性质而定，并不以本实施例为限制。

在图2a中，当环境温度高于lcst时，例如：37℃时，磁性温感层22内的各个磁性温感高分子23会变成疏水性的状态而收缩，使得原先被膨胀的磁性温感高分子23遮住的细胞贴附层21会显露出来，如图2a所示的区域a。此时，如果环境的内具有细胞3的话，在一实施例中，该环境为液体，该细胞3会贴附在细胞贴附层21上。反之，如图2b所示，当环境温度低于lcst时，例如：28℃，则磁性温感层22的磁性温感高分子23会从疏水性转变成亲水性，其结构膨胀而遮蔽了原先的区域a，使得细胞3去贴附而脱离了细胞贴附层21。

又如图2c与2d所示，其是通过交变磁场90改变磁性温感层亲疏水性示意图。在图2c中，当环境温度低于lcst温度时，例如在常温28℃时，虽然按理来说磁性温感高分子23会变成亲水性而膨胀，进而遮蔽了细胞贴附层21，但是通过交变磁场90对磁性温感高分子23的磁性粒子231产生作用，如图2d所示，使得具有磁性粒子231的磁性温感高分子23产生温度变化，也即交变磁场90的作用使磁性温感高分子23升温，而让具有磁性粒子231的磁性温感高分子23产生疏水性的状态，也即温感高分子结构收缩，进而让细胞3贴附于细胞贴附层21或者是维持细胞3持续贴附于细胞贴附层21上。凭借交变磁场90的控制，可以在常温的下，让原先应该是细胞3去贴附的情况，维持或变成细胞3的被贴附于细胞贴附层21状态，大大增加细胞贴附装置2的应用环境。例如，在一使用情境中，使用者就不用刻意的维持环境的温度，以维持细胞被贴附于细胞贴附层21上，即使在常温的下，通过交变磁场的作用，即可以达到维持细胞被贴附的效果，如此可以减少维持环境温度所需的成本，包含装置与能源，也能增加运送的便利性。

接下来说明制造图1结构的方式，请参阅图3a与图3d所示，该图为本发明的制作细胞贴附装置的一流程示意图。首先，进行步骤30将温感高分子材料转换成胺化的温感高分子材料，本步骤中，将温感高分子材料，例如：poly(nipaam)，与联氨n2h2溶解于甲醇，加热至90℃产生回流，反应结束后降至室温，透析完毕后冷冻干燥即可得胺化的poly(nipaam)。接者，进行步骤31产生磁性温感型水胶材料。本步骤中，系将碳酰二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide,edc)与n-羟基琥珀酰亚胺(n-hydroxysuccinimide,nhs)分别与5、10、20与40wt％的磁性奈米粒子cm-dextran/fe3o4溶于去离子水，应用edc/nhs活化cm-dextran的cooh官能基，再接续加入步骤31所得到的胺化的poly(nipaam)，使两者接枝，得到磁性温感型水胶材料，其形成的具有磁性粒子的磁性温感高分子23结构示意图，如图3a所示，该高分子23结构为近球状，且磁性奈米粒子231接枝于磁性温感高分子23表面。

如图3b所示，接着进行步骤32，提供一基板20，其特征如前所述，在此不做赘述。接下来，进行步骤33，形成细胞贴附层的步骤。如图3c所示，步骤33中使该基板浸泡于1.0wt％的pei(polyethylenimine)溶液，并进行干燥，例如：于室温下自然干燥，以形成薄膜厚度约为1μm的细胞贴附层。接着，进行步骤34于该细胞贴附层上形成磁性磁性温感高分子23而形成磁性温感层22。本步骤系将含有图3a结构的去离子水，滴于图3b的基板，通过负电性的poly(nipaam)与正电性的pei凭借正负电作用力紧密相吸，续进行旋转涂覆，使poly(nipaam)均匀涂覆于基板20，完成poly(nipaam)磁性温感层22，如图3d所示。

请参阅图4a所示，该图为本发明的细胞贴附装置第二实施例剖面示意图。在本实施例中，该细胞贴附装置2a基本上与图1相似，所差异的是，本实施例的细胞贴附装置2a于该细胞贴附层21与该基板20之间更具有一磁性薄膜层25，其具有一图案结构250，使得该复数个具有磁性粒子231的磁性温感高分子23沿着该图案结构250的轮廓排列。在一实施例中，如图4b所示，该图案结构250具有复数个同心的几何结构所构成，该几何结构在一实施例中为矩形结构。要说明的是，几何图案的结构系根据使用者的需求而定，并不以本实施例的同心几何图案为限制。此外，在一实施例中，于非对应几何图案区域251的细胞贴附层21上，则形成不带有磁性粒子231的磁性温感高分子23所构成的温感层26。

通过图4a所示的结构，可以控制细胞贴附装置2a贴附细胞后所形成的图案，使得细胞贴附装置2a可以模拟特定功能的细胞，例如：肝脏、心脏等，进而可以增加应用领域，有助于药物或者是治疗方式的开发。以图4a与图4b所示的结构为例，在高于lcst温度的条件下，例如：37℃，如同前述图2a所示的状态，由于磁性温感高分子23为疏水性，此时基板的磁性温感高分子23结构收缩，使得细胞3得以贴附于细胞贴附层21上，形成如图5a的状态。当环境温度低于基板的lcst，例如：27℃时，如图2b所示的状态，磁性温感高分子23结构膨胀诱使细胞3脱离细胞贴附层21。此时，再通过施加交变磁场(hac)，使得具有磁性粒子231的磁性温感高分子23因为磁性粒子231受到交变磁场(hac)的作用而温度上升，进而可以使具有磁性粒子231的磁性温感高分子23维持其疏水性的状态，使得贴附于其上的细胞3继续维持贴附状态。至于其他没有对应到磁性薄膜层25的图案结构的磁性温感高分子23，由于温度已经低于lcst的故，磁性温感高分子23结构改变而变成了亲水性，使得原先贴附于细胞贴附层21的细胞3a脱离细胞贴附层21。凭借上述先施以高于lcst温度的环境温度条件，使得细胞都贴附在细胞贴附层21上，的后通过控制环境温度条件低于lcst，再施加交变磁场，使得特定区域的细胞3维持在细胞贴附层21上，进而产生具有特定贴附细胞图案的细胞贴附装置2a。

接下来说明图案化的细胞排列原理，由于在本实施例中，图案结构为复数个同心的矩形结构，因此，沿着矩形结构的轮廓形成有具有复数个磁性粒子231的磁性温感高分子23。当温度低于lcst且施加交变磁场hac的时候，细胞受到同心矩形结构转折处所产生的散逸场吸引，使得细胞3会集中贴附于在图案结构250的转折处所相应的具有磁性粒子的温感高分子上，而形成如图5b所示的图形化细胞培养基板。另外，当细胞贴附装置置于室温且无交变磁场hac曝照时，便可完成全数细胞去贴附，达成另一种应用。

请参阅图6所示，该图为本发明的磁性贴附装置另一实施例示意图。在本实施例中，基本上与图4a相似，差异的是本实施例系利用具有特定形状或图案的永久磁铁27来取代图4a的磁性薄膜层25。同样的方式，于对应永久磁铁27的位置形成有具有磁性粒子231的磁性温感高分子23，而其余区域则形成有不具有磁性粒子的磁性温感高分子23。至于利用交变磁场控制细胞贴附的方式，则如前所述，在此不做赘述。

接下来说明本发明的贴附细胞的方法，首先以步骤40提供如图4a或图6所示细胞贴附装置2a或2b。接着进型步骤41，于一第一工作温度时，使复数个细胞被贴附于该细胞贴附装置2a。在一实施例中，该工作温度系高于温感高分子的lcst温度，本实施例为37℃，但不以此为限制。于该第一工作温度的下，该细胞贴附装置2a所贴附的细胞结果如图5a所示的状态，也即细胞3布满细胞贴附装置具有温感高分子的表面上。接着进型步骤42，提供一交变磁场hac作用于该细胞贴附装置2a上。接着，在步骤43中，从该第一工作温度降低至一第二工作温度，通过该交变磁场的作用，使得该复数个细胞中的至少一部分被贴附于该细胞贴附装置2a上，以形成如图5b所示的具有图形化的细胞贴附结构。在一实施例中，该第二工作温度为低于温感高分子的lcst温度，本实施例中28℃。

请参阅图7a～7f所示，该图为形成图4a与图4b的细胞贴附装置第二实施例结构流程示意图。在本实施例中，首先进行步骤50，制作温感型材料poly(nipaam)。在一实施例中，系将nipaam及链转移剂(methyl3-mercaptopropionate)加入含有40ml去离子水的反应瓶中，通入氮气，进行加热。加入起始剂过硫酸钾(potassiumperoxydisulfate,kps)使其反应聚合，得到温感型材料poly(nipaam)。接着进行步骤51，制作含有磁性粒子的温感高分子所构成的磁性温感型水胶材料。在一实施例中，系将步骤50温感高分子材料与联氨n2h2溶解于甲醇，加热至90℃产生回流，反应结束后降至室温，透析完毕后冷冻干燥即可得胺化的poly(nipaam)。接者，将碳酰二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide,edc)与n-羟基琥珀酰亚胺(n-hydroxysuccinimide,nhs)分别与5、10、20与40wt％的磁性奈米粒子cm-dextran/fe3o4溶于去离子水，应用edc/nhs活化cm-dextran的cooh官能基，接续加入胺化的poly(nipaam)，使两者接枝，得到磁性温感型水胶材料，该高分子23结构为近球状，且磁性奈米粒子231接枝于磁性温感高分子23表面。

接着进行步骤52，在基板20上涂覆az光阻200，形成如图7a的结构，然后如图7b所示，再覆盖光罩201以uv光蚀刻，接续以电子束蒸镀铁磁性薄膜202，形成如图7c的结构。如图7d所示，去除光阻200，完成图形化的磁性薄膜固定于玻璃基板，其图型为同心方结构，线宽与间距都为12μm，基板可应用外加磁场充磁，产生磁散逸场。接续进行步骤53，将固定磁性薄膜的玻璃基板，浸泡于1.0wt％的pei(polyethylenimine)溶液，并在室温下自然干燥，以形成细胞贴附层21，其厚度约为1μm，如图7e所示。接续进行步骤54，如图7f所示，再以温感型水胶溶液与磁性温感型水胶溶液的混合溶液滴附于基板20的细胞贴附层21上，进行旋转涂覆，水胶溶液干燥过程中，含有磁性粒子231的磁性温感高分子23会被吸引至磁性薄膜层21的图形结构，而不含有磁性粒子231的磁性温感高分子23则会附着在没有图案结构的细胞贴附层21上，等待干燥之后，即完成如图4a所示的细胞贴附装置的制备。

以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离权利要求所限定的精神和范围的情况下，可作出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围之内。