具有抗肥胖及抗糖尿病功效的肽及其的用途的制作方法

【技术领域】

本申请对2015年4月28日提出于韩国专利局的韩国专利申请第10-2015-0059648号主张优先权，上述申请的公开内容作为参照插入于本说明书。

本发明涉及具有抗肥胖及抗糖尿病功效的肽及其的用途。

背景技术：

目前，韩国因经济发展和饮食生活的西方化，从食物中摄取的脂肪量增加，且因运动不足等原因，而呈现如肥胖、糖尿病、高血脂症、高血压、动脉硬化症及脂肪肝等的代谢性疾病增加的趋势。并且，肥胖不仅对喜欢消瘦体型的美丽面貌年轻人产生消极影响，而且，因肥胖的持续，而会患上多种疾病。

目前，治疗肥胖的治疗剂可大体分为作用于中枢神经来对食欲产生影响的药剂和作用于胃肠管来阻碍吸收的药物。根据各个药物的机制，在市场销售的作用于中枢神经的药物为抑制5-羟色胺(5-ht)神经系统的氟苯丙胺、右芬氟拉明等药物、通过去甲肾上腺素神经系统的麻黄素及咖啡因等药物及最近的同时作用于5-羟色胺及去甲肾上腺素神经系统来抑制肥胖的西布曲明等药物。此外，作为作用于胃/肠管来抑制肥胖的药物的代表药物为作为通过抑制肠管脂肪酶来减少脂肪的吸收的肥胖治疗剂授权的奥利斯特等。但是，在以往使用的药物中，氟苯丙胺等药物因存在引起原发性肺动脉高压或心脏瓣膜病等副作用，由此最近禁止使用，其他药物也会引起降压或乳酸酸中毒等问题，从而存在无法对心力衰竭、肾脏疾病等患者使用的问题。

糖尿病为胰岛素的分泌量不足或无法进行正常功能等而导致的代谢性疾病的一种(defronzo，1988)，糖尿病的特征为使血液中的葡萄糖的浓度增加的高血糖，是因高血糖，会导致多种症状及征兆并从小便中排出葡萄糖的疾病。最近，因肥胖率，尤其，因腹部肥胖的增加，存在糖尿的发生率急剧增加的趋势。

在2000年，全世界糖尿病患者的数量为1亿7千万名，在2030年，糖尿病患者会增加至3亿7千万名，但是，根据最近的分析，报告中指出，在2008年，全世界糖尿病患者早已达到3亿5千万(danaeietal..2011)，从而糖尿病扩展比预期更严重。据报告相对于二型糖尿患者的约80％以上为肥胖，肥胖患者中小于10％的患者为糖尿病患者(harrisetal..1987)。上述糖尿病和肥胖的相关性因脂肪素(adipokine)和游离脂肪酸(freefattyacid)的不规则分泌，脂肪酸堆积在β-细胞或肾脏、肝脏、心脏等胰岛素敏感性组织内，由此呈现出脂肪毒性(lipotoxicity)。若未对慢性高血糖状态进行适当的治疗，则会伴随身体的多种病状，为了预防具有代表性的性视网膜病、肾功能衰竭、神经病、因血管障碍所引起的并发症，得必须进行有效地血糖管理。

目前，作为调整血糖的方法使用生活习惯固定(饮食疗法、运动疗法)及药物疗法等。但是，饮食疗法或运动疗法很难进行严格的管理及实施，且其效果也存在局限。因此，大部分糖尿患者校正生活习惯，并依赖于胰岛素、胰岛素分泌促进剂、胰岛素敏感性改善剂及降血糖剂等药物的血糖调整效果。

通过重组方法生产的胰岛素对一型糖尿病患者及无法调整血糖的二型患者必要的药物，上述药物有利于调整血糖，但是存在对针的反感、给药方法的难度、低血糖危险及体重增加等缺点。

作为胰岛素分泌促进剂的一种的氯茴苯酸类作为药效极快的制剂，在饭前服用，胰岛素分泌促进剂具有诺和龙(瑞格列奈)、fastic(那格列奈)、glufast(米格列奈)等。但当单独服用胰岛素敏感性改善剂时，特征在于几乎没有低血糖，胰岛素敏感性改善剂有作为双胍(biguanide)类药物的甲福明二甲双胍(metformin)和噻唑烷二酮(thiazolidinedione)类的avaneda(罗西格列酮)、actoc(匹格列酮)。

作为最近开发的药物有利用作为促进胰岛素分泌的及激素的胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1)的作用来开发的胰高血糖素样肽-1(glp-1)激动剂(agonist)，胰高血糖素样肽-1激动剂为降糖药(exenatide)和利拉鲁肽(liraglutide)。并且，抑制作为使胰高血糖素样肽-1惰性的酶的二肽基肽酶-4(dpp-4，dipeptidylpeptidase-4)的作用的二肽基肽酶-4抑制剂(inhibitor)也是在最近开发的新药，且代表产品为januvia(成分名：西他列汀(sitagliptin))。但是，上述药剂具有肝毒性、胃肠障碍、心血管类疾病及致癌性等副作用，且每年治疗费用也极高，从而很难通过上述二肽基肽酶-4抑制剂治疗糖尿病。实际上，以2007年为基准，糖尿病前期(pre-diabetes)及糖尿病相关费用仅在美国就接近约200亿万元(dalletal.,2010)，以2008年为基准，肥胖相关费用仅在美国也接近150亿万元(finkelsteinetal.,2009)。因此，需要开发可通过减少体重并有效降低血糖来同时治疗糖尿病及肥胖性糖尿病且副作用少的药剂。

首先，为了找出用于治疗肥胖的进一步改善的方法，在最近注重了调整能量代谢的方法，在这方序列的化合物得具有更高稳定性(低毒性)的前提下，当人摄取高脂肪饮食时，对堆积成脂肪的信号和对脂肪堆积产生影响的蛋白质进行了研究，抑制上述脂肪堆积的蛋白质的表达，通过用于分解已堆积的脂肪的信号研究及相关蛋白质的研究来进行了促进脂肪分解的研究并开发了肽。并且，本发明的肽对因糖尿病及肥胖而引起的糖尿病产生卓越的功效。因高脂肪饮食而引发的脂肪堆积、抑制因肝脏或肌肉等的脂肪堆积而呈现的胰岛素的信号、由此引发的胰岛素的耐性成为引发糖尿病的原因，本发明的各个肽及复合体对上述糖尿病及肥胖性糖尿病治疗产生效果。

本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术领域的水平及本发明的内容。

技术实现要素：

【要解决的问题】

本发明人努力开发具有生物学上有效的活性的多个优秀肽的结果，查明了具有序列表的序列1至序列表的序列7的氨基酸序列的肽抑制因高脂肪饮食而引起的脂肪堆积，分解已堆积的脂肪来呈现抗肥胖效果，而且，还对糖尿病、肥胖性糖尿病或糖尿病并发症具有优秀的效果，由此完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供由序列表的序列1至序列表的序列7所记载的氨基酸序列形成的肽。

本发明的再一目的在于，提供具有抗肥胖或抗糖尿病活性的肽。

本发明的另一目的在于，提供具有抗肥胖或抗糖尿病活性的肽复合体。

本发明的还一目的在于，提供肥胖的预防或治疗用药剂组合物。

本发明的又一目的在于，提供糖尿的预防或治疗用药剂组合物。

本发明的其他目的及优点通过以下发明的详细说明、以上发明要求保护范围及以下附图变得更加明确。

【解决问题的方案】

根据本发明的一实施方式，本发明提供由选自由序列表的序列1至序列表的序列7中所记载的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的肽。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供由选自由序列表的序列1至序列表的序列7的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的具有抗肥胖或抗糖尿病活性的肽。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供具有抗肥胖或抗糖尿病活性的肽复合体，上述具有抗肥胖或抗糖尿病活性的肽复合体包含：(a)由序列表的序列1形成的肽；(b)由序列表的序列2或序列表的序列3形成的肽：以及(c)由序列表的序列6或序列表的序列7形成的肽。

本发明人努力开发具有生物学有效活性的多个优秀肽，结果，查明了具有序列表的序列1至序列表的序列7的氨基酸序列的肽抑制因高脂肪饮食而引起的脂肪堆积，分解已堆积的脂肪来呈现抗肥胖效果，而且，还对糖尿病、肥胖性糖尿病或糖尿病并发症具有优秀的效果。

在本说明书中，术语“肽”是指通过肽键来由多个氨基酸残基互相结合而成的线性分子。本发明的肽可通过本领域中公知的化学合成方法，例如，固相合成技术(solid-phasesynthesistechniques:merrifield,j.amer.chem.soc.85:2149-54(1963)；stewart,etal.,solidphasepeptidesynthesis,2nd.ed.,piercechem.co.:rockford,111(1984))或液相合成技术(美国登录专利第5，516，891号)来制备而成。

本发明的肽选择氨基酸序列的一部分部位并为了增加其活性而可在n-末端或c-末端诱导变形。通过上述变形，本发明的肽可具有提高向人体内给药时的半衰期的更高的半衰期。

根据本发明的一实例，肽的n-末端或c-末端可变形为羟基(-oh)、氨基(-nh2)、叠氮化物(-nhnh2)等。根据本发明的优选实施例，上述肽的n-末端结合有保护基，上述保护基选自包含乙酰基、芴甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂酰基及聚乙二醇(peg，polyethyleneglycol)的组。

上述氨基酸的变形起到大大改善本发明的肽的稳定性的作用。在本发明中提及的术语“稳定性”不仅是指“体内”稳定性，还指储存稳定性(例如，常温储存稳定性)。上述保护基起到从生物体内的蛋白质切割酶的攻击保护本发明的肽的作用。

根据本发明的一实例，本发明的肽呈现出抑制因高脂肪饮食而引起的脂肪堆积，并分解已堆积的脂肪的效果，减少作为脂质生成标记因子的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(pparγ)、乙酰辅酶a羧化酶(acc)及脂肪特异性脂肪酸结合蛋白(ap2)的表达，并增加作为脂肪分解因子的磷酸激素敏感性脂肪酶(phsl)、腺苷酸活化蛋白激酶α1(ampk-α1)、比较基因鉴定-58(cgi-58)及脂肪甘油三酯脂酶(atgl)的表达，且减少脂肪细胞的大小及血液中胆固醇数值。并且，本发明的肽有效减少血糖。上述结果意味着本发明的肽对肥胖、糖尿病及肥胖性糖尿病治疗具有极为优秀的功效。

在本发明的肽中，不仅是以序列表的序列1至序列表的序列7的氨基酸序列表示的各个肽呈现出优秀的抗肥胖及抗糖尿病活性，而且这些的复合体也呈现出优秀的抗肥胖及抗糖尿病活性。

根据本发明，由序列表的序列3、序列表的序列5及序列表的序列7形成的肽分别为由以序列表的序列2、序列表的序列4及序列表的序列6形成的肽的cys被置换成ser的肽，上述两个肽的抗肥胖及抗糖尿病活性几乎相同。

根据本发明的一实例，本发明的具有抗肥胖或抗糖尿病活性的肽复合体由肽的组合形成，上述肽组合包含由序列表的序列1形成的肽、由序列表的序列2或序列表的序列3形成的肽及由序列表的序列6或序列表的序列7形成的肽。

根据本发明的另一实例，本发明的肽复合体由序列表的序列1、序列表的序列3及序列表的序列7的组合形成。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含肽或肽复合体作为有效成分的肥胖的预防或治疗用药剂组合物。

本发明的肽或肽复合体抑制脂肪生成，分解脂质的功能卓越，因此可用于肥胖的预防或治疗。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含肽或肽复合体作为有效成分的糖尿的预防或治疗用药剂组合物。

本发明的肽或肽复合体呈现出在糖尿病动物模型中有效减少增加的血糖的功效，从而可用于糖尿的预防或治疗。

根据本发明的优选实施例，本发明的组合物为(a)上述本发明的肽或肽复合体的药剂学有效剂量；以及(b)包含在药剂学上接受的载体的药剂组合物。

在本说明书中使用的术语“药剂学有效量”是指达成与上述的白细胞介素-3有关的肽的功效或活性的充分量。

包含于本发明的药剂学组合物的药剂学上接受的载体作为制剂时通常利用的载体，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不局限于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分之外，还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂等。适当的药剂学上接受的载体及制剂详细地记载于remington’pharmaceuticalsciences(19thed.，1995)。

本发明的药剂学组合物可进行口服用药或非口服用药，并且，在非口服用药的情况下，可通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、口腔注射、局部用药、经皮用药等来用药。

本发明的药剂学组合物的适当用药量可根据制剂化方法、用药方式、患者的年龄、体重、性别、病况、食物、用药时间、用药路径、排泄速度及反应感应性来以多种方式给予处方。另一方面，本发明的药剂学组合物的优选的用药量为每日0.0001-1000μg。

本发明的药剂学的组合物是根据本发明所属技术领域的普通技术人员容易实施的方法，利用药剂学上容许的担体和/或赋形剂进行制剂化，从而制备成单位容量形态或者放入大容量容器内而进行制备。此时，剂型可以是油或者水性媒质中的溶液、悬浮液或者乳化剂形态，或者也可以是提取物、粉末剂、颗粒剂、片剂、胶囊或者胶状(例如，水凝胶)形态，并且可以额外包含分散剂或者稳定剂。

【发明的效果】

概述归纳本发明的特征及优点如下：

(i)本发明的肽及肽复合体抑制脂肪堆积，并分解已堆积的脂肪来呈现抗肥胖效果，而且，有效减少血糖，从而对糖尿病呈现优秀的效果。

(ⅱ)本发明的肽及肽复合体减少作为脂质生成标记因子的过氧化物酶体增殖物激活受体γ、乙酰辅酶a羧化酶及脂肪特异性脂肪酸结合蛋白的表达，并增加作为脂肪分解因子的磷酸激素敏感性脂肪酶、腺苷酸活化蛋白激酶α1、比较基因鉴定-58及脂肪甘油三酯脂酶的表达，且减少脂肪细胞的大小及血液中胆固醇数值。

(ⅲ)本发明的肽及肽复合体的优秀活性及稳定性可有效适用于医药及医药外品。

【附图说明】

图1a、图1b及图1c为通过油红o(oilredo)染色确认当对本发明的肽进行处理时堆积的脂肪的结果。(图1a)序列表的序列1的肽，(图1b)序列表的序列3的肽，(图1c)(序列表的序列5的肽)。

图2为为了确认当按浓度对本发明的肽复合体进行处理时堆积的脂肪而通过油红o染色确认的结果。

图3a、图3b及图3c为当对本发明的肽进行处理时测定作为参与脂肪生成的基因的脂肪特异性脂肪酸结合蛋白2的表达量的结果。(图3a)序列表的序列1肽，(图3b)序列表的序列3的肽，(图3c)，序列表的序列5的肽。

图4为当按浓度对本发明的肽复合体进行处理时，当合成脂质时测定作为重要基因的过氧化物酶体增殖物激活受体γ、乙酰辅酶a羧化酶、脂肪特异性脂肪酸结合蛋白2基因的表达量的结果。

图5为当按浓度对本发明的肽复合体进行处理时，当合成脂质时测定作为重要蛋白质的过氧化物酶体增殖物激活受体γ、磷酸激素敏感性脂肪酶(phospho-hsl)蛋白质的表达量的结果。

图6a、图6b、图6c及图6d为测定当对本发明的肽及肽复合体进行处理时参与分解所堆积的脂肪的过程的作为基因的腺苷酸活化蛋白激酶α1和比较坚定基因-58的表达量的结果。(图6a)序列表的序列1的肽，(图6b)序列表的序列3的肽，(图6c)序列表的序列5的肽，(图6d)通过序列表的序列1、序列表的序列3及序列表的序列7的氨基酸序列表示的肽复合体。

图7为测定当按浓度对本发明的肽复合体进行处理时，作为参与分解所堆积脂肪的过程的蛋白质的脂肪甘油三酯脂酶的表达量的结果。

图8a、图8b、图8c及图8d为利用免疫染色测定当对本发明的肽进行处理时，利用作为参与分解所堆积脂肪的过程的蛋白质的磷酸激素敏感性脂肪酶的表达量的结果。(图8a)序列表的序列1的肽，(图8b)序列表的序列3的肽，(图8c)序列表的序列5的肽，(图8d)通过序列表的序列1、序列表的序列3及序列表的序列7的氨基酸序列表示的肽复合体。

图9为测定当按浓度对本发明的肽复合体进行处理时甘油的生成量的结果。

图10a为测定在肥胖小鼠实验模型中，按浓度对本发明的肽复合体进行处理后所分解的脂肪组织的结果。图10b为测定肥胖小鼠实验模型中，对本发明的肽复合体进行处理后所分解的脂肪组织的大小及数值的结果。

图11为利用免疫染色测定当对本发明的肽复合体进行处理时，作为参与分解所堆积脂肪的过程的蛋白质的磷酸激素敏感性脂肪酶的表达量的结果。

图12为测定当对本发明的肽复合体进行处理时在肥胖小鼠中体重的变化(a)及试料摄取变化(b)的结果。

图13为测定当对本发明的肽复合体进行处理时肥胖小鼠的形状的结果。

图14为使作为实验动物模型的c57bl/6小鼠模型摄取油腻饲料来制作肥胖小鼠模型，并对本发明的肽复合体进行处理后，通过微计算机断层扫描技术拍摄测定脂肪分布的结果。

图15为使作为实验动物模型的c57bl/6小鼠模型摄取油腻饲料来制作肥胖小鼠模型，并对本发明的肽复合体进行处理之后，采集脂肪细胞组织来观察的结果。

图16a为使作为实验动物模型的c57bl/6小鼠模型摄取油腻饲料来制作肥胖小鼠模型，并对本发明的肽复合体进行处理之后，采集脂肪细胞组织来观察脂肪细胞形状的结果。图16b为使作为实验动物模型的c57bl/6小鼠模型摄取油腻试料来形成肥胖小鼠模型，并对本发明的肽复合体进行处理之后，采集脂肪细胞组织来观察脂肪细胞大小的结果。

图17为使作为实验动物模型的c57bl/6小鼠模型摄取油腻饲料来制作肥胖小鼠模型，并对本发明的肽复合体进行处理之后，采集脂肪细胞组织来观察作为作用于脂肪细胞内的脂肪分解的蛋白质的磷酸激素敏感性脂肪酶的表达量的结果。

图18为使作为实验动物模型的c57bl/6小鼠模型摄取油腻饲料来制作肥胖小鼠模型，并对本发明的肽复合体进行处理之后，采集血液来测定胆固醇量的结果。

图19为使作为实验动物模型的c57bl/6小鼠模型摄取油腻饲料来制作肥胖小鼠模型，并对本发明的肽复合体进行处理之后，采取血液来测定血糖的结果。

图20a、图20b为在诱发糖尿病的dbdb小鼠模型中，对本发明的肽复合体进行处理之后，采集血液来测定血糖的变化的结果。

图21为在诱发糖尿病的dbdb小鼠模型中，对本发明的肽复合体进行处理之后，采集血液来测定胆固醇的变化的结果。

图22a、图22b、图22c为在引发糖尿病的dbdb小鼠模型中，对本发明的肽复合体进行处理之后，采集血液来测定血糖的变化的结果。(图22a)序列表的序列1的肽，(图22b)序列表的序列3的肽，(图22c)序列表的序列5的肽。

图23为当对本发明的序列表的序列7的肽进行处理时，测定胰岛素样生长因子1(igf-1)和胰岛素的表达量的结果。

图24为在诱发糖尿病的dbdb小鼠模型中，对本发明的序列表的序列7的肽进行处理之后，采集血液来测定血糖的变化的结果。

图25a、图25b、图25c、图25d为在血糖高的糖尿病患者中，对本发明的肽复合体进行处理之后，采集血液来测定血糖的变化的结果。

【具体实施方式】

以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。这些实施例仅用于更加具体地说明本发明，本发明的范围并不根据本发明的要旨而受这些实施例的限制，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

【实施例】

【合成例1:肽合成】

将700mg的氯三苯甲基氯树脂(chlorotritylchlorideresin；ctlresin，novabiochemcatno.01-64-0021)放入反应容器，并添加10ml的亚甲基氯(mc，methylenechloride)来搅拌3分钟。除去溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺(dmf，dimethylformamide)来搅拌3分钟之后，再次除去溶剂。向反应器放入10ml的二氯甲烷(dcm，dichloromethane)溶液，并放入200mmole的芴甲氧羰基-fmoc-asn(trt)-oh)(巴亨公司(bachem)，瑞士(swiss))及400mmole的n，n-二异丙基乙胺(diea，n，n-diisopropylethylamine)之后进行搅拌使它们均匀溶解，再搅拌1小时并进行反应。反应后进行清洗，将甲醇和diea(2:1)溶解在dcm进行10分钟反应，并用过量的dcm/dmf(1:1)进行清洗。除去溶液，并放入10ml的dmf搅拌3分钟之后，再次除去溶剂。将10ml的脱保护溶液(20％的哌啶(piperidine)/dmf)放入反应容器，在常温下搅拌10分钟之后除去溶液。放入相同量的脱保护溶液，再维持10分钟的反应之后去除溶液，并分别隔3分钟用dmf清洗2次，用mc清洗1次，并用dmf清洗1次，来制备了arg(pbf)-氯三苯甲基氯树脂(asn-ctlresin)。向新的反应器放入10ml的dmf溶液，并放入200mmole的芴甲氧羰基-γ-三苯甲基-l-谷氨酰胺(fmoc-arg(pbf)-oh)(bachem，swiss)、200mmole的羟基苯并三唑(hobt)及200mmole的苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(bop)之后进行搅拌来使它们均匀溶解。以分馏的方式向反应器分两次放入400mmole的n，n-二异丙基乙胺(diea，n，n-diisopropylethylamine)2次之后，最小限度地搅拌5分钟，直到所有固体溶解为止。将溶解的氨基酸混合溶液放入有脱保护的树脂的反应容器，并在常温下搅拌1小时并进行反应。除去反应液，用dmf溶液隔5分钟搅拌3次之后进行除去。取出少量的反应树脂，并利用茚三酮试验(nihydrintest)检查反应程度。与上述方法相同地，用脱保护溶液进行2次脱保护反应，来制备了arg-asn-ctl树脂。用dmf和mc充分清洗，再次执行一次茚三酮试验之后，与上述方法相同地，执行了以下的氨基酸附着实验。通过选定的氨基酸序列，以fmoc-tyr(tbu)-oh,fmoc-lys(boc)-oh及fmoc-leu-oh顺序进行了链式反应。用脱保护溶液使fmoc-保护基隔10分钟反应2次之后，通过均匀清洗来进行除去。放入乙酸酐和diea、羟基苯并三唑(hobt，hydroxybenzotriazole)执行1小时乙酰化之后，用dmf、mc及甲醇分别将制成的肽基树脂清洗3次，慢慢将氮空气流出来进行干燥之后，在五氧化二磷(p2o5，phosphoruspentoxide)条件下用真空进行减压，等完全干燥之后，放入30ml的泄漏溶液[三氟乙酸(tfa，trifluroaceticacid)81.5％、蒸馏水5％、茴香硫醚(thioanisole)5％,苯酚(phenol)5％,edt2.5％及tis1％]之后，在常温下偶尔摇晃，并维持2小时反应。对树脂进行过滤，并用少量的溶液清洗树脂之后将其与母液合起来。利用减压来蒸馏，使得整体容积剩一半左右，并添加50ml的凉的醚诱导沉淀之后，进行离心分离来收集沉淀，并用更凉的醚清洗2次。除去母液，并在氮条件下充分干燥，提纯之前合成了0.85g的nh2-leu-lys-thr-arg-asn-cooh肽1(收率：92％)。由序列2及序列3合成了0.78g的nh2-lys-gly-ala-cys(ser)-thr-gly-trp-met-ala-cooh(收率：82％)，序列4及序列5合成了0.92g的nh2-ala-cys(ser)thr-leu-pro-his-pro-trp-phe-cys(ser)-cooh(收率：85％)。由序列6及序列7合成了0.76g的nh2-cys(ser)-asp-leu-arg-arg-leu-glu-met-tyr-cys(ser)-cooh(收率：88％)。利用分子量测定器进行测定时，序列1的肽的分子量为630.7(理论值：630.7)，序列2的分子量为924.5(理论值：924.1)，序列4的分子量为1263(理论值：1236.5)，序列6肽的分子量为1301.5(理论值1301.5)。

【表1】

另一方面，混合相同量的序列表的序列1、序列表的序列3及序列表的序列7的肽来形成肽复合体，并对复合体的功效进行了评价。

【实施例1：评价脂质生成抑制活性】

【1-1.利用前脂肪细胞的脂质堆积抑制(油红o染色(oilredostaining))】

将作为前脂肪细胞(pre-adipocyte)的3t3-l1细胞培养至汇合(confluent)状态之后，交换成包含10μg/ml胰岛素、0.1μm地塞米松及0.5μm的1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(ibmx)的分化培养基以及按浓度对肽进行处理并培养2天，在之后每2天交换了包含10μg/ml胰岛素的培养基，在分化诱导10日之后，为了确认细胞内小滴(droplet)而实施油红o染色。通过磷酸盐缓冲液(pbs)清洗准备的3t3-l1前脂肪细胞之后，利用3.7％的福尔马林固定1小时，利用60％的异丙醇进行洗涤之后，对油红o溶液进行处理并在室温中染色了20分钟。染色之后，去除油红o溶液，用蒸馏水进行三次洗涤之后，利用相差显微镜观察了被染色的细胞。并且，为了定量分析，利用100％的异丙醇提取脂肪之后，向96孔板每次移动200μl，并通过酶联免疫检测仪在500nm中测定了吸光度。

实验结果，当对序列表的序列1、序列3及序列5的肽进行处理时，可通过染色油红o确认细胞内脂肪堆积程度的减少(图1a-图1c)。

并且，当按浓度对序列表的序列1、序列3及序列7的肽复合体进行处理时，可确定细胞内脂肪堆积程度的减少(图2)。

【1-2.参与脂质生成的基因的表达抑制】

按3×10⁵细胞/孔的细胞密度，在6孔板种植了3t3-l1(前脂肪细胞)。培养24小时之后，按浓度(0.1、1、10μg/ml)对肽进行处理，并在37℃的培养基中培养了14天。在回收结束培养的细胞之后，对核糖核酸(rna)提取溶液(easyblue，内含子(intron))进行处理来准备核糖核酸之后，使用rt预混合液(内含子)合成了互补脱氧核糖核酸(cdna)。使用对于各个标记因子(过氧化物酶体增殖物激活受体γ、乙酰辅酶a羧化酶、脂肪特异性脂肪酸结合蛋白2)的引物和聚合酶链反应(pcr)预混合液(内含子)进行了聚合酶链反应。

用于脂质生成指标因子聚合酶链式反应的靶-特异性引物序列如下：过氧化物酶体增殖物激活受体γ正向引物序列，5’-ttttcaagggtgccagtttc-3’及过氧化物酶体增殖物激活受体γ逆向引物，5’-aatccttggccctctgagat-3’(退火温度，60℃)；乙酰辅酶a羧化酶正向引物序列，5’-accttactgccatcccatgtgcta-3’及acc逆向引物，5’-gtgcctgatgatcgcacgaacaaa-3’(退火温度，60℃)；脂肪特异性脂肪酸结合蛋白2正向引物序列，5’-catcagcgtaaatggggatt-3’及脂肪特异性脂肪酸结合蛋白2逆向引物，5’-acacattccaccaccagctt-3’(退火温度，60℃)。

向1％的琼脂糖凝胶每次装载5μl的聚合酶链式反应产物并进行电泳之后，在gel-doc中确认了条带。

在小鼠骨细胞株3t3-l1中，对序列表的序列1、序列3或序列5的肽进行处理并培养3天，结果，可观察作为脂质生成标记因子的脂肪特异性脂肪酸结合蛋白2的表达减少(图3a-图3c)。

在小鼠骨细胞株3t3-l1中，以0.1μg/ml、1μg/ml及10μg/ml的浓度对序列表的序列1、序列表的序列3及序列表的序列7的肽复合体进行处理并培养3天，结果，可观察作为脂质生成标记因子的过氧化物酶体增殖物激活受体γ、乙酰辅酶a羧化酶、脂肪特异性脂肪酸结合蛋白2的表达均在作为阳性对照组100ng/ml的肿瘤坏死因子-α(tnfα)处理组和肽复合体处理组中减少(图4)。

【1-3.利用前脂肪细胞的脂质生成及分解诱导蛋白质表达观察】

按3×10⁵细胞/孔的细胞密度，在6孔板种植了3t3-l1(前脂肪细胞)。培养24小时之后，按浓度(0.1μg/ml、1μg/ml及10μg/ml)对肽复合体进行处理，并在37℃培养基中培养了14天。通过处理细胞溶解缓冲液来确保溶解物之后，进行蛋白质的定量，利用作为脂肪生成因子的抗过氧化物酶体增殖物激活受体γ抗体(santacruzbiotechnology，usa)和作为脂肪分解因子的抗磷酸激素敏感性脂肪酶抗体(santacruzbiotechnology，usa)进行了免疫印迹分析。

当作为脂肪生成标记的过氧化物酶体增殖物激活受体γ蛋白质的表达按浓度对肽复合体进行处理时，可观察肽复合体以浓度依赖性地均减少，当观察作为脂肪分解标记的磷酸激素敏感性脂肪酶蛋白质的表达量时，可观察在肽复合体处理组中，肽复合体均增加(图5)。

【实施例2：脂质分解活性评价】

【2-1.参与脂质分解的基因的表达增加】

按3×10⁵细胞/孔的细胞密度，在6孔板种植了3t3-l1(前脂肪细胞)。培养24小时之后，按浓度(0.1μg/ml、1μg/ml及10μg/ml)对肽进行处理，并在37℃培养基中培养了14天(阳性对照组：100ng/ml肿瘤坏死因子-α(西格玛公司(sigma)))。在回收培养完成的细胞之后，对核糖核酸提取溶液(easyblue，intron)进行处理来准备核糖核酸之后，使用rt预混合液(intron)合成了互补脱氧核糖核酸(cdna)。使用对于各个标记因子(腺苷酸活化蛋白激酶α1、比较坚定基因-58)的引物和聚合酶链反应预混合液(intron)来进行了聚合酶链反应。

用于脂质生成标记因子聚合酶链反应的靶-特异性引物序列如下：腺苷酸活化蛋白激酶α1正向引物序列，5’-tgaccggacataaagtggctgtga-3’及腺苷酸活化蛋白激酶α1逆向引物，5’-tgatgatgtgagggtgcctgaaca-3’(退火温度，60℃)；比较坚定基因-58正向引物序列，5’-tgtgcaggactcttacttggcagt-3’及比较坚定基因-58逆向引物，5’-gtttctttgggcagaccggtttct-3’(退火温度，60℃)。

向1％琼脂糖凝胶每次装载5μl的聚合酶链反应产物并进行电泳之后，在gel-doc中确认了带。

在前脂肪细胞(3t3-l1)中，对肽进行处理并培养，结果，可观察作为脂质分解标记的腺苷酸活化蛋白激酶α1和比较基因鉴定-58的表达在各个肽处理组中均增加(图6a～图6c)。并且，在对肽复合体进行处理的情况下，可确认腺苷酸活化蛋白激酶α1和比较基因鉴定-58的表达以依赖浓度的方式增加，当与作为阳性对照组的100ng/ml的肿瘤坏死因子-α处理组进行比较时，可观察脂肪分解因子的表达急剧增加(图6d)。

【2-2.利用前脂肪细胞的脂质分解诱导蛋白质表达观察】

按3×10⁵细胞/孔的细胞密度，在6孔板种植了3t3-l1(前脂肪细胞)。培养24小时之后，按浓度(0.1μg/ml、1μg/ml及10μg/ml)对肽进行处理，并在37℃培养基中培养了14天(阳性对照组：100ng/ml的肿瘤坏死因子-α(西格玛公司))。对细胞溶解缓冲液进行处理来确保溶解物之后，对蛋白质进行定量，利用作为脂肪分解因子的抗脂肪甘油三酯脂酶抗体进行免疫印迹分析。

可确认作为脂肪分解因子的脂肪甘油三酯脂酶的表达通过肽复合体增加(图7)。

【2-3.利用前脂肪细胞的脂质分解诱导蛋白质表达荧光显微镜观察】

按3×10⁵细胞/孔的细胞密度，在6孔板种植了3t3-l1(前脂肪细胞)。培养24小时之后，对肽或肽复合体(1μg/ml)进行处理，并在37℃培养基中培养了14天(阳性对照组：100ng/ml的肿瘤坏死因子-α(西格玛公司))。利用70％乙醇固定结束培养的细胞之后，利用抗磷酸激素敏感性脂肪酶抗体(santacruzbiotechnology，usa)，通过细胞免疫染色法观察作为脂肪分解诱导因子的磷酸激素敏感性脂肪酶的细胞内表达。

实验结果，可确认通过各个肽(图8a～图8c)及肽复合体(图8d)，作为脂肪分解诱导因子的磷酸激素敏感性脂肪酶的表达会增加。

【2-4.作为脂肪分解产物的甘油的量测定】

从肥胖诱导小鼠的腹部采集脂肪组织之后，在24孔培养板中，在每个孔放入100mg的脂肪组织之后，在培养基(1ml的krebs-ringer缓冲液(buffer)包含25mm的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，5.5mm的葡萄糖(glucose)和2％的(w/v)牛血清白蛋白(bovineserumalbumin))中进行了培养。当培养时，以0.1μg/ml、1μg/ml及10μg/ml的浓度对复合体进行处理，作为阳性对照组，处理了100ng/ml的肿瘤坏死因子-α，培养48小时之后，测定了从脂肪分解出的甘油的量。

实验结果，当按浓度对肽复合体进行处理时，可观察脂肪在脂肪分解的过程中所产生的甘油的量以依赖于肽复合体处理浓度的方式增加。确认了与作为阳性对照组的肿瘤坏死因子-α处理组相比，检测到更多量的甘油(图9)。

【2-5.对于肥胖小鼠分离脂肪组织的分解效果确认】

根据颜色，脂肪组织分为白色脂肪(whitefat)、褐色脂肪(brownfat)，根据部位，脂肪组织分为皮下脂肪、腹部脂肪、肠间膜脂肪(内脏脂肪)及附睾脂肪。在解剖之后，摘除各个脂肪并分离白色脂肪之后，以各100mg/孔的重量，在24孔板中，按复合剂浓度进行处理之后，在培养基(1ml的krebs-ringer缓冲液包含25mm的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，5.5mm的葡萄糖和2％的(w/v)牛血清白蛋白)中培养72小时之后，切片组织并利用苏木精和曙红进行染色，通过200倍显微镜(ts100，尼康(nicon)公司)进行观察来比较了脂肪细胞的大小。

实验结果，当按浓度对肽复合体进行处理时，与对照组相比，比较脂肪细胞的大小，结果，确认了脂肪细胞的大小变小(图10a)。并且，在进行染色之后，为了测定脂肪细胞的大小而使用程序来测定脂肪细胞的大小，最终，观察了在肽复合体处理组中，具有明显细胞膜划分的脂肪组织内细胞大小的减少(图10b)。

【2-6.对于脂肪组织的脂肪分解因子观察】

从肥胖诱导小鼠的腹部采集脂肪组织之后，在24孔培养板中，在每个孔放入100mg的脂肪组织之后，在培养基(1ml的krebs-ringerbuffer包含25mm的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，5.5mm的葡萄糖和2％的(w/v)牛血清白蛋白)中进行了培养。在进行培养时，对肽复合体进行处理，作为阳性对照组，处理了100ng/ml的肿瘤坏死因子-α，培养48小时之后，确认了作为脂肪分解因子的磷酸激素敏感性脂肪酶(绿色荧光物质)的表达。

实验结果，确认作为在脂肪组织中的脂肪分解因子的磷酸激素敏感性脂肪酶的表达，结果，当对肽复合体进行处理时，可确认作为脂肪分解因子的磷酸激素敏感性脂肪酶的表达的增加(图11)。

【实施例3：通过实验动物的脂肪生成抑制及脂肪分解促进效果】

基于高脂肪饮食的体重减少及脂肪生成抑制

利用通过使正常c57bl/6小鼠摄取高脂肪饮食来诱导的肥胖诱导模型饮食诱导肥胖(dio，dietsinducedobesity)进行抗肥胖功效实验，作为阳性对照组药物，使用了5μg/ml的肿瘤坏死因子-α。对照组以一般食物进行，而并非以高脂肪饮食进行，实验摄取12周的高脂肪饮食，并对肽复合体进行处理，并对阳性对照组进行处理来确认了体重的减少。

在12周内，在每天下午3点～4点，将肿瘤坏死因子-α及抗肥胖功效化合物强制腹腔注射84天，在第一次给药之前测定体重和饮食量，之后，以一周为间隔，测定了体重和食物量。血糖在结束给药实验后，从尾部静脉采血之后，利用罗氏活力型血糖仪(accu-checkactive)(roche)来测定，胆固醇(cholesterol)也通过从尾部静脉采取的血清，利用胆固醇计算试剂盒(cholesterolcalculationkit)(biovision)来进行了分析。根据颜色，脂肪组织分为白色脂肪、褐色脂肪，根据部位，脂肪组织分为皮下脂肪、腹部脂肪、肠间膜脂肪(内脏脂肪)及附睾脂肪。在解剖之后，摘除各个脂肪来进行观察，为了进行组织学检查，将脂肪固定在10％的中性缓冲福尔马林之后，种植在石蜡块并分成5μm并进行了苏木(hematoxylin)和伊红(eosin)染色。作为脂质分解因子的激素敏感性脂肪酶的磷酸化程度通过利用抗磷酸激素敏感性脂肪酶抗体的荧光染色来进行。制作组织样品之后，通过甘油胶安装媒介(glycerinejellmountingmedia)进行安装，并盖住玻璃盖后，通过显微镜(尼康公司，ts100)进行观察，并通过内置于显微镜的数码摄像头拍摄了组织。

如下确认：摄取一般食物12周的小鼠的体重从实验初期20.9g在12周之后上升至28.74g，摄取高脂肪饮食的小鼠的体重从初期的20.99g在12周后上升至49.5g。但是，在与高脂肪饮食并用并处理的肽复合体组中，从初期21.1g在12周后上升至36.76g，与仅摄取高脂肪饮食的对照组(235.8％)相比，可确认有高的体重减少(174.2％)(表2及图12)。

【表2：对肥胖小鼠模型处理肽复合体之后测定体重】

并且，在12周内，测定实验结束的动物照片，结果，与仅摄取高脂肪饮食的组相比，在肽复合体处理组中，可观察小鼠的身体的大小与正常小鼠(一般食物)的大小类似(图13)。

对进行12周实验的小鼠进行微计算机断层扫描技术拍摄来确认了整个身体的脂肪分布。确认分布在整个身体的脂肪(呈黄色)，结果，与摄取一般食物的对照组相比，可确认在摄取高脂肪饮食的对照组的小鼠中，分布在整个身体的脂肪的量急剧增加，在与高脂肪摄取一同处理肽复合体的组中，可确认分布在整个身体的脂肪的量急剧下降(图14)。

解剖拍摄完胃部的微计算机断层扫描技术的小鼠并采集分布在整个身体的脂肪组织来观察了脂肪组织的量。结果，与摄取一般食物的对照组相比，可确认在摄取高脂肪饮食的对照组的小鼠中的脂肪的量多，在于高脂肪饮食一同处理肽复合体的组中，可确认脂肪的量急剧下降(图15)。

分离脂肪并通过苏木精-伊红染色(h&e)染色观察脂肪的大小，结果，可确认与摄取高脂肪饮食的对照组相比，在与高脂肪饮食一同摄取肽复合体的处理组中，脂肪的大小变小(图16a)。通过程序分析脂肪大小，结果，当将一般食物的对照组的脂肪大小计算成100％时，摄取高脂肪饮食的对照组的脂肪大小为127％，确认了脂肪的大小变大，且与高脂肪饮食一同摄取肽复合体的组中，脂肪的大小为减少至97％(图16b)。

分离脂肪并确认作为在脂肪组织内表达的脂肪分解因子的磷酸激素敏感性脂肪酶的表达量的结果，确认了与高脂肪饮食一同摄取肽复合体的处理组中，磷酸激素敏感性脂肪酶的表达增加(图17)。

完成实验之后，确认小鼠血液内的胆固醇量，结果，摄取一般食物的小鼠的胆固醇量为2.52μg/ml，摄取高脂肪饮食的对照组的胆固醇量为3.5μg/ml，与高脂肪饮食一同摄取肽复合体的组中，胆固醇量为2.86μg/ml。在肽复合体处理组中，可确认了当肥胖时降低上升的胆固醇的数值(图18)。

确认完成实验的小鼠血液内的血糖数值，结果，摄取一般食物的对照组的小鼠的血糖为174mg/dl，摄取高脂肪饮食的对照组的血糖为235mg/dl，由此可确认血糖数值的上升，在与高脂肪饮食一同摄取肽复合体的组中，血糖数值为183mg/dl，由此确认了减少了与摄取一般食物的对照组类似的血糖数值。

【实施例4：血糖调整】

【血糖调整效果】

在本动物实验中使用了c57bl/6(正常小鼠)((株)samtako)和雄性c57blks/jlepr(糖尿模型小鼠，db/db小鼠)((株)从中央实验动物购买)，作为抗糖尿病和/或抗肥胖功效物质，使用了复合剂，作为阳性对照组药物，使用了西他列汀(sitagliptin)。在本实施例中，对于正常小鼠模型和可具有遗传性糖尿病的模型的极性糖尿病功效(单次给药)，通过作为代表性糖尿病诊断检查方法的葡萄糖耐量试验(gtt，glucosetolerancetest)方法对抗糖尿病和/或抗肥胖功效复合剂进行了评价。小鼠的饲养环境条件设定为22～24℃，相对湿度为50～30％，并在每个饲养箱饲养四只小鼠。从上午8点至下午8点给予150-300勒克斯(lux)的照明，且每天开灯12小时并关灯12小时。饲料使用了一般饮食(18％蛋白质，2018，harlanlaboratoriesinc，usa制作)并使小鼠自由摄取，并在进行itt实验前，使小鼠绝食4小时以上，且在进行葡萄糖耐量试验之前12小时开始使小鼠绝食。在执行葡萄糖耐量试验之前1小时，把复合剂分别利用口服给药用一次性注射器来进行强制口服给药，为了进行葡萄糖耐量试验，在进行实验0时间时，使小鼠摄取40分钟的高脂肪饮食。在自由摄取高脂肪饮食40分钟之后，为了分别检查血液内的血糖，以0分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟及180分钟的间隔从尾部静脉采血并利用罗氏活力型血糖仪测定了血糖水平。另一方面，作为阳性对照组药物，选择了目前用为糖尿治疗剂的西他列汀，并以100mg/kg的给药量进行给药。作为抗糖尿病和/或抗肥胖功效后部物质选择的复合剂按100mg/kg的给药量划分实验组，且每个实验组使用4只公小鼠。

实验结果，借助高脂肪饮食增加的血糖数值因肽复合体处理而呈现出血糖减少效果。在糖尿病引发小鼠模型中，确认了糖尿病的高血糖减少(图20a、图20b)。并且，与摄取高脂肪饮食的对照组相比，在与高脂肪饮食一同摄取肽复合体的处理组中确认胆固醇量的降低(参照图21)。

并且，使诱导db/db糖尿病的小鼠维持16小时空腹之后，使小鼠摄取30分钟饮食后，并使小鼠摄取肽，且按时间测定了血糖数值。

实验结果，观察在处理序列表的序列1、序列3及序列5的肽的组中，高血糖的数值以依赖时间的方式降低(图22a～图22c)。

【实施例5：胰岛素和胰岛素类似成长因子的表达促进】

【胰岛素和胰岛素类似成长因子的表达促进】

按3×10⁵细胞/孔的细胞密度，在6孔板种植了3t3-l1(前脂肪细胞)。在培养24小时之后，按浓度(10ng～1μg/ml)对肽进行处理，并在37℃培养基中培养了14天。对细胞溶解缓冲液进行处理来确保溶解物之后，对蛋白质进行定量，利用作为脂肪分解因子的抗胰岛素样生长因子1(igf-1)、胰岛素抗体(santacruzbiotechnology，usa)来实施蛋白印迹分析并进行了观察。

实验结果，观察了借助序列表的序列7的肽，类胰岛素一号增长因子和胰岛素的表达以依赖浓度的方式增加(图23)。

【实施例6：通过临床实验的血糖减少效果观察】

【基于复合剂服用的血糖减少】

以空腹血糖为170mg/dl以上，且45～65岁为对象，简单临床实验进行空腹血糖基准，在饭后30分钟摄取复合制剂并以30、60、90、120、150、180分钟的间隔取血，且利用罗氏活力型血糖仪测定了血糖水平。

实验结果，均在每位实验对象中观察到基于复合制剂的血糖减少(图25a～图25d)。

以上，详细记述了本发明的特定的部分，对于该领域的普通技术人员来说，明确的是，这种详细记述仅为优选实施例，本发明的范围并不受其限制。因此，本发明的实质范围由所附的发明要求保护范围和与其等同的技术方案定义。

本说明书还包括下列内容：

1.一种肽，其特征在于，由选自由序列表的序列1至序列7中所记载的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成。

2.一种肽，具有抗肥胖或抗糖尿病活性，其特征在于，由选自由序列表的序列1至序列7的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成。

3.根据实施方式2所述的肽，其特征在于，上述肽抑制脂质生成。

4.根据实施方式2所述的肽，其特征在于，上述肽减少过氧化物酶体增殖物激活受体γ、乙酰辅酶a羧化酶或脂肪特异性脂肪酸结合蛋白2的表达。

5.根据实施方式2所述的肽，其特征在于，上述肽增加脂肪分解。

6.根据实施方式2所述的肽，其特征在于，上述肽增加磷酸激素敏感性脂肪酶、腺苷酸活化蛋白激酶α1、比较基因鉴定-58或脂肪甘油三酯脂酶的表达。

7.根据实施方式2所述的肽，其特征在于，上述肽减少血糖。

8.一种肽复合体，具有抗肥胖或抗糖尿病活性，其特征在于，包含：

(a)由序列表的序列1形成的肽；

(b)由序列表的序列2或序列3形成的肽：以及

(c)由序列表的序列6或序列7形成的肽。

9.根据实施方式8所述的肽复合体，其特征在于，上述肽复合体减少脂肪细胞的大小。

10.根据实施方式8所述的肽复合体，其特征在于，上述肽复合体减少血液中的胆固醇。

11.一种肥胖的预防或治疗用药剂组合物，其特征在于，包含实施方式2至7中任一项所述的肽作为有效成分。

12.一种肥胖的预防或治疗用药剂组合物，其特征在于，包含实施方式8至10中任一项所述的肽复合体作为有效成分。

13.一种糖尿病的预防或治疗用药剂组合物，其特征在于，包含实施方式2至7中任一项所述的肽作为有效成分。

14.一种糖尿病的预防或治疗用药剂组合物，其特征在于，包含实施方式8至10中任一项所述的肽复合体作为有效成分。

15.一种肥胖或糖尿病的预防或治疗方法，其特征在于，包括将实施方式2至7中的任一项所述的肽的药剂学有效剂量给药到对象的步骤。

16.一种肥胖或糖尿病的预防或治疗方法，其特征在于，包括将实施方式8至10中任一项所述的肽复合体的药剂学有效剂量给药到对象的步骤。

序列表

<110>caregenco.,ltd.

<120>具有抗肥胖及抗糖尿病功效的肽及其的用途

<130>pp150058cn

<150>kr15/0059648

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