新型乳酸菌抗菌肽及高效表达及抗菌抗癌活性的应用的制作方法

本发明涉及基因工程和生物技术领域，尤其是涉及一种新型乳酸菌抗菌肽lhh1的高效表达及抗菌抗癌活性的应用。

背景技术：

自上世纪90年代以来，对抗菌肽等新型抗菌物质的研究日益增加，其中防御素、富组蛋白(histatin)等抗菌活性肽家族是人体免疫系统的天然成分，具有抗菌活性强、毒副作用小，耐药菌株少等优点，备受关注。抗菌肽在机体受到病毒、细菌等攻击时会被诱导产生，是动、植物和人类先天性免疫机制的组成部分，具有广谱抗菌作用，尤其对一些产生抗生素耐药性的病原菌，故而在农业、医疗、食品等多个领域应用潜力很大。

乳酸菌是一类以糖为原料产生乳酸的细菌，具有提高食品营养价值、改善食品风味、延长保存时间、对人畜安全无害，有保健功能的益生菌，因此被视为理想的蛋白多肽类物质的口服载体与表达载体。目前为止，已发现上千种天然抗菌肽，但其来源较复杂，安全指数待考究，因此，人们希望能从益生菌内探寻相关的抗菌肽，以保证其使用的安全性。

人们为了得到抗菌肽主要采用了三种方法：1.直接从生物体中提取天然肽；2.化学方法合成；3.采用基因工程的方法。前两种由于成本过高，不适用于大规模生产，基因工程表达的方法越来越被大家所认可。先构建高效表达的发酵菌株，并建立其纯化和发酵的条件和方法，以便抗菌肽的生产推广和其在多方面的应用。

技术实现要素：

本发明通过基因工程技术表达了一种来自干酪乳杆菌的新型抗菌肽lhh1，得到其高效表达的发酵菌株，并证实了lhh1的抗菌抗癌活性，以及在不同温度下lhh1的稳定性。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种新型乳酸菌抗菌肽，核苷酸序列见seqidno.1所示。

而且，所述抗菌肽的氨基酸序列、分子量、电荷数、等电点、疏水性分别为：afaliagalyrifhrr，1875.25，+3，11.71，0.98。

一种新型乳酸菌抗菌肽的表达方法，其特征在于：包括以下步骤：

s1.合成权利要求1所述的氨基酸序列，该序列为新型乳酸菌抗菌肽基因；

s2.构建含抗菌肽重组大肠杆菌基因工程菌；

s3.抗菌肽融合蛋白的诱导表达；

s4.抗菌肽的纯化。

而且，所述s1过程包括：根据干酪乳杆菌基因genbank：(moag00000000.1)并应用生物信息学工具计算各组合的一级特征参数、预测二级和抗菌活性，设计出具有医疗潜力的抗菌肽lhh1；根据大肠杆菌对密码子的偏爱性将抗菌肽的基因序列翻译成核酸序列，在其两端加上bsai和hindiii限制性内切酶位点和保护性碱基，合成引物f1、r1应用，所述引物的核苷酸序列如下seqidno.2和seqidno.3。

而且，所述s2过程包括：构建抗菌肽表达质粒pe-sumo-lhh1并测序鉴定，构建基因工程菌株pe-sumo-ea-lhh1/rosetta(de3)plyss并测序鉴定，所述测序鉴定seqidno.4，测序结果使用ncbiblast与所设计的基因进行对比，选取两者结果一致的重组菌为测序结果正确的重组菌。

而且，所述s3过程中包括：将步骤s2中测序结果正确的重组菌和含有空载体的对照菌进行平板培养、种子培养，将发酵液中菌体生长到对数期后分别加入iptg诱导表达，然后进行sds-page分析和hplc分析，选取表达成功的抗菌肽。

而且，所述s4过程包括：将基因工程菌pe-sumo-ea-lhh1/rosetta(de3)plyss大量培养、诱导，收集菌体并获得融合蛋白，进行亲和层析纯化，纯化后的融合蛋白经肠激酶切割去除标签，然后进行定量，纯化样品保留。

新型乳酸菌抗菌肽作为制备抗癌制剂的应用。

新型乳酸菌抗菌肽作为制备抗菌制剂的应用。

本发明的有益效果为：

本发明表达了一种来自干酪乳杆菌的新型抗菌肽lhh1，得到其高效表达的发酵菌株，并证实了lhh1的抗菌抗癌活性，以及在不同温度下lhh1的稳定性。

本发明所获得的重组大肠杆菌可以高效表达lhh1，其菌体裂解物对金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)等革兰阳性细菌具有较强的抑菌活性，对酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)等真菌也具有一定的抑菌活性，且即使在100℃处理下的lhh1，仍保持着较强的抑菌能力。将纯化后的抗菌肽加入铺在96孔板培养的癌细胞中，可以显著抑制癌细胞的增值。本发明方法不仅在乳酸菌中分析发现了一种新型抗菌肽lhh1，还为其提供了基因工程表达的方法，而且所获得的lhh1稳定性强，具有较好的抗菌抗癌活性，可作为优良的防腐添加剂及发酵剂用于食品、药品、饲料等行业中。

附图说明

图1为干酪乳杆菌的基因图谱图；

图2为抗菌肽lhh1的二级结构模拟图；

图3为抗菌肽lhh1的表达质粒pe-sumo-ea-lhh1的构建过程示意图以及重组表达载体的质粒的pcr鉴定。

图4为抗菌肽lhh1表达产物的sds-page分析。

图5为抗菌肽lhh1高效液相色谱图，上图为酶切后的lhh1，用于确定其结构正确，下图为纯化后的lhh1。

图6为纯化后的lhh1的tricine-sds-page分析。其中泳道1为单独表达的sumo标签蛋白，泳道2为未纯化的融合蛋白——sumo标签蛋白+抗菌肽lhh1，泳道3为纯化后的融合蛋白，泳道4为肠激酶酶切后的融合蛋白，泳道5为高效液相色谱纯化后的融合蛋白。

图7为抗菌肽lhh1的质谱分析图。

图8为对表达的抗菌肽lhh1抑制金黄色葡萄球菌检定，1为表达纯化的lhh1；2为表达纯化后的sumo-lhh1；3为表达纯化后的sumo蛋白。

图9为抗菌肽lhh1对癌细胞的mtt检测。

图10为不同温度处理的抗菌肽抑菌活性，1为40℃，2为60℃，3为80℃，4为100℃，c为对照组——没有经过加热处理过的抗菌肽。

图11是大量抑菌实验汇总得到的抗菌肽lhh1的抑菌谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明提供一种新型乳酸菌抗菌肽lhh1的高效表达及抗菌抗癌活性的应用。具体内容包括：依照大肠杆菌密码子偏爱性优化lhh1基因，通过pcr扩增得到优化后的lhh1基因，将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pesumo中，构建得到pesumo-lhh1重组质粒。将重组质粒转化到rosetta(de3)plyss中，经sds-page检测确定lhh1的表达水平，经琼脂孔扩散法和细胞mtt法检测抗菌及抗癌活性。另外，为检测抗菌肽lhh1的热稳定性，对其用不同温度处理后，再测试其抑菌活性。

结果显示：本发明所获得的重组大肠杆菌可以高效表达lhh1，其菌体裂解物对金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)等革兰阳性细菌具有较强的抑菌活性，对酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)等真菌也具有一定的抑菌活性，且即使在100℃处理下的lhh1，仍保持着较强的抑菌能力。将纯化后的抗菌肽加入铺在96孔板培养的癌细胞中，可以显著抑制癌细胞的增值。本发明方法不仅在乳酸菌中分析发现了一种新型抗菌肽lhh1，还为其提供了基因工程表达的方法，而且所获得的lhh1稳定性强，具有较好的抗菌抗癌活性，可作为优良的防腐添加剂及发酵剂用于食品、药品、饲料等行业中。

实施例1

一种新型乳酸菌抗菌肽lhh1的制备，其核苷酸序列如下；

两端各加入了bsai和hindiii限制性内切酶位点和保护性碱基，所述保护性碱基为两尾端部分。所述抗菌肽lhh1的氨基酸序列、分子量、电荷数、等电点、疏水性分别为：afaliagalyrifhrr，1875.25，+3，11.71，0.98。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种上述工程菌的构建方法。技术方案如下：

本发明通过全合成抗菌肽lhh1的基因序列，通过pcr技术将其扩增下来，引物序列为：

f：tttggtctccaggtgatgatgatgataaagcgtttgccttaatcg

r：ggggggaagctttcattaacgacgatgaaata

pcr反应体系:双蒸馏水(ddh2o)41μl、10×pcrbuffer5μl、dntpmixture1μl、引物f与r各1μl、fastpfu(5/μl)1μl，共计50μl。在pcr反应管中加入上述组分，混匀后瞬时离心，使液体聚积在pcr反应管底部，放入pcr仪中，反应条件为95℃预变性5min，56℃退火30s，72℃延伸20s。30个循环后72℃延伸10min。pcr结束后，取5μlpcr产物在含有eb的2％agarosegel电泳检测。其余产物-20℃保存备用。

实施例2

构建抗菌肽lhh1重组大肠杆菌基因工程菌

(1)构建克隆载体

将抗菌肽的基因胶与pe-sumo连接，转化到大肠杆菌dh5α的感受态细胞中，并验证试验结果的正确性。

感受态细胞的制备：具体方法参照takaracompetentcellpreparationkit(200次量)的说明书步骤。

pcr产物的胶回收：具体方法参照柱式小量胶回收试剂盒的说明书步骤。完成后取5μl回收产物在含有eb的2％agarosegel电泳检测。

将lhh1基因插入到大肠杆菌表达载体的多克隆位点，构建得到lhh1重组质粒：将lhh1基因和pe-sumo质粒用bsai和hindiii双酶切后，经t4dna连接酶16℃水浴过夜连接，转化大肠杆菌dh5α，在含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基平板上，培养12h后挑取单克隆，提取质粒用bsai和hindiii双酶切和pcr验证，琼脂糖凝胶电泳检测有48bplhh1目的片段的重组质粒经测序鉴定正确后，命名为pe-sumo-lhh1。

表1构建质粒所需连接体系

(2)将lhh1重组质粒转化到大肠杆菌rosetta(de3)plyss，得到lhh1重组大肠杆菌。

①感受态细胞的制备

具体方法参照takaracompetentcellpreparationkit(200次量)的说明书步骤。

②将重组质粒转化到宿主菌

将-80℃保存的100μl大肠杆菌感受态细胞rosetta(de3)plyss于冰中融化10min，放入新离心管后与过夜反应的重组质粒1μl混合，冰中放置30min。42℃加热90s，再在冰中放置1min。加入900μl37℃预热的lb培养基，37℃震荡60min。在含有50μg/ml卡那霉素的琼脂平板培养基上培养过夜直至形成单菌落。同时，将空载体转化到大肠杆菌rosetta(de3)plyss感受态细胞中做阴性对照。挑选白色菌落，使用pcr方法和双酶切方法进行鉴定，并送华大基因公司测序。测序结果使用ncbiblast与所设计的基因进行比对。

构建抗菌肽表达质粒pe-sumo-lhh1并测序鉴定，构建基因工程菌株pe-sumo-ea-lhh1/rosetta(de3)plyss并测序鉴定，所述测序鉴定为：aggtgatgatgatgataaagcgtttgccttaatcgcaggcgcgttatatcgaatatttcatcgtcgttaatgaaagct，测序结果使用ncbiblast与所设计的基因进行对比，选取两者结果一致的重组菌为测序结果正确的重组菌。

实施例3

抗菌肽lhh1融合蛋白的诱导表达

将测序结果正确的重组菌和含有空载体的对照菌按1％的接种量接种于lb(卡拉霉素)液体培养基中，37℃220r/min过夜培养后，以1％接种量接种于10ml的lb(卡拉霉素)液体培养基，37℃，220r/min振荡培养至od600为0.6时，分别取1.0ml菌液作为诱导前对照(0h)，然后分别加入iptg(终浓度为100mg/ml)诱导表达，25℃继续培养，并于诱导后4h分别取1.0ml菌液，12000r/min离心1min收集菌体，进行超声裂解。超声破碎为180w，在冰水中进行20min。然后，12000r/min离心1min收集菌体裂解物，用pbs重悬后，取10ul加入1×蛋白上样缓冲液40μl，沸水浴10min后，应用sds-page技术检测目的蛋白表达情况。同时，使用bca蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。实验结果表明：sumo-ea-lhh1在重组大肠杆菌菌体裂解物中获得了高效表达，其浓度可达到78.57μg/ml。

实施例4

抗菌肽lhh1的纯化

采用ni-nta纯化sumo-ea-lhh1融合物。简单地说，澄清的上清液以1ml/min的流速流过预填充的ni-nta琼脂糖柱。然后用三倍柱体积的洗脱缓冲液(40mmtris-hcl)洗脱蛋白；500mmnacl，300mm咪唑，8mm尿素，ph8.0。收集洗脱液，通过透析除去盐。重组蛋白的表达和纯化采用16.5％的ticine-sds-page凝胶进行分析。采用bca蛋白定量试剂盒对蛋白浓度进行定量。

将sumo-lhh1融合蛋白溶解在肠激酶反应缓冲液(50mm的tris-hcl，ph8.0，1mm的cacl2，0.1％的tween-20)中。sumo-ea-lhh1融合蛋白的消化是肠激酶在37℃24h。对酶切后产物进行tricine-sds-page进行检测，同时将lhh1溶解在初始流动相(乙腈：h2o＝10：90，含0.1％三氟乙酸)中，利用反相高效液相色谱法(hplc)检测。所用柱子为c18反相色谱柱(kromasil-c18，4.6×250毫米，5.0μm)30℃。洗脱液a在水中为1％的tfa，洗脱液b在乙腈中为0.1％的tfa。试样经洗脱液b线性梯度洗脱，在25分钟内洗脱液20％～95％，恒定流速为1ml/min。检测波长为220nm。对馏分产物进行蛋白含量测定。结果表明：纯化后蛋白浓度为8.375μg/ml。

实施例5

抗菌肽lhh1的质谱鉴定

将纯化后的lhh1蛋白进行质谱鉴定。鉴定结果如图7：sumo标签蛋白切掉后，lhh1的分子量大小正确。

实施例6抗菌肽lhh1的抗菌抗癌活性鉴定

(1)抗菌肽lhh1的抗菌活性鉴定

采用琼脂孔穴扩散法检测目的蛋白的抗菌活性，所采用的致病菌株为金黄色葡萄球菌。将致病菌在lb固体培养基上划线培养，待长出单菌落后，于lb液体培养基中37℃220r/min振荡培养。使用平板稀释法将上述四种处于对数生长期的菌株悬浮液稀释为10⁸个/μl，取15μl与15ml的55℃lb液体培养基混匀后铺平板，待凝固后，用高压灭菌处理的打孔器(直径5mm)打孔，向每孔中分别滴加20μl液体(抑制金黄色葡萄球菌检定，1为表达纯化的lhh1；2为表达纯化后的sumo-lhh1；3为表达纯化后的sumo蛋白)。37℃在生化培养箱中培养24h后，观察抗菌肽lhh1的抑菌活性，结果如图8。同法，对多株有害菌和有益菌进行抑菌效果测定，目前得到lhh1的抗菌谱如图8。实验分析结果：lhh1对金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)等革兰阳性细菌具有较强的抑菌活性，对酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)等真菌也具有一定的抑菌活性

(2)抗菌肽lhh1的抗癌活性鉴定

采用mtt法检测lhh1的抗癌活性，方法简述如下。1×10⁴的癌细胞均匀种在96孔板上，然后，用不同浓度的lhh1培养24小时。每孔加入10μlmtt溶液，继续培养4h。弃掉上清液，每孔加入100μldmso溶液。在水平摇床上摇动10min，以溶解甲臜晶体。最后，用microplatereader(infinitem200pro，tecan，swiss)在570nm处读取吸光度。mtt结果如图10。实验结果表明：lhh1对癌细胞具有较强的抑制作用。

实施例7

抗菌肽lhh1的热稳定性

在不同温度下处理的抗菌肽lhhi，如图10所示，1为40℃，2为60℃，3为80℃，4为100℃，c为对照组(没有经过加热处理过的抗菌肽)。采用琼脂孔穴扩散法检测目的蛋白的抗菌活性，所采用的致病菌株为金黄色葡萄球菌。实验结果表明：即使在100℃处理下的lhh1，仍保持着较强的抑菌能力，可见抗菌肽lhh1热稳定性很好。

序列表

(1)抗菌肽lhh1的核苷酸序列

(2)抗菌肽lhh1的氨基酸序列

afaliagalyrifhrr

(3)表达质粒构建所用引物序列

f：tttggtctccaggtgatgatgatgataaagcgtttgccttaatcg

r：ggggggaagctttcattaacgacgatgaaata