一种耐温型酵母及其分离培养方法和应用与流程

本发明属于酿酒技术领域，具体涉及一种酵母及其分离培养方法和应用，尤其涉及一种耐温型酵母及其分离培养方法和应用。

背景技术：

白酒是中国人传承了几千年的一种酒类，也是中国人最常喝的一种酒类，对其酿造工艺的研究也非常多，酵母菌是白酒发酵过程中的主要菌群。

cn108148829a公开了一种利用基因组重组技术制备新型酿酒酵母的方法及所得新型酿酒酵母，能够制备得到乙醇耐受性优良的酵母菌株。该方案包括以酿酒酵母和耐酒精低产乙醛酵母菌株为出发菌株，利用优化的产孢条件分别诱导酿酒酵母和耐酒精低产乙醛酵母菌株形成子囊孢子；利用溶壁酶分别将酿酒酵母和耐酒精低产乙醛酵母菌株的子囊孢子中的单倍体孢子释放出来，收集单倍体孢子悬液，并将单倍体孢子从各自的单倍体孢子悬液中分离出来；将分离得到的两种单倍体孢子进行融合，于含有乙醇浓度为12％的麦汁培养基中进行培养，得到新型酿酒酵母schl1706，保藏编号为cgmccno.14231。

cn106232811a公开了一种具有发酵木糖的能力的糖发酵酿酒酵母菌株的制备方法，其中所述方法包括不同的程序步骤，包括使第一形成孢子的酿酒酵母菌株与第二酿酒酵母单倍体菌株接合；其后，筛选接合的细胞，生长此类接合的细胞，通过显微镜检查验证展现基本的形态学的接合的细胞；其后，产生接合的细胞的混合物，使混合物经受连续恒化器木质纤维素培养和获得具有发酵木糖的能力的糖发酵酿酒酵母细胞。

cn109294933a公开了一株高产乙醇的酿酒酵母yf1914菌株及其与一株高产乙酸乙酯的异常威克汉姆酵母yf1503菌株的共培养方法与应用，酿酒酵母yf1914已于2017年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为cgmccno.14827；酿酒酵母yf1914菌株的26srdnad1/d2序列与其它多株酿酒酵母的26srdnad1/d2序列相似性较高；在高粱酶解液培养基中，两酵母菌株共培养有利于提高乙酸乙酯含量；本发明所涉及的双菌共培养方法可应用于对乙酸乙酯有需求的白酒、黄酒、酱油等酿造工业中。

然而现有技术中公开的各类型酵母均没有较好的耐温性能，因此，选育出耐温性能良好且发酵优良的酵母菌，即随着发酵温度的升高或降低，酵母菌的繁殖代谢能力均不会受到抑制，其发酵性能很稳定，对提升白酒的质量有积极意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酵母及其分离培养方法和应用，尤其提供一种耐温型酵母及其分离培养方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种耐温型酵母，所述耐温型酵母命名为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)yp005a菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年2月25日，保藏编号为cgmccno.17256，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所涉及的酿酒酵母的耐温性能很好，在较低温和较高温度下均能够保持良好的发酵性能，在较低温和较高温度下其发酵过程中co2失重量均保持在较高水平，同时，该酿酒酵母在较低温和较高温度下均具有突出的产乙醇能力和酯化能力。而且该菌种能够有效提高浓香型中高温大曲的质量，从而用于浓香型白酒的生产对提高原酒的优质品率及出酒率具有重要的意义。

优选地，所述耐温型酵母是从浓香型中高温大曲中分离筛选得到的。

所述浓香型中高温大曲为江苏今世缘酒业股份有限公司生产的浓香型中高温大曲。

优选地，所述浓香型中高温大曲的主发酵时间为1-5天，例如1天、2天、3天、4天或5天等。

此处的主发酵是指曲块入曲房后，随着野生酵母、霉菌等微生物自然繁殖，品温逐渐上升，曲心温度控制在45-55℃，质量要求发酵透，外皮有白色斑点，断面无生面，且略带酸味，此阶段春秋期3-5天，夏季1-3天。

所述浓香型中高温大曲的发酵时间只有特定选择上述时间范围内，分离得到的酿酒酵母在较低温和较高温度下才能够获得良好的发酵性能稳定性。

另一方面，本发明提供一种如上所述的耐温型酵母的分离培养方法，所述分离培养方法包括如下步骤：

(1)将浓香型中高温大曲与无菌水混合后得到菌悬液；

(2)将步骤(1)得到的菌悬液稀释后于无菌改良固体培养基上进行培养，获得菌落；

(3)挑取步骤(2)中形态规则的菌落在无菌改良固体培养基上进行分离纯化，获得单个纯种菌落并筛选出所述耐温型酵母。

优选地，步骤(2)所述无菌改良固体培养基按质量百分比计包括如下组分：葡萄糖1-3％、蛋白胨1-3％、酵母膏0.5-2％、琼脂粉1-3％、大曲浸提液10-30％，其余为无菌水。

所述大曲浸提液为上述浓香型中高温大曲的浸提液。

所述葡萄糖的质量百分比可以为1％、1.5％、2％、2.5％或3％等。

所述蛋白胨的质量百分比可以为1％、1.5％、2％、2.5％或3％等。

所述酵母膏的质量百分比可以为0.5％、0.8％、1％、1.5％或2％等。

所述琼脂粉的质量百分比可以为1％、1.5％、2％、2.5％或3％等。

所述大曲浸提液的质量百分比可以为10％、15％、20％、25％或30％等。

所述无菌改良固体培养基是影响本发明所述具有优异性能酵母分离培养的关键因素之一，其组分中的葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉和大曲浸提液只有在上述数值范围内，才能配合发挥最好的效果，即菌悬液只有在上述具有特定含量配比组分的培养基中进行培养和纯化，才能使获得的酵母在较低温和较高温度下其co2失重量均保持在较高水平，同时具有突出的产乙醇能力和酯化能力。

优选地，步骤(2)所述无菌改良固体培养基按质量百分比计包括如下组分：葡萄糖2％、蛋白胨2％、酵母膏1％、琼脂粉2％、大曲浸提液20％，其余为无菌水。

优选地，步骤(2)中是将步骤(1)得到的菌悬液稀释后用滚珠法涂布于无菌改良固体培养基上进行培养。

优选地，所述培养的温度为26-30℃，例如26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等，优选28℃。

优选地，所述培养的时间为2-4天，例如48h、50h、55h、58h、60h、65h、70h、72h、80h或96h等，优选3天。

优选地，步骤(3)所述分离纯化的方法为：挑取步骤(2)中形态规则的菌落在无菌改良固体培养基上进行5-10次(例如5次、6次、7次、8次、9次或10次等)划线培养，达到分离纯化的目的。

优选地，步骤(3)所述筛选是采用26srdna序列同源性分析法进行筛选，其具体操作方法为：提取酵母的基因组，用酵母菌26srdnad1/d2片段nl1和nl4为扩增引物，从酵母的基因组dna扩增其26srdna序列，将扩增成功的pcr产物进行测序，并在ncbi数据库中进行blast序列比对。

优选地，所述筛选得到的耐温型酵母保藏于无菌改良固体斜面培养基中备用。

本发明从浓香型发酵前期的大曲中分离筛选得到酵母菌株，经过26srdna鉴定，其中本发明的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)yp005a菌株的数量最多，为优势菌群。

作为本发明的优选技术方案，所述分离培养方法包括如下步骤：

(1)将浓香型中高温大曲与无菌水混合后得到菌悬液；

(2)将步骤(1)得到的菌悬液稀释后用滚珠法涂布于无菌改良固体培养基上在26-30℃下进行培养2-4天，获得菌落；

(3)挑取步骤(2)中形态规则的菌落在无菌改良固体培养基上进行5-10次划线培养以分离纯化，获得单个纯种菌落并采用26srdna序列同源性分析法筛选出所述耐温型酵母。

再一方面，本发明提供一种如上所述的耐温型酵母在酿酒中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明所涉及的酿酒酵母的耐温性能很好，在较低温和较高温度下均能够保持良好的发酵性能，在较低温和较高温度下其发酵过程中co2失重量均保持在较高水平，同时，该酿酒酵母在较低温和较高温度下均具有突出的产乙醇能力和酯化能力。而且该菌种能够有效提高浓香型中高温大曲的质量，从而用于浓香型白酒的生产对提高原酒的优质品率及出酒率具有重要的意义。

附图说明

图1是本发明所述耐温型酵母在光学显微镜下的单细胞形态图(放大倍数10×40)；

图2是本发明所述耐温型酵母在培养基上的菌落形态图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例所涉及的玉米糖液均按如下制备方法进行制备：将玉米和水按照玉米:水＝1:3的比例进行混合并搅拌，在搅拌状态下，通入蒸汽加热至沸腾，在此条件下保持60min，冷却至60℃后加入0.2-0.3％糖化酶(5万单位)，搅拌15min，然后保温(55-62℃)糖化4h，糖化过程中每半小时搅拌一次。通蒸汽至沸腾，蒸煮20min杀菌杀酶，冷却至30℃，此时糖液糖度在12-14°bx之间。

实施例1

本实施例提供一种耐温型酵母，分离培养方法包括如下步骤：

(1)将入房当天的浓香型中高温大曲10g于装有90ml无菌水的三角瓶中，震荡30min得到菌悬液；

(2)将步骤(1)得到的菌悬液用10倍法稀释后用滚珠法涂布于无菌改良固体培养基上在28℃下进行培养3天，获得菌落；

(3)挑取步骤(2)中形态规则的菌落在无菌改良固体培养基上进行10次划线培养以分离纯化，获得单个纯种菌落，镜检确定为酵母菌，并采用26srdna序列同源性分析法筛选出酿酒酵母即本发明所述耐温型酵母，保藏于改良固体斜面备用。其中无菌改良固体培养基按质量百分比计包括如下组分：葡萄糖2％、蛋白胨2％、酵母膏1％、琼脂粉2％、大曲浸提液20％，其余为无菌水，115℃灭菌20min。

所述筛选的操作为：提取上述酵母基因组，用酵母菌26srdnad1/d2片段nl1和nl4为扩增引物，从酵母的基因组dna扩增其26srdna序列，将扩增成功的pcr产物送至上海生工进行测序，并在ncbi数据库中进行blast序列比对。其26srdna序列为：

cccaggcatgcttagtacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttaaaccggaaccaagc。

本发明所述耐温型酵母在光学显微镜下的单细胞形态图如图1所示：光学显微镜下单细胞为圆形至椭球形。本发明所述耐温型酵母在培养基上的菌落形态图如图2所示：菌落呈圆形，表面湿润，乳白色，圆锥形突起。

实施例2

本实施例提供一种耐温型酵母，分离培养方法包括如下步骤：

(1)将发酵1天的浓香型中高温大曲10g于装有90ml无菌水的三角瓶中，震荡30min得到菌悬液；

(2)将步骤(1)得到的菌悬液用10倍法稀释后用滚珠法涂布于无菌改良固体培养基上在26℃下进行培养4天，获得菌落；

(3)挑取步骤(2)中形态规则的菌落在无菌改良固体培养基上进行5次划线培养以分离纯化，获得单个纯种菌落，镜检确定为酵母菌，并采用26srdna序列同源性分析法筛选出酿酒酵母即本发明所述耐温型酵母，保藏于改良固体斜面备用。其中无菌改良固体培养基按质量百分比计包括如下组分：葡萄糖1％、蛋白胨3％、酵母膏0.5％、琼脂粉3％、大曲浸提液30％，其余为无菌水，115℃灭菌20min。

实施例3

本实施例提供一种耐温型酵母，分离培养方法包括如下步骤：

(1)将发酵5天的浓香型中高温大曲10g于装有90ml无菌水的三角瓶中，震荡30min得到菌悬液；

(2)将步骤(1)得到的菌悬液用10倍法稀释后用滚珠法涂布于无菌改良固体培养基上在30℃下进行培养2天，获得菌落；

(3)挑取步骤(2)中形态规则的菌落在无菌改良固体培养基上进行8次划线培养以分离纯化，获得单个纯种菌落，镜检确定为酵母菌，并采用26srdna序列同源性分析法筛选出酿酒酵母即本发明所述耐温型酵母，保藏于改良固体斜面备用。其中无菌改良固体培养基按质量百分比计包括如下组分：葡萄糖3％、蛋白胨1％、酵母膏2％、琼脂粉1％、大曲浸提液10％，其余为无菌水，115℃灭菌20min。

实施例4

本实施例提供一种酿酒酵母a，其分离培养方法与实施例1的区别仅在于将“取入房当天的浓香型中高温大曲”替换为“取发酵10天的浓香型中高温大曲”，其他均保持不变。

实施例5

本实施例提供一种酿酒酵母b，其分离培养方法与实施例1的区别仅在于不含有大曲浸提液，其他均保持不变。

实施例6

本实施例提供一种酿酒酵母c，其分离培养方法与实施例1的区别仅在于无菌改良固体培养基按质量百分比计包括如下组分：葡萄糖2％、蛋白胨2％、酵母膏4％、琼脂粉1％、大曲浸提液70％，其余为无菌水。其他均保持不变。

实施例7

菌种耐温性发酵性能试验

将实施例3获得的耐温型酵母yp005a、实施例4获得的酿酒酵母a、实施例5获得的酿酒酵母b、实施例6获得的酿酒酵母c与申请人自行分离的其他4株酿酒酵母ys005b、ys005c、ys005g、ys005h进行对比，将八种酿酒酵母接入到12°bx的玉米糖液培养基中，于不同温度25℃、30℃、35℃、40℃和45℃恒温培养，对比各酿酒酵母的发酵性能，分别测定各酵母的发酵力(co2失重量)、酒精度、总酸和总酯。

(1)将八种酿酒酵母接入到12°bx的玉米糖液培养基中，分别在25℃、30℃、35℃、40℃和45℃下进行恒温培养，对0-216h的发酵过程进行监测，取不同发酵时间点的样品测定其co2失重量(单位：g)。结果如表1、表2、表3、表4和表5所示(其中表1、表2、表3、表4和表5分别为25℃、30℃、35℃、40℃和45℃下发酵的情况)。

表1

表2

表3

表4

表5

由表1-表5的数据结果可知：本发明所涉及的耐温型酵母随着发酵温度的升高或降低，其均具有很好的发酵性能，因此其具有优异的耐温性能，其在25℃、30℃、35℃、40℃和45℃下均能保持高的co2失重量；而且与酿酒酵母a、b、c相比，这种优势更加明显，说明大曲的发酵时间、培养基中的大曲浸提液以及培养基中各组分配比关系对本发明酵母的耐温性能具有重要的影响。

(2)将八种酿酒酵母接入到12°bx的玉米糖液培养基中，分别在25℃、30℃、35℃、40℃和45℃下进行恒温培养48h后，分别测定每个温度下的酒精度、总酸和总酯含量。结果如表1、表2、表3、表4和表5所示(其中表1、表2、表3、表4和表5分别为25℃、30℃、35℃、40℃和45℃下发酵的情况)。

表6

表7

表8

表9

表10

由表6-表10的数据结果可知：本发明所涉及的耐温型酵母随着发酵温度的升高或降低，其均具有很好的发酵性能，因此其具有优异的耐温性能，其在25℃、30℃、35℃、40℃和45℃下均能保持高的酒精度、总酯量和co2失重量；而且与酿酒酵母a、b、c相比，其各方面性能更加优异，说明大曲的发酵时间、培养基中的大曲浸提液以及培养基中各组分配比关系对本发明酵母的耐温性能具有重要的影响。

实施例8

菌种对大曲的强化作用评价试验

本实施例评价本发明所涉及的耐温型酵母对大曲发酵力(co2失重量)的强化作用，其具体操作方法为：

(1)制作固体试管菌种：于干净试管中注入5-7ml培养基，棉塞封口，牛皮纸包扎。在0.11mpa高压条件下蒸汽杀菌30min，灭菌后解开牛皮纸，摆斜面，空白培养，移入无菌接种室，紫外灭菌20min，按无菌操作要求接入实施例3获得的耐温型酵母，32℃条件下培养3天。其中，培养基按质量百分含量计含有下述组分：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，琼脂粉2％。

(2)制作液体试管菌种：于干净试管中注入5-7ml糖度为12°bx玉米糖液培养基，棉塞封口，牛皮纸包扎。在0.11mpa高压条件下蒸汽杀菌30min，灭菌后解开牛皮纸，移入无菌接种室，紫外灭菌20min，按无菌操作要求接入上述固体试管菌种，32℃条件下培养2天。

(3)制作三角瓶菌种：所有三角瓶冲洗干净，每瓶装300ml糖度为12°bx的玉米糖液，在0.10mpa高压条件下蒸汽杀菌25min。解开牛皮纸，紫外灭菌20min，在培养基冷至33℃左右，按无菌操作要求将上述液态试管菌种接入三角瓶内。接种后的三角瓶置于摇床上恒温培养，培养温度30℃，转速200r/min，培养24h后培养完成。

(4)制作酵母罐菌种：用清水对酵母罐内部进行冲洗，使酵母罐内干净无杂物，打开底部夹层阀门，放掉夹层的水。制备玉米糖液后，接入三角瓶菌种，接种量约为2％。开启自动培养，培养24h即培养完成，形成10⁸cfu/ml的酵母液体菌剂。

(5)试验房中：将浓香型中高温大曲原料润粮粉碎后添加0.3％的上述酵母液体菌剂，进行上机压曲成型，入房培养后分别对大曲的曲皮和曲心的发酵力进行评价，取不同发酵时间点的样品测定其co2失重量(单位：g/g·48h)。结果如表11所示(对照房与试验房中操作的区别仅在于浓香型中高温大曲原料润粮粉碎后不添加0.3％的上述酵母液体菌剂，其他一致)。

表11

由表11数据结果可知：与对照房大曲培养过程中发酵力指标相比，试验房中添加0.3％酵母液体菌剂的大曲发酵力显著提高，说明了本发明所涉及的耐温型酵母能够有效提高浓香型中高温大曲的质量，从而用于浓香型白酒的生产对提高原酒的优质品率及出酒率具有重要的意义。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种耐温型酵母及其分离培养方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

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<110>江苏今世缘酒业股份有限公司

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