一株低产高级醇的异常威克汉姆酵母及其在低度米酒酿造中的应用的制作方法

本发明公开了一株低产高级醇的异常威克汉姆酵母及其在低度米酒酿造中的应用，属于酿酒工程领域。

背景技术：

高级醇是酒中重要的风味物质，主要包括正丙醇、异戊醇、异丁醇、活性戊醇、苯乙醇、酪醇、色醇和甲硫醇等，但其含量过多会对神经系统造成伤害，异戊醇和异丁醇对人体毒性最大，酒精饮料中高级醇总量应小于10g/l。高级醇主要通过酵母代谢产生，因此低产高级醇酵母的筛选和应用对提高米酒品质具有重要意义。

相关研究通过自然筛选和遗传诱变等方式获取低产高级醇酵母，目前报道的低产高级醇酵母全部为酿酒酵母。酿酒酵母作为主要酒化酵母，具有较强的乙醇产生能力，适于高度米酒的酿造。对于高品质低度米酒的酿造，需要开发相应的酵母。贵州传统米酒多用小曲作为发酵菌剂酿造而成，因此需从小曲中分离筛选除酿酒酵母外其它种类的酵母菌，通过分析相应酵母菌的高级醇产量和酒化能力，获取酿造高品质低度米酒所需的功能酵母菌。

技术实现要素：

本发明解决的第一个技术问题是提供一株低产高级醇的异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus），该菌株分离筛选自贵州传统块状小曲中，于2019年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2019412。

一种分离获取所述低产高级醇的异常威克汉姆酵母的方法，包含以下步骤：

（1）wl培养基分离与显微观察：在无菌条件下将数块完整小曲研磨成粉末，加入无菌水振荡，稀释涂布于wl培养基培养；挑出单菌落划线法纯化3-4次，记录菌落特征，同时挑取菌落制成玻片，400×显微镜下观察细胞形态特征；

（2）5.8s-its-rflp分析和26sd1/d2区测序分析鉴定所分离菌株：提取所分离纯培养的菌株的dna，进行5.8s-its-rflp分析和26sd1/d2区测序分析，通过酶切图谱比对和序列比对，确定异常威克汉姆酵母的分子特征。

筛选获得异常威克汉姆酵母的具体特征包括：wl培养基纯培养为乳白色圆球形凸起、奶油状和边缘完整；显微观察细胞呈卵圆形；5.8s-its-rflp分析获得pcr产物为650bp，haeiii酶切产物为650bp；26sd1/d2区测序分析获取564bp有效序列，通过genbank数据库的blast比对，确定其与异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）模式菌株的相似性为99%，本菌株序列已提交至genbank数据库，序列登录号为mk722475。

本发明解决的第二个技术问题是提供所述菌株在低度米酒酿造中的应用，是在米酒酿造中接种该菌株以降低米酒中高级醇的含量，所酿造米酒酒度较低（8%vol左右）。

所述接种是接种液态菌剂，所述液态菌剂是将种子液接种到无菌液体培养基中，28-30℃培养1-2d；所述米酒酿造使用糯米发酵培养基，糯米培养基是将糯米浸泡、沥干、高压灭菌、冷却后接种活化后的根霉曲制备。

本发明的有益效果：在米酒酿造过程中以液态接种的形式加入所述异常威克汉姆酵母可提高发酵速率，减少米酒中高级醇（丙醇、异丁醇、丁醇、异戊醇、己醇和β-苯乙醇）的含量，尤其减少异戊醇和异丁醇含量，对改善中国传统低度米酒的品质具有重要意义。

附图说明

图1菌株wl培养菌落特征（a）和显微观察细胞特征（b）；

图2该菌株酿造米酒发酵液中高级醇含量气相色谱检测图。

具体实施方式

实施例1异常威克汉姆酵母ctccno:m2019412的分离方法

（1）wl培养基分离与显微观察：在无菌条件下将数块完整小曲研磨成粉末，加入无菌水150r/min振荡20min，稀释涂布于wl培养基，28-30℃培养5d。挑出单菌落划线法纯化3-4次，记录菌落特征，同时挑取菌落制成玻片，400×显微镜下观察细胞形态特征。

（2）5.8s-its-rflp分析和26sd1/d2区测序分析鉴定所分离菌株：提取所分离纯培养的菌株的dna，进行5.8s-its-rflp分析和26sd1/d2区测序分析，通过酶切图谱比对和序列比对，确定异常威克汉姆酵母的分子特征。

wl培养基纯培养为乳白色圆球形凸起、奶油状和边缘完整；显微观察细胞呈卵圆形；5.8s-its-rflp分析获得pcr产物为650bp，haeiii酶切产物为650bp；26sd1/d2区测序分析获取564bp有效序列，通过genbank数据库的blast比对，确定其与异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）模式菌株的相似性为99%，本菌株序列已提交至genbank数据库，序列登录号为mk722475。

实施例2异常威克汉姆酵母ctccno:m2019412在实验室小型米酒酿造中的高级醇产量研究

实验室小型米酒酿造时，接种该异常威克汉姆酵母菌株于糯米发酵培养基中，通过称重监测发酵终点，利用气相色谱仪检测最终发酵液中乙醇和高级醇含量，具体方案如下：

1.糯米发酵培养基的制备：准确称取100.0g糯米，加蒸馏水浸泡过夜，沥干后放入500ml三角瓶，121℃灭菌20min，冷却后添加150ml无菌水，以0.3%的比例加入活化根霉曲q303（活化方法：加少量水28℃10min）后待用，所制备发酵培养基的ph为6.5左右。

2.实验室小型米酒酿造实验：将所述异常威克汉姆酵母接入10ml的麦芽汁培养基，30℃静置培养过夜。用血球计数板计数后按照接种量1×10⁶cells/ml接种至发酵培养基。封口称重后置于30℃进行培养，每24h称重并记录，当失重小于0.2g/d认为发酵结束。

3.发酵液中乙醇和高级醇含量检测方法：取发酵液滤液100ml加100ml蒸馏水转移至500ml带玻璃珠的蒸馏瓶中蒸馏，收集100ml馏出液并密封保藏于4℃。吸取2ml米酒发酵馏出液样品，用0.22µm滤膜过滤后以甲醇为外标物检测样品中高级醇含量。气相色谱条件：色谱柱为db-ffap（30m×0.25mm，0.25µm）、进样口温度260℃、温度程序为45℃保持3min，以16℃/min速率升温到120℃保持3min，再以50℃/min速率升温至220℃保持5min、fid检测器检测温度为260℃、氢气流速30ml/min，空气流速300ml/min、进样方式为分流进样：进样量1µl，分流比为40:1。

该菌株发酵周期为17天，最终发酵液酒度为7.1%vol，高级醇总量为169.66mg/l，其中丙醇30.29mg/l、异丁醇27.14mg/l、丁醇1.36mg/l、异戊醇61.02mg/l、己醇0.9mg/l、β-苯乙醇48.94mg/l。

实施例3对照菌株葡萄牙棒孢酵母（clavisporalusitaniae）fbkl2.8013在实验室小型米酒酿造中的高级醇产量研究

实验室小型米酒酿造时，接种该葡萄牙棒孢酵母菌株于糯米发酵培养基中，通过称重监测发酵终点，利用气相色谱仪检测最终发酵液中乙醇和高级醇含量，具体方案如实施例2所述。

该葡萄牙棒孢酵母菌株发酵周期为38天，最终发酵液酒度为9.86%vol，高级醇总量为275.02mg/l，其中丙醇51.87mg/l、异丁醇51.49mg/l、丁醇0.97mg/l、异戊醇105.21mg/l、己醇4.34mg/l、β-苯乙醇61.12mg/l。相较于该对照菌株，异常威克汉姆酵母ctccno:m2019412发酵速率更快，高级醇产量更低，更适用于低度米酒酿造。