本发明属于微生物领域，具体涉及一种培养蔓枯病病原菌的培养基，以及一种促进蔓枯病病原菌产生孢子的培养方法。
背景技术：
：甘薯(dioscoreaesculenta(lour.)burkill)名红薯、番薯、红苕、白薯、地瓜等，旋花科薯蓣属缠绕草质藤本植物。原产于热带美洲，16世纪末引入中国，目前有500多种。甘薯在我国从南到北、从东到西均有分布，在四川、河南、山东、广州、安徽、浙江等地均有广泛种植，我国的甘薯种植面积约占全世界的70％，年产量在1亿吨以上，占全世界总产量的80％。我国甘薯的产量仅次于水稻、小麦和玉米，是我国重要的粮食作物，而且还是重要的休闲保健食品。薯类中除含有大量的淀粉外，还含有蛋白、维生素、纤维等其它营养物质，这些成分很多具有抗病等功效，如糖脂类物质及去氢表雄酮(dhea)还被认为具有抗癌作用，甘薯中的蛋白质也具有降低血糖等功能特性。甘薯的综合应用体现在工业加工、食品加工、保健甘薯和饲料加工等方面，既是新能源用原料，也是现代社会优质的休闲保健食品。近年来，随着生活水平的提高，人们日益关注合理的饮食结构，优质食用甘薯及甘薯粉丝、薯脯等传统加工产品作为健康饮食的重要补充，越来越受到城乡消费者的青睐，甘薯成为种植结构调整、高效农业和农产品深加工的重要组成部分，经济效益显著，发展潜力巨大。然而，毁灭性甘薯蔓枯病的发生严重制约了甘薯产业的发展。该甘薯病害主要危害其藤蔓，有时也危害叶片和薯块。田间温度适宜、湿度较高时有利于该病的发生。其病害症状主要体现为：发病初期甘薯藤蔓水渍状大斑，环境条件适宜时藤蔓叶片开始枯黄、落叶，直至整个藤蔓枯死，后期褐色干枯甘薯藤蔓上布满小黑点，即该病原分生孢子器。由于甘薯为铺地生长植株，发病初期其病害症状不明显，但后期植株藤蔓枯黄，成片枯死，甘薯产量损失极大。体外培养蔓枯病病原菌进行研究，针对该病菌筛选抗性基因或特异性药剂是防治甘薯蔓枯病经济、有效、安全的途径。目前，培养真菌的培养基有很多，例如pda培养基、燕麦培养基、玉米粉培养基、胡萝卜培养基等，然而这些培养基都不能满足使甘薯蔓枯病病原菌快速生长的要求，这已经成为该菌研究的瓶颈，导致研究该菌的致病性测定和药剂筛选试验难以完成。此外，蔓枯病病菌的分生孢子很难诱导，一些特定的培养基虽然能使菌丝体快速生长的要求可以达到，但产生的分生孢子器很少，这严重制约了蔓枯病病原菌在甘薯育种学与病理学有关研究方面的应用。因此，需要对蔓枯病病原菌传统培养基的配方和培养方式进行改进，以期获得高产量的菌丝和分生孢子。技术实现要素：作为本发明的第一方面，本发明的目的在于提供一种培养甘薯蔓枯病病菌的培养基。该培养基可以有效提供甘薯蔓枯病菌生长过程中特异性较强的碳源物质和氮源物质，以使甘薯蔓枯病病原菌在培养基中获得更快的生长速度和菌丝量。作为优选，所述培养基包括碳源、氮源、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、琼脂和水，其中，所述碳源为麦芽糖、半乳糖或核糖，所述氮源为蛋白胨或l-脯氨酸。作为优选，所述培养基中碳源的含量为20～50g/l，氮源的含量为2～5g/l，磷酸氢二钾的含量为1～4g/l，七水硫酸镁的含量为0.1～2g/l，氯化钾的含量为0.1～2g/l，硫酸亚铁的含量为0.01～1g/l，琼脂的含量为15～25g/l。作为优选，所述培养基中碳源的含量为30g/l，氮源的含量为3g/l，磷酸氢二钾的含量为1g/l，七水硫酸镁的含量为0.5g/l，氯化钾的含量为0.5g/l，硫酸亚铁的含量为0.01g/l，琼脂的含量为20g/l。作为优选，所述培养基的ph为7～8。作为优选，所述培养基的ph为7。作为优选，所述蔓枯病病原菌为甘薯蔓枯病病原菌diaporthebatatas。作为优选，所述培养基的制备方法包括：准确称取配方量的碳源，氮源，磷酸氢二钾，七水硫酸镁，氯化钾，硫酸亚铁和琼脂混合在一起，添加水至1000ml，经高温灭菌后即得。作为优选，所述高温灭菌温度为121℃，时间为30min。作为优选，本发明提供一种培养蔓枯病病原菌的方法，该方法包括：提供上述的培养基，将蔓枯病病原菌接种于所述培养基上，于恒温培养箱12h光照-12h黑暗交替培养，其中，所述光照的光源为紫外灯，所述紫外灯的波长为280nm。本发明的培养基含有可以促进甘薯蔓枯病病原菌菌丝生长的特异性糖源和氮源，甘薯蔓枯病病原菌在本发明的培养基中的生长速度远高于传统常规培养基，例如马铃薯蔗糖培养基、胡萝卜蔗糖培养基、玉米粉培养基和燕麦培养基。作为本发明的第二方面，本发明的目的在于提供一种促进蔓枯病病原菌产孢子的方法。作为优选，所述方法为：将蔓枯病病原菌接种于培养基上，于恒温培养箱光照-黑暗交替培养，即可得到孢子。作为优选，所述光照-黑暗交替培养为12h光照-12h黑暗交替培养。作为优选，所述光照的光源为紫外灯。作为优选，所述紫外灯的波长为280nm。作为优选，所述恒温培养的温度为25℃。作为优选，所述蔓枯病病原菌为甘薯蔓枯病病原菌diaporthebatatas。作为优选，所述紫外灯的功率为40w，照射距离为20cm。需要理解的是，紫外灯的功率可以为其他功率，例如20w、30w等，紫外灯的照射距离可以为15cm、25cm、30cm、40cm，或介于15-40cm之间的任意数值。该培养方法可以提高甘薯蔓枯病病原菌的产孢能力，使甘薯蔓枯病病菌的产孢量增加90％以上，通过该方法可刺激该蔓枯病病原菌快速产生大量分生孢子，满足下游试验的进行。本发明的有益效果为：(1)本发明通过对培养基中糖源和氮源的优化，提供一种适宜于甘薯蔓枯病病原菌生长的培养基，该培养基由于含有适宜于蔓枯病病原菌生长的特异性碳源和氮源使得蔓枯病病原菌的生长速度和生物量大幅度提高，培养7d后菌落直径可达到80mm以上，为该病菌的形态学结构、生物学特性、药剂防治筛选等下一步生物学实验提供了有力支撑。(2)本发明通过优化光照-黑暗培养时间、光源及光源波长，提供了一种能够促进蔓枯病病原菌产孢子的方法，本发明通过巧妙地利用紫外照射，在不影响蔓枯病病原菌菌丝体营养生长的前提下，使菌丝体由营养生长阶段过渡到生殖生长阶段，促进蔓枯病病原菌分生孢子的形成，可在7天内获得大量孢子，可充分满足病理学与育种学实际研究工作中对蔓枯病病原菌分生孢子量的需要。(3)本发明通过优化培养基配方和培养方式，促进了蔓枯病病原菌的营养生长和生殖生长，在本发明所提供的特异性培养基和培养条件下，培养7d即可使蔓枯病病原菌的菌落直径达到80mm以上，产孢量达到9×109个/ml以上。具体实施方式下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术，所有的设备和原料等均为本行业常用产品，可从市场中购得。在本发明中所述的蔓枯病病原菌为甘薯蔓枯病病原菌diaporthebatatas由浙江省农业科学院植物保护微生物研究所经济作物病害室对田间发病植株进行采样、分离并低温保存。实施例1：不同碳源、氮源的培养基对甘薯蔓枯病病原菌生长的影响在本实施例中，以察氏培养基为基础，通过改变碳源和氮源来研究不同的碳源和氮源对甘薯蔓枯病病菌的影响。察氏培养基的组分为：磷酸氢二钾1g、氯化钾为0.5g，7水硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g，硫酸亚铁为0.01g，硝酸钾3g、蔗糖30g、琼脂为20g。分别以麦芽糖、木糖、果糖、乳糖、甘露糖、可溶性淀粉、糊精、山梨醇、葡萄糖、半乳糖、海藻糖、核糖、纤维乙糖、鼠李糖代替察氏培养基中的蔗糖，保持各培养基中的氮源为硝酸钾，配制成14种不同碳源的培养基。分别以l-半胱氨酸、氨基乙酸、甘氨酸、蛋白胨、酵母提取物、nh4h2po4、(nh4)2so4、nano3、尿素、谷氨酸、l-色氨酸、l脯氨酸、酪氨酸、亮氨酸代替察氏培养基中的硝酸钾，保持各培养基中的碳源为蔗糖，配制成14种不同氮源的培养基。培养基的配制方法以及甘薯蔓枯病病原菌的培养方法如下：步骤一：分别称取磷酸氢二钾1g、氯化钾0.5g，7水硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g，硫酸亚铁为0.01g，氮源3g、糖源30g、琼脂为20g；步骤二：将称取的药品混在一起，加去离子水定容至1000ml，用1mol/lnaoh或1mol/lhcl调节至ph＝7；步骤三：将制备的培养基放置于高压灭菌锅内，121℃高压灭菌30min后取出备用；步骤四：将灭好菌的培养基在无菌环境下倒入平板中备用；步骤五：在无菌环境下，用灭过菌的镊子夹取8mm×8mm大小的甘薯蔓枯病病原菌菌饼放置于含有培养基的平板中央，用封口膜封住培养皿四周；步骤六：将封好的培养皿放置于25℃恒温培养箱内无光源暗培养，7d后测量菌丝生长直径和生物量。生长速率测定：使用十字交叉法测量不同培养基中的菌落直径；菌丝干重测定：用滤纸收集菌丝，烘干后称重。实验结果如下表1和表2所示：表1不同碳源对甘薯蔓枯病病原菌菌丝生长的影响注：r(t＝7d)为菌落面积日均增长率，+表示菌落厚度≤1mm，++表示菌落厚度＞1mm且≤2mm，+++表示菌落厚度＞2mm。表2不同氮源对甘薯蔓枯病病原菌菌丝生长的影响氮源r(t＝7d)菌落直径(mm)菌落厚度菌落色泽菌丝干重(mg)ck(硝酸钾)2.05621.5+白色0.089l-半胱氨酸3.21026.5+白色0.267氨基乙酸2.36923.0+白色0.147甘氨酸2.14721.5+白色0.075蛋白胨6.23072.4+++灰白色0.302酵母提取物6.21470.0+白色0.124nh4h2po43.14728.0+白色0.227(nh4)2so43.26931.5+白色0.236nano32.23022.0+白色0.135尿素3.01727.5++灰白色0.159谷氨酸5.84469.5+白色0.174l-色氨酸4.36937.5++灰白色0.204l-脯氨酸6.31274.6+++灰白色0.328酪氨酸6.28773.5+++灰白色0.316亮氨酸5.02765.0++灰白色0.254注：r(t＝7d)为菌落面积日均增长率，+表示菌落厚度≤1mm，++表示菌落厚度＞1mm且≤2mm，+++表示菌落厚度＞2mm。从表1和表2的数据可以看出，不同的碳源和氮源对菌丝的生长状况影响较大。对于不同的碳源而言，实验发现，甘薯蔓枯病病菌在以麦芽糖、甘露糖、半乳糖、海藻糖、核糖和纤维乙糖为糖源的培养基上生长速度相对较快，但是在甘露糖、海藻糖和纤维乙糖上的菌落相较于其他三种长势稀薄，因此菌落厚度和菌丝干重明显较低，综合而言，适宜于蔓枯病病菌菌丝生长的糖源为麦芽糖、半乳糖和核糖。对于不同的氮源而言，实验发现，蔓枯病病菌在以蛋白胨、酵母提取物、谷氨酸、l-脯氨酸和酪氨酸为氮源的培养基上生长速度相对较快，但是在酵母提取物和谷氨酸上的菌落相较于其他三种长势稀薄，因此菌落厚度和菌丝干重明显较低，综合而言，适宜于蔓枯病病菌菌丝生长的氮源为蛋白胨、l-脯氨酸和酪氨酸。实施例2：不同培养基对甘薯蔓枯病病原菌生长的影响(一)以麦芽糖为糖源，以蛋白胨为氮源的察氏培养基的配制及蔓枯病病原菌培养步骤一：分别称取磷酸氢二钾1g、氯化钾0.5g，7水硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g，硫酸亚铁为0.01g，蛋白胨3g、麦芽糖30g、琼脂为20g；步骤二：将称取的药品混在一起，加去离子水定容至1000ml，调节至ph＝7；步骤三：将制备的培养基放置于高压灭菌锅内，121℃高压灭菌30min后取出备用；步骤四：将灭好菌的培养基在无菌环境下倒入平板中备用；步骤五：在无菌环境下，用灭过菌的镊子夹取8mm×8mm大小的甘薯蔓枯病病原菌菌饼放置于含有培养基的平板中央，用封口膜封住培养皿四周；步骤六：将封好的培养皿放置于25℃恒温培养箱内无光源暗培养，7d后测量菌丝生长直径和生物量。(二)甘薯叶煎汁培养基、甘薯块煎汁培养基的配制及蔓枯病病原菌培养步骤一：分别称取甘薯茎叶200g，甘薯块茎200g，蔗糖20g两份，琼脂20g两份；步骤二：将称取的甘薯茎叶和甘薯块茎分别放入1000ml去离子水中加热熬煮30min，过滤后加去离子水定容至1000ml，然后分别加入蔗糖和琼脂，搅拌均匀，调节至ph＝7，制成甘薯叶煎汁培养基和甘薯块煎汁培养基；步骤三：将制备的甘薯叶煎汁培养基和甘薯块煎汁培养基放置于高压灭菌锅内，121℃高压灭菌30min后取出备用；步骤四：将灭好菌的培养基在无菌环境下倒入平板中备用；步骤五：在无菌环境下，用灭过菌的镊子夹取8mm×8mm大小的甘薯蔓枯病病原菌菌饼分别放置于甘薯叶煎汁培养基和甘薯块煎汁培养基平板中央，用封口膜封住培养皿四周；步骤六：将封好的培养皿放置于25℃恒温培养箱内无光源暗培养，7d后测量菌丝生长直径和生物量。(三)马铃薯蔗糖培养基、胡萝卜蔗糖培养基和马铃薯葡萄糖培养基的配制及蔓枯病病原菌培养马铃薯蔗糖培养基的组分为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g；胡萝卜蔗糖培养基的组分为：胡萝卜200g，蔗糖20g，琼脂20g；马铃薯葡萄糖培养基(pda培养基)的组分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g；上述培养基的制备方法及蔓枯病病原菌的培养方法如下：步骤一：根据培养基配方分别称取马铃薯，胡萝卜，蔗糖，葡萄糖，琼脂；步骤二：将称取的马铃薯和胡萝卜分别放入1000ml去离子水中加热熬煮30min，过滤后加去离子水定容至1000ml，然后分别加入蔗糖或葡萄糖和琼脂，搅拌均匀，调节至ph＝7，制成马铃薯蔗糖培养基、胡萝卜蔗糖培养基和马铃薯葡萄糖培养基；步骤三：将制备的马铃薯蔗糖培养基、胡萝卜蔗糖培养基和马铃薯葡萄糖培养基放置于高压灭菌锅内，121℃高压灭菌30min后取出备用；步骤四：将灭好菌的培养基在无菌环境下倒入平板中备用；步骤五：在无菌环境下，用灭过菌的镊子夹取8mm×8mm大小的甘薯蔓枯病病原菌菌饼分别放置于不同培养基平板中央，用封口膜封住培养皿四周；步骤六：将封好的培养皿放置于25℃恒温培养箱内无光源暗培养，7d后测量菌丝生长直径和生物量。生长速率测量：使用十字交叉法对5个不同的培养基中的菌丝生长速率进行测量，并测定菌丝干重，测定结果如表3所示，其中，a1：本发明的培养基；a2：甘薯叶煎汁培养基；a3：甘薯块煎汁培养基；a4：马铃薯蔗糖培养基；a5：胡萝卜蔗糖脂培养基；a6：马铃薯葡萄糖培养基，菌丝连续培养7d后测量，培养温度25℃，表中数值为3次重复平均值。表3不同培养基中甘薯蔓枯病病菌生长的影响病菌菌类形态：a1：菌落表面白色，背面灰白色，培养7d后菌落直径可达到80mm以上，菌丝呈不规则向四周蔓延生长，菌落边缘毛糙，表面粗糙粉状。a2：菌落表面白色，背面灰白色，培养7d后菌落直径可达到40mm以上，菌丝呈不规则向四周蔓延生长，菌落边缘毛糙，表面粗糙粉状。a3：菌落表面白色，背面灰白色，培养7d后菌落直径可达到35mm左右，菌丝呈不规则向四周蔓延生长，菌落边缘毛糙，表面粗糙粉状。a4：菌落表面白色，背面灰白色，培养7d后菌落直径可达到23mm以上，菌丝呈不规则向四周蔓延生长，菌落边缘毛糙，表面粗糙粉状。a5：菌落灰白色，培养7d后菌落直径可达到15mm左右，菌丝呈不规则向四周蔓延生长，菌落边缘毛糙，表面粗糙粉状。a6：菌落表面白色，背面灰白色，培养7d后菌落直径可达到20mm左右，菌丝呈不规则向四周蔓延生长，菌落边缘毛糙，表面粗糙粉状。由表1中的结果可以看出，在黑暗培养的条件下，采用以麦芽糖为糖源，以蛋白胨为氮源的培养基的菌落直径和菌丝干重最大，菌落直径均达到80mm以上，而甘薯叶煎汁培养基、甘薯块煎汁培养基、马铃薯蔗糖培养基、胡萝卜蔗糖培养基和马铃薯葡萄糖培养基中的菌丝生长速率显著低于本发明以麦芽糖为糖源，以蛋白胨为氮源的培养基，说明本发明的培养基中的麦芽糖和蛋白胨可以为作为特异的碳源物质和氮源物质来促进甘薯蔓枯病病原菌菌丝生长，并且，结合实施例1的实验结果，发现麦芽糖和蛋白胨两者配合使用的效果更好，菌落直径能达到80mm以上，具有较高的生长速度。经过方差分析，本发明的培养基培养甘薯蔓枯病病原菌的生长速度显著(p<0.01)高于其他培养基。因此，采用本发明的培养基可以显著甘薯蔓枯病病原菌的生长速度。但是采用上述6种培养基在无光源暗培养下均未得到的甘薯蔓枯病病原菌的孢子，认为暗培养不能诱导蔓枯病病原菌产孢子。实施例3：培养条件对甘薯蔓枯病病原菌产孢子的影响根据实施例2的实验结果发现暗培养不能诱导蔓枯病病原菌产孢子，虽然通过培养基的优化可以提高病原菌的生长速率，但是并不能有效促进其产孢子，因此，本发明进一步对蔓枯病病原菌的培养条件进行了优化，以期获得一种能够促进蔓枯病病原菌产孢子的方法。本实施例以几种不同的培养基为例，研究了不同培养条件下的菌丝生长状况和产孢子情况。a：优化了碳源和氮源的培养基，培养基组分为：磷酸氢二钾1g、氯化钾0.5g，7水硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g，硫酸亚铁为0.01g，蛋白胨3g、麦芽糖30g、琼脂为20g，ph＝7。b：察氏培养基，培养基组分为：磷酸氢二钾1g、氯化钾为0.5g，7水硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g，硫酸亚铁为0.01g，硝酸钾3g、蔗糖30g、琼脂为20g，ph＝7；c：甘薯叶煎汁培养基，培养基组分为：甘薯茎叶200g、蔗糖20g、琼脂20g，ph＝7；d：马铃薯葡萄糖培养基，培养基组分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，ph＝7；分别采用如下不同的方法进行培养：(1)12h紫外(280nm)照射培养和12h黑暗培养交替进行；(2)12h紫外(254nm)照射培养和12h黑暗培养交替进行；(3)12h紫外(365nm)照射培养和12h黑暗培养交替进行；(4)12h紫外(312nm)照射培养和12h黑暗培养交替进行；(5)12h日光灯照射培养和12h黑暗培养交替进行；(6)全紫外(280nm)照射培养；(7)全紫外(254nm)照射培养；(8)全紫外(365nm)照射培养；(9)全紫外(312nm)照射培养；(10)全日光灯照射培养；(11)全黑暗培养。培养七天后，检测甘薯蔓枯病病原菌的菌丝生长速率以及产孢量，实验结果如下表所示，其中，a1/b1/c1/d1：12h紫外(280nm)-12h黑暗交替；a2/b2/c2/d2：12h紫外(254nm)-12h黑暗交替；a3/b3/c3/d3：12h紫外(365nm)-12h黑暗交替；a4/b4/c4/d4：12h紫外(312nm)-12h黑暗交替；a5/b5/c5/d5：12h日光灯光照-12h黑暗交替；a6/b6/c6/d6：全紫外(280nm)照射；a7/b7/c7/d7：全紫外(254nm)照射；a8/b8/c8/d8：全紫外(365nm)照射；a9/b9/c9/d9：全紫外(312nm)照射；a10/b10/c10/d10全日光灯照射；a11/b11/c11/d11：全黑。在本实施例中，所使用的紫外灯的功率为40w，照射距离为20cm，培养温度为25℃，培养7d后，测定菌落直径和产孢量，实验结果分别如下表所示：表4不同培养条件下在优化碳源和氮源的培养基中菌丝生长速率及产孢量检测结果表5不同培养条件下在察氏培养基中菌丝生长速率及产孢量检测结果表6不同培养条件下在甘薯叶煎汁培养基中菌丝生长速率及产孢量检测结果表7不同培养条件下在马铃薯葡萄糖培养基中菌丝生长速率及产孢量检测结果从实验结果可以看出，采用光照和黑暗交替培养可以诱导蔓枯病病原菌产孢子，而采用全光照培养和全黑暗培养均不能诱导蔓枯病病原菌产孢子，说明诱导蔓枯病病原菌由营养生长向生殖生长转变的适宜培养方式为光照和黑暗交替培养，优选12h光照和12h黑暗交替进行。通过采用不同波长的紫外灯和日光灯进行照射培养发现，相较于254nm紫外照射、365nm紫外照射、312nm紫外照射和日光灯照射，280nm的紫外照射的产孢量显著高于365nm、312nm和日光照射，方差分析差异极显著，并且280nm的紫外照射的产孢量高于254nm，差异显著。而365nm的紫外灯照射、312nm紫外灯和日光灯照射刺激下产生孢子的数量远达不到致病性测定和生物学特性等试验的要求，说明280nm的紫外照射更有利于蔓枯病病原菌分生孢子的产生。通过对比不同培养条件下的菌落直径发现，全紫外(280nm)照射、全紫外(254nm)照射、全紫外(365nm)照射和全紫外(312nm)照射的菌丝生长速度显著低于光照和黑暗交替培养，而全日光灯照射培养和全黑暗培养的菌丝生长速度与光照和黑暗交替培养下的生长速度相差无几。综合上述实验可以得出如下结论：(1)光照和黑暗交替培养方式、全日光灯照射培养方式和全黑暗培养方式有利于蔓枯病病原菌的营养生长，能够促进其菌丝生长速度，而全紫外灯照射培养方式不利于蔓枯病病原菌的营养生长，菌丝生长速度较慢；(2)光照和黑暗交替培养方式有利于蔓枯病病原菌生殖生长，能够促进其产孢子，培养第7天即可获得大量的孢子，而全紫外灯照射培养方式、全日光灯照射培养方式和全黑暗培养方式不适宜于蔓枯病病原菌的生殖生长，在培养7d时还不能产生孢子；(3)280nm的紫外照射相较于254nm、365nm和312nm紫外照射，更有利于蔓枯病病原菌分生孢子的产生。(4)本发明的优化了碳源和氮源的培养基相较于其他传统培养基在培养甘薯蔓枯病病原菌7d时即可获得109的孢子，说明本发明的培养基具有优良的促进甘薯蔓枯病病原菌营养生长和生殖生长的作用。实施例4：12h光照和12h黑暗培养条件下，含有不同碳源和氮源的培养基对甘薯蔓枯病病原菌菌丝生长和产孢子的影响根据实施例3的实验结果，本实施研究了在12h紫外(280nm)照射培养和12h黑暗培养交替进行的情况下，含有不同碳源和不同氮源的培养基对甘薯蔓枯病病原菌菌丝生长和产孢子的影响，培养条件同实施例3所述。本实施例以察氏培养基为基础，基于实施例1的实验结果，通过改变察氏培养基中的碳源和氮源得到含有不同氮源和碳源的培养基，培养基的制备方法、蔓枯病病原菌的培养方法同实施例1所述。ck：察氏培养基，组分为：磷酸氢二钾1g、氯化钾为0.5g，7水硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g，硫酸亚铁为0.01g，硝酸钾3g、蔗糖30g、琼脂为20g；a1：糖源为麦芽糖，氮源为蛋白胨；a2：糖源为麦芽糖，氮源为l-脯氨酸；a3：糖源为麦芽糖，氮源为酪氨酸；a4：糖源为半乳糖，氮源为蛋白胨；a5：糖源为半乳糖，氮源为l-脯氨酸；a6：糖源为半乳糖，氮源为酪氨酸；a7：碳源为核糖，氮源为蛋白胨；a8：碳源为核糖，氮源为l-脯氨酸；a9：碳源为核糖，氮源为酪氨酸。培养7d后，测定菌落直径和产孢量，实验结果如下表所示：表812h光照/12黑暗培养下不同培养基对蔓枯病病原菌生长和产孢的影响通过测量菌丝生长状况和产孢量发现，以麦芽糖、半乳糖和核糖作为碳源，以蛋白胨和l-脯氨酸作为氮源的培养基中菌丝生长速度和产孢量显著优于ck，且优于以半乳糖或核糖作为碳源，以酪氨酸作为氮源的培养基，说明以麦芽糖、半乳糖或核糖作为碳源，以蛋白胨或l脯氨酸作为氮源的培养基是更适宜于蔓枯病病原菌进行营养生长和生殖生长的培养基。本文中用来描述方法的术语和表达方式并不是唯一不变的，并且我们没有任何意图使用这些术语和表达方式来排除描述本发明或者特征的任何相同意义的表达方式，我们认同在本发明声明的范围内的各种不同的表达方式。因此，我们认为尽管在本文中本发明已经用各种具体方案和任意的特征描述清楚地展示出来，但是改变本文中揭示的设计的表达方式还要求助于那些有经验的专业技术人士，并且这些改变要与本发明附带的声明一致。文章、专利、专利应用和所有其它文档的内容以及本文中提到的和引证的有用的电子化信息是结合在一起的，必须作为一个完整的内容来参考，发表其中任何一个部分都要特别指明这一点。申请者具有将任何和全部的这些文章、专利、专利应用或其它文档的信息和材料合并入该申请书作为本专利说明书揭示的一部分的权利。当前第1页12