一种蚯蚓生物活性黄腐酸的制备方法与流程

本发明涉及一种黄腐酸的制备方法。
背景技术：
：黄腐酸即矿源黄腐酸：是从低级别煤(泥煤、褐煤和风化煤)中提取出来的，组成结构比较单一，主要是芳香族羟基羧酸类物质，因此活性、稳定性较强，但提纯工艺复杂、成本高、且过程中伴有大量污染物产生；生化黄腐酸是植物废料通过微生物生物发酵处理后得到的腐熟有机肥中提取的，生产提纯过程中存在4个问题：(1)禽畜粪便、农作物秸秆在现有的生化法处理下，黄腐酸的生成转化率较低；(2)禽畜粪便、农作物秸秆在现有的生化法处理下产生的其他物质较多，如核酸、糖类、氨基酸、蛋白质及水溶性碳水化合物等，且所占比例较大；(3)由于这些物质的物理、化学性质均与黄腐酸相似，故混合后将黄腐酸单独富集并进行提取的成本较高；(4)现有生化法处理下，不能实现在低温条件下进行发酵处理提取生化黄腐酸的问题。综上所述，通过现有的生化法处理需要满足温度条件，且得到的黄腐酸纯度较低、稳定性较差、保质期短。中国发明专利“一种畜禽粪便制备农用生化黄腐酸的无害化提取工艺”(cn102816332b)公开了在酸溶在畜禽粪便发酵物料提取黄腐酸与黑腐酸、棕腐酸分离提纯的同时，通过fenton反应，对黄腐酸提取物料中残留的抗生素、激素、农药以及致病菌、致腐菌与寄生虫虫卵的危害进行氧化脱毒和消毒的无害化处理。虽然可获得纯度较高的农用生化黄腐酸(包括生化液体黄腐酸与生化黄腐酸精粉)，同时去除抗生素残留。但是该专利主要目的是为了去除抗生素残留，其次是为了制备生化黄腐酸，因此，其采用了以去除除抗生素残留的fenton反应技术作为其技术住路线；由于fenton反应条件要求较高，不适于在低温环境下进行，且采用酸溶液直接提取粪便中黄腐酸，必然导致黄腐酸提取率低，且污染环境的问题；该专利并没有对粪便中的黄腐酸进行富集处理以提高待提取物中黄腐酸的含量，没有过滤其它杂质的影响，进而提高提取率和纯度。中国发明专利“一种混合菌发酵生产黄腐酸的方法”(cn106960260a)公开了采用枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母菌和黑曲霉作为混合菌，利用草浆黑液的碱性环境下处理秸秆，再利用菌菇渣内的碳源来提高混合菌的生长速度，高效转化草浆黑液和秸秆的有机物制备黄腐酸。该专利是利用混合菌体快速生长繁殖，提取草浆黑液和秸秆的有机物中黄腐酸。但是，其添加了很多营养物质以提高菌体的快速生长繁殖，菌体的发酵流程复杂，且菌体直接提取草浆黑液和秸秆的有机物中黄腐酸，提取率低。其并没有解决草浆黑液和秸秆的黄腐酸含量较低，导致黄腐酸提取率低的问题。另外，该专利所提取的并非是生化黄腐酸。该专利所使用的菌并不适合于北方的低温环境发酵处理。中国发明专利“一种复合微生物菌剂及其在发酵腐植酸褐煤产生黄腐酸中的应用”(cn107815433a)公开了复合微生物菌剂发酵腐植酸褐煤产生黄腐酸的方法，虽然该专利方法与化学方法相比，不产生污染物，更加环保。但是，该专利是以褐煤为基础提取黄腐酸，所提取的并非是生化黄腐酸。而且，该菌株并不适合于低温环境发酵处理，其并不能对禽畜粪便以及农作物秸秆进行发酵处理，提取黄腐酸技术实现要素：本发明为了解决在利用禽畜粪便、农作物秸秆为原料通过生化法转化成黄腐酸并对其进行提取过程中存在的4个问题：1、禽畜粪便、农作物秸秆在现有的生化法处理下，黄腐酸的生成转化率较低；2、禽畜粪便、农作物秸秆在现有的生化法处理下产生的其他物质较多，如核酸、糖类、氨基酸、蛋白质及水溶性碳水化合物等，且所占比例较大；3、由于这些物质的物理、化学性质均与黄腐酸相似，故混合后将黄腐酸单独富集并进行提取的成本较高；4、现有生化法处理下，不能实现在低温条件下进行发酵处理提取生化黄腐酸的问题。故通过现有的生化法处理需要满足温度条件，且得到的黄腐酸纯度较低、稳定性较差、保质期短。为了解决上述问题，本发明创新性地采用蚯蚓与多种混合菌协同作用，共同提取农作物秸秆在与禽畜粪便中的黄腐酸。通过多种菌的联合发酵，并将发酵产物饲喂给蚯蚓，利用蚯蚓将分子量大、官能团数量低的腐殖酸进一步分解成分子量小、官能团数量高的黄腐酸，并吸收饵料中的蛋白质、氨基酸、糖类，去除不需要的物质。而且，通过蚯蚓吃饵料，可以有效的将农作物秸秆与禽畜粪便进行富集至蚯蚓粪便中，最终对粪便进行黄腐酸提取，可以得到芳香族羟基、羧酸类物质含量比例极高的生化黄腐酸。本发明的一种蚯蚓生物活性黄腐酸的制备方法，它是按照以下步骤实现的：一、农作物秸秆与畜禽粪便混合，进行发酵处理，发酵后的产物作为蚯蚓饵料；其中，发酵处理中按0.1％的接种量加入5种微生物菌株混合后的复合微生物菌液；所述的微生物为尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、脉孢菌(neurosporasp.)、黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和酸快生芽孢杆菌(bacillusacidiceler)；发酵处理的起始条件为碳氮比为25～30：1，湿度为45～55％，ph值为6.5～7.0，温度在8～20℃即可，发酵过程中每24小时进行一次滚筒旋转翻堆，发酵至产物的精细度≦5mm为止；二、将步骤一得到的蚯蚓饵料均匀的投放到放有蚯蚓的生物反应器内进行饲喂培养；收集步骤二饲喂蚯蚓后产生的粪便，加入到1号反应釜中，并加入去离子水，调节温度至60℃，并开启反应釜进行充分的搅拌溶解30min后，进行固液分离，得到1号腐殖酸水溶液和1号残渣；其中，去离子水与蚯蚓粪便的质量比为3：1；三、取1号腐殖酸水溶液置于2号反应釜中，并加入柠檬酸或多元有机酸，调节ph值至2后，开启反应釜搅拌反应15min后，进行固液分离，得到2号腐殖酸水溶液和2号残渣；四、将2号残渣置于1号反应釜中，与1号反应釜中的1号残渣混合，得残渣混合物；加入3倍残渣混合物质量的去离子水，并加入残渣混合物质量1/5的混合酸，开启反应釜进行充分的搅拌溶解30min后，进行固液分离，得到3号腐殖酸水溶液和3号残渣；五、将3号腐殖酸水溶液与2号腐殖酸水溶液混合，调节ph值至5.5～6.0，得到含黄腐酸的腐殖酸水溶液；六、将含黄腐酸的腐殖酸水溶液进行烘干粉碎，烘干粉碎后，得到蚯蚓生物活性黄腐酸粉剂。本发明包含以下有益效果：本发明通过对褐煤提取黄腐酸、生化法制备黄腐酸的多年研究，本发明发现黄腐酸的产生源自于植物秸秆中的木质素与含氮有机物经过复杂的生理生化反应得到的。因此，微生物的选育、蚯蚓品种的杂交选育对秸秆中木质素的降解转化起到决定性作用。本发明首先将农作物秸秆在与禽畜粪便混合，采用混合菌在低温环境下(10～15℃)进行发酵处理，通过严格控制农作物秸秆在与禽畜粪便的混合比例，，以及提升饵料中大分子腐殖酸的含量比重，经发酵处理使得发酵后的物料已经完全腐熟，其精细度可以达到5mm范围内。1吨的发酵物料，发酵后的蚯蚓饵料质量约为700公斤。其中腐殖酸质量为200公斤左右、黄腐酸质量为20～35公斤。其次，以该发酵产物作为饵料饲喂蚯蚓，蚯蚓会根据自己身体的健康情况来吃饵料，并经过其口腔内细小的牙齿进行精细的咀嚼，随后进入肠道中，通过肠道内各种酶进行全面的消化，吸收饵料中的可溶性碳水化合物、蛋白质、氨基酸、糖类，同时将分子量大、官能团数量低的腐殖酸进一步分解成分子量小、官能团数量高的黄腐酸。最终得到高品质蚯蚓粪，可提纯的黄腐酸总含量是初始物料质量的12％以上，即有机固体废弃物转化成黄腐酸的转化率达12％以上。1吨的发酵物料，发酵后的蚯蚓饵料质量为700公斤，饲喂蚯蚓后可产生400～450公斤的特定成分蚯蚓粪。其中腐殖酸质量为260～280公斤左右、黄腐酸质量为115～125公斤左右。最后，经过反应釜进行处理，期间，通过加入硝酸与硫酸的混合酸辅助处理，以降低反应的剧烈程度使其平稳，防止反应过度影响黄腐酸的产量以及对操作过程的工人及设备造成伤害，并利用混酸的平稳氧化反应将结合态的腐殖酸转化成游离态的腐殖酸，而后将其氧化分解成分子量小、官能团数量多的黄腐酸。得到含黄腐酸(90％以上)的腐殖酸水溶液，通过干燥处理，最终得到蚯蚓生物活性黄腐酸(粉剂)。最终黄腐酸的综合得率为初始物料的15％以上，即有机固体废弃物转化成黄腐酸的转化率达15％以上。1吨的发酵物料，发酵后质量为700公斤，饲喂蚯蚓后可产生400～450公斤的特定成分蚯蚓粪；再经过混合酸氧化分解、提纯、烘干后，可得到150公斤的黄腐酸粉剂。本发明的蚯蚓品种可以是常规的蚯蚓品种，或者是可以在10～35℃温度下生长的蚯蚓品种，或者是用吉尔吉斯斯坦地区优质蚯蚓品种和俄罗斯远东地区的优质蚯蚓品种通过远缘杂交选育而成，通过上述选育的蚯蚓能高效处理畜禽粪便和秸秆的混合物，处理效率是我国常用蚯蚓品种“大平二号”的2倍以上，最适工作温度为10～35℃(大平二号蚯蚓工作温度为25℃左右)，该蚯蚓为高效率、高抗逆性的特殊品种。而且，本发明所采用的菌以及蚯蚓均能适应低温环境(在10度以上)进行生长繁殖。因此，本发明的方法可以在北方的低温环境进行大面积推广应用。附图说明图1为本发明黄腐酸生产工艺流程图；图2为试验稻田照片；图3为经过生物活性黄腐酸营养液处理的稻米外观对比照片；其中，a为对照组，b为使用蚯蚓生物活性黄腐酸；图4为稻米外观品质评定结果图；其中，a为绥粳4号蚯蚓生物活性黄腐酸，b为绥粳4号对照。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式的一种蚯蚓生物活性黄腐酸的制备方法，它是按照以下步骤实现的：一、农作物秸秆与畜禽粪便混合，进行发酵处理，发酵后的产物作为蚯蚓饵料；其中，发酵处理中按0.1％的接种量加入5种微生物菌株混合后的复合微生物菌液；所述的微生物为尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、脉孢菌(neurosporasp.)、黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和酸快生芽孢杆菌(bacillusacidiceler)；发酵处理的起始条件为碳氮比为25～30：1，湿度为45～55％，ph值为6.5～7.0，温度在8～20℃即可，发酵过程中每24小时进行一次滚筒旋转翻堆，发酵至产物的精细度≦5mm为止；二、将步骤一得到的蚯蚓饵料均匀的投放到放有蚯蚓的生物反应器内进行饲喂培养；收集步骤二饲喂蚯蚓后产生的粪便，加入到1号反应釜中，并加入去离子水，调节温度至60℃，并开启反应釜进行充分的搅拌溶解30min后，进行固液分离，得到1号腐殖酸水溶液和1号残渣；其中，去离子水与蚯蚓粪便的质量比为3：1；三、取1号腐殖酸水溶液置于2号反应釜中，并加入柠檬酸或多元有机酸，调节ph值至2后，开启反应釜搅拌反应15min后，进行固液分离，得到2号腐殖酸水溶液和2号残渣；四、将2号残渣置于1号反应釜中，与1号反应釜中的1号残渣混合，得残渣混合物；加入3倍残渣混合物质量的去离子水，并加入残渣混合物质量1/5的混合酸，开启反应釜进行充分的搅拌溶解30min后，进行固液分离，得到3号腐殖酸水溶液和3号残渣；五、将3号腐殖酸水溶液与2号腐殖酸水溶液混合，调节ph值至5.5～6.0，得到含黄腐酸的腐殖酸水溶液；六、将含黄腐酸的腐殖酸水溶液进行烘干粉碎，烘干粉碎后，得到蚯蚓生物活性黄腐酸粉剂。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的畜禽粪便为猪粪、羊粪、牛粪中的一种或几种混合的粪便；农作物秸秆为玉米、水稻、大豆、小麦中的一种或几种混合的秸秆。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：猪粪与玉米秸秆的质量比为1:4，猪粪与水稻秸秆的质量比为1:3.5，猪粪与大豆秸秆的质量比为1:5，猪粪与小麦秸秆的质量比为1:6。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：牛粪与玉米秸秆的质量比为1:3，牛粪与水稻秸秆的质量比为1:2，牛粪与大豆秸秆的质量比为1:4，牛粪与小麦秸秆的质量比为1:4.5。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：羊粪与玉米秸秆的质量比为1:3，羊粪与水稻秸秆的质量比为1:2.5，羊粪与大豆秸秆的质量比为1:4.5，羊粪与小麦秸秆的质量比为1:5.5。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的蚯蚓品种是由吉尔吉斯斯坦地区的红色爱胜蚓(eiseniarosearosea)与俄罗斯远东地区的赤子爱胜蚓(eiseniafoetida)蚯蚓品种，通过杂交选育得到的。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的饲喂蚯蚓后，蚯蚓生物处理饲喂饵料的过程中，保证环境温度为10～35℃。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的饲喂蚯蚓后，蚯蚓生物处理饲喂饵料的过程中，保证环境温度为26～28℃。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是：混合酸是由硝酸与硫酸按体积比为7：3的比例混合而成。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中1立方混合好的蚯蚓饵料饲喂5～6万条蚯蚓。其它与具体实施方式一相同。本
发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。通过以下实施例验证本发明的有益效果：实施例1本实施例的蚯蚓生物活性黄腐酸的验证试验如下：1.试验设计试验于2015年在黑龙江黑河市二公河工业园区的黑龙江奥创生物科技发展有限公司的生物液体肥料研发工场进行。试验选取我国农业主要的畜禽粪便与农作物秸秆，分别是猪、牛、羊3种牲畜粪便，和玉米、水稻、大豆、小麦4种粮食作物秸秆。试验设计了3种粪便与4种秸秆进行排列组合式的处理，同时根据有机肥生物发酵最佳碳氮比来设计不同物料的配比处理，合计12种处理，分别记为a1、a2、a3、a4、b1、b2、b3、b4、c1、c2、c3、c4，详见下表1。表1不同粪便与秸秆的物料配比(碳氮比：30/1)2.微生物发酵发酵堆垛长约800cm，宽约300㎝，上宽约180㎝，高度约150㎝，条垛底部中间设宽度40㎝、深度15㎝的通风槽。按物料体积分层堆积成条垛，共分5层，在每层之间洒上蚯蚓协同微生物发酵菌剂【尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、脉孢菌(neurosporasp.)、黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、酸快生芽孢杆菌(bacillusacidiceler)】(用量2kg/1000kg湿物料)并与物料拌匀。每个试验处理物料总干重为10000kg，堆积时将物料水分调控在65％左右，分别在堆制3d、7d和10d时进行翻堆，合计3次翻堆，发酵总时间为10day。12个处理采用长条垛型有氧堆积发酵，不设重复。发酵结束后利用五点取样法采集各处理充分发酵有机肥3kg，充分拌匀后利用四分法取样1kg用于腐殖酸、黄腐酸含量检测。(12个处理的第一批检测)3.蚯蚓生物处理将发酵后的12个处理的蚯蚓饵料分别均匀的投放到放有自主培育的蚯蚓品种的小型生物反应器内进行饲喂培养，保证反应器中的蚯蚓达到最佳密度(5.5万条/m3)，并持续处理72个小时(蚯蚓处理的最佳周期“72h”)。而后将蚯蚓与处理后的特定成分蚯蚓粪进行滚筒式筛分，得到蚯蚓与蚯蚓粪，利用五点取样法采集各处理充分发酵有机肥3kg，充分拌匀后利用四分法取样1kg用于腐殖酸、黄腐酸含量检测。(12个处理的第二批检测)4.黄腐酸的提纯(1)将12个经过微生物发酵、蚯蚓生物处理后的蚯蚓粪分别取样100g放入磁力搅拌器中，同时加入500ml的去离子水搅拌均匀后，加入柠檬酸，调节ph值至2，开启搅拌器搅拌10～15min后，进行固液分离；(2)将溶液导入空白烧杯中放置，沉淀的残渣留在搅拌器中，加入250ml的去离子水，同时加入5ml的混合酸(硝酸：硫酸＝7：3)，开启搅拌器进行充分的搅拌溶解30min后，进行固液分离，将新分离出来的溶液与(1)放置的溶液混合，得到黄腐酸水溶液；(3)将黄腐酸水溶液中加入适量氢氧化钾调节ph值至5.5～6.0，并将溶液烘干成粉末，得到黄腐酸粉剂；12个处理均按照上诉3个步骤操作，得到12份质量不同的黄腐酸粉剂。(12个处理的第三批检测)5.腐殖酸、黄腐酸含量化验腐殖酸含量的检测按照nyt1971—2010执行；黄腐酸含量的检测按照hg/t3276—2012执行。(1)化验12个处理中腐殖酸、黄腐酸含量，第一批化验对象为微生物发酵后的12个处理，化验结果如下表2所示：表212个处理中腐殖酸、黄腐酸含量(第一批次)单位：g/kg(2)化验12个处理中腐殖酸、黄腐酸含量，第二批化验对象为蚯蚓生物处理后的12个处理，化验结果如下表3所示：表312个处理中腐殖酸、黄腐酸含量(第二批次)单位：g/kg(3)12个处理经过初步提纯、沉淀残渣氧化分解再提纯后得到黄腐酸水溶液，再将水溶液烘干成粉得到黄腐酸粉剂，最终测定黄腐酸粉剂的质量，得到不同处理产生的黄腐酸粉剂的质量，进而得到不同处理的黄腐酸得率。具体数据如下表4所示：表412个处理经过提纯后的黄腐酸质量(第三批次)单位:g项目a1a2a3a4b1b2b3b4c1c2c3c4黄腐酸75.274.273.874.575.571.873.974.373.874.672.174.8*注：每一个处理所取样品质量为500g。6.结果分析通过检测数据发现，只要保证秸秆与粪便的配比混合达到最佳碳氮比，且保证微生物发酵标准化、蚯蚓生物处理标准化，不同粪便与不同秸秆的配比对黄腐酸的最终得率影响不显著。说明，通过微生物发酵与蚯蚓生物处理制备黄腐酸的方法在物料选择上较宽，没有特定物料选择的限制，因碳氮比影响着微生物发酵的效率与质量，因此需要保证发酵物料的碳氮比控制在30/1，所以碳氮比相对物料选择上更为重要。实施例2采用实施例1制备的蚯蚓生物活性黄腐酸进行农田实验，以验证实施例1制备的蚯蚓生物活性黄腐酸对大米促生长作用，以及提高产量的作用。实验对象：拜泉丰登合作社(北京鹤泉农业科技有限公司)农田。实验方法：2018年8月，对1公顷农田，喷洒1kg实施例1制备的蚯蚓生物活性黄腐酸。结果显示：经生物活性黄腐酸营养液培育的大米，有效分孽平均增加1.3个，千粒重达到32g，同比增加8％，水稻亩产量达到了1325.7斤，增产13.2％。为验其稻米的品质，将经过生物活性黄腐酸营养液处理的稻米样品与对照的稻米样品一同邮寄至农业农村部谷物检测中心进行稻米外观品质与食味品质的鉴定。结果见表5所示。表5样品检测由表5可知，经生物活性黄腐酸营养液处理的稻米样品，各项指标均超过了农业部规定的优质稻米标准，部分指标达到特优级。外观对照如图3所示。经过生物活性黄腐酸营养液处理的稻米外观品质显著提升。国际稻米外观品质的评定标准共分为“s、a、b、c、d”5个等级。如图4所示，未经过处理的稻米外观品质为d级，而经过生物活性黄腐酸营养液处理的稻米外观品质为s级，从最低的d级直接跃升到最高的s级。证明生物活性硒营养液对稻米外观品质的提升效果极其显著。当前第1页12