一种季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合抗菌材料的制备方法与流程

本发明涉及一种季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合抗菌材料的制备方法，属于抗菌材料技术领域。

背景技术：

目前有很多研究人员将两种不同类型的抗菌剂结合起来进行研究，希望得到优势互补的新型抗菌材料，使得复合抗菌材料得到了长足的发展。季铵化壳聚糖是壳聚糖季铵化改性的产物，具有良好的水溶性、生物可降解性和生物相容性，分子中带正电的氨基基团可以与带负电的细菌细胞膜相互作用，影响细胞正常的代谢活动，进而起到抗菌的作用。

呫吨酮衍生物是人们研究较多的一类天然产物，具有抗菌、抗肿瘤、抑制葡萄糖苷酶等多种生物活性，在医药化学领域具有重要意义。研究表明，呫吨酮化合物的抗菌活性与苯环上的羟基有一定的关系，且呫吨酮的苯环和细菌的dna、蛋白质等存在插入和π-π堆积作用等，也会抑制细菌的繁殖。但是，由于呫吨酮在中性水溶液以及酸性环境中的溶解性较差，抗菌效果不理想。为了解决上述问题，将呫吨酮化合物与水溶性、生物相容性良好、具有抗菌作用的高分子材料复合，是改善其水溶性、提高其抗菌性能的有效途径。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合抗菌材料的制备方法，为医药、食品、环保和纺织等领域提供一种新型的抗菌材料。

本发明提出了一种将端羧基呫吨酮与季铵化壳聚糖复合的方法，制备了季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合抗菌材料。端羧基呫吨酮是疏水性的带负电荷的化合物，季铵化壳聚糖是亲水性的聚阳离子的化合物，两者通过阴阳离子的静电作用和亲疏水作用结合，在溶液中会形成疏水端向里、亲水端向外的的自组装复合抗菌材料。它不会改变原有抗菌剂的结构，能够发挥各自的抗菌机制，从而达到协同抗菌的作用，提高抗菌性能。

本发明提供了一种季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合抗菌材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备季铵化壳聚糖：0.1mmol壳聚糖和180ml去离子水置于500ml圆底烧瓶中搅拌均匀，再加入甲酸30ml、甲醛40ml，加热到70℃回流搅拌118h。将粘性反应溶液减压蒸馏后，加入1mol/mlnaoh调节ph到12时，出现絮状沉淀，过滤，水洗后干燥，得淡黄色固体；将0.2mmol淡黄色固体溶于30ml二甲基亚砜中，升温至45℃，滴加2-5mlch3i恒温搅拌12h后，向其中加入乙醇和丙酮的混合溶液(体积比1:1)使其沉淀，所得沉淀离心、洗涤、干燥。用100ml5％-10％的nacl溶液透析24h后(透析袋的截留分子量mw＝3500)，再用去离子水透析3d，每天换两次透析液，最后冷冻干燥得季铵化壳聚糖。

(2)配制浓度为1.8-22.5mmol·l^-1的季铵化壳聚糖水溶液以及浓度为17.6-70.4mmol·l^-1的端羧基呫吨酮衍生物的二甲基亚砜溶液；并将端羧基呫吨酮衍生物的二甲基亚砜溶液和季铵化壳聚糖水溶液按照体积比1:15～1:25均匀混合，调节混合溶液ph值为4-10，冰水浴下超声15-20min后，室温下磁力搅拌器搅拌1-3h，然后将上述溶液经6000-10000r·min^-1离心分离，并用去离子水洗涤3-5次，在烘箱中干燥8-16h。

作为本发明技术方案的进一步改进，步骤(1)中，所述壳聚糖的脱乙酰度≥80％，分子量介于30kda与200kda之间。

作为本发明技术方案的进一步改进，步骤(2)中，所述的端羧基呫吨酮衍生物是具有以下结构通式i所示的化合物：

其中：r1、r2为氢原子、羟基或端基为羧基的烃基，且r1、r2至少有一个端基为羧基的烃基；r3、r4为氢原子、羟基、甲基、甲氧基、乙氧基、异戊烯基中的任意一种。

作为本发明技术方案的进一步改进，步骤(2)中，所述的端羧基呫吨酮衍生物与季铵化壳聚糖的摩尔比为1:1-1:12。

作为本发明技术方案的进一步改进，步骤(2)中，分别在不同ph条件下制备复合材料；需要调节酸性时，用盐酸、醋酸等调节ph值为4-7；需要调节碱性时，用氢氧化钠、氨水等调节ph值为7-10；中性时无需调节。

作为本发明技术方案的进一步改进，步骤(2)中，所述冰水浴下超声过程中，探头超声的功率为300-600w。

作为本发明技术方案的进一步改进，步骤(2)中，所述烘箱中干燥的温度为50-70℃。

本发明提供了采用上述方法制备的季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合抗菌材料在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中的杀菌应用。在细菌悬液浓度为10⁶cfu/ml时，所得复合材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(mic)分别为25-100μg·ml^-1和12.5-200μg·ml^-1，最小杀菌浓度(mbc)都为100-300μg·ml^-1，具有良好的抗菌效果。

本发明通过静电自组装法制备季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合抗菌材料，该方法产生的积极而有益的效果在于：本发明制备工艺简单，流程短；制备过程中季铵化壳聚糖和端羧基呫吨酮通过静电作用和亲疏水作用结合，形成新的复合抗菌材料；没有破坏它们原来的化学键，未改变原有的分子结构，因而由其结构决定的抗菌机制能得到有效协同发挥；相比季铵化壳聚糖和端羧基呫吨酮衍生物，通过该发明制备的季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合抗菌材料水溶性和抗菌性都得到有效提高。

附图说明

图1是实施例1制备的季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合纳米抗菌材料的傅里叶红外谱图。

图2是实施例1制备的季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合纳米抗菌材料的核磁氢谱。

图3是实施例1制备的季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合纳米抗菌材料的扫描电镜图。

图4是实施例1制备的复合纳米抗菌材料的水溶液静置七天后在20倍显微镜下的分散状况图片；表明复合材料在水中具有良好的分散性。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明，但不局限于以下实施例。

一种季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合抗菌材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备季铵化壳聚糖：0.1mmol壳聚糖和180ml去离子水置于500ml圆底烧瓶中搅拌均匀，再加入甲酸30ml、甲醛40ml，加热到70℃回流搅拌118h。将粘性反应溶液减压蒸馏后，加入1mol/mlnaoh调节ph到12时，出现絮状沉淀，过滤，水洗后干燥，得淡黄色固体；将0.2mmol淡黄色固体溶于30ml二甲基亚砜中，升温至45℃，滴加2-5mlch3i恒温搅拌12h后，向其中加入乙醇和丙酮的混合溶液(体积比1:1)使其沉淀，所得沉淀离心、洗涤、干燥。用100ml5％-10％的nacl溶液透析24h后(透析袋的截留分子量mw＝3500)，再用去离子水透析3d，每天换两次透析液，最后冷冻干燥得季铵化壳聚糖。

(2)配制浓度为1.8-22.5mmol·l^-1的季铵化壳聚糖水溶液以及浓度为17.6-70.4mmol·l^-1mmol·l^-1的端羧基呫吨酮衍生物的二甲基亚砜溶液；并将端羧基呫吨酮衍生物的二甲基亚砜溶液和季铵化壳聚糖水溶液按照体积比1:15～1:25均匀混合，调节混合溶液ph值为4-10，冰水浴下超声15-20min后，室温下磁力搅拌器搅拌1-3h，然后将上述溶液经6000-10000r·min^-1离心分离，并用去离子水洗涤3-5次，在烘箱中干燥8-16h。

优选地，(1)所述的壳聚糖的脱乙酰度≥80％，分子量介于30kda与200kda之间。

优选地，(2)所述的端羧基呫吨酮衍生物是具有以下结构通式i所示的化合物：

其中：

r1、r2为氢原子、羟基或端基为羧基的烃基，且r1,r2至少有一个端基为羧基的烃基；

r3、r4为氢原子、羟基、甲基、甲氧基、乙氧基、异戊烯基中的任意一种。

优选地，(2)所述的加入的端羧基呫吨酮衍生物与季铵化壳聚糖的摩尔比为1:1-1:12。

优选地，(2)所述混合溶液的ph值范围为4-10。

优选地，(2)所述探头超声的功率为300-600w。

优选地，(2)所述干燥温度为50-70℃。

实施例1

(1)制备季铵化壳聚糖：0.1mmol分子量为100kda(脱乙酰度≥90％)壳聚糖和180ml去离子水置于500ml圆底烧瓶中搅拌均匀，再加入甲酸30ml、甲醛40ml，加热到70℃回流搅拌118h。将粘性反应溶液减压蒸馏后，加入1mol/mlnaoh调节ph到12时，出现絮状沉淀，过滤，水洗后干燥，得淡黄色固体；将0.2mmol淡黄色固体溶于30ml二甲基亚砜中，升温至45℃，滴加2-5mlch3i恒温搅拌12h后，向其中加入乙醇和丙酮的混合溶液(体积比1:1)使其沉淀，所得沉淀离心、洗涤、干燥。用100ml5％-10％的nacl溶液透析24h后(透析袋的截留分子量mw＝3500)，再用去离子水透析3d，每天换两次透析液，最后冷冻干燥得季铵化壳聚糖。

(2)将浓度为35.2mmol·l^-1的端羧基呫吨酮衍生物二甲基亚砜溶液与浓度为11.1mmol·l^-1的季铵化壳聚糖水中以体积比1:19均匀混合，端羧基呫吨酮衍生物结构式如式ii所示，调节溶液的ph值为7。冰水浴下超声15-20min后，超声功率为450w，室温下磁力搅拌器搅拌2h，然后将上述溶液经8000r·min^-1离心分离，并用去离子水洗涤3-5次，在60℃烘箱中干燥8h。

本实施例所得化合物如下式ii所示：

对上述实施例1中的季铵化壳聚糖、1,3-二羟基-6-氧乙酸基呫吨酮以及制备的季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合抗菌材料进行红外光谱分析、核磁氢谱分析和扫描分析。

从图1中可以看出，季铵化壳聚糖与1,3-二羟基-6-氧乙酸基呫吨酮复合以后，复合材料中包含了季铵化壳聚糖的各官能团的吸收峰，而且原来季铵化壳聚糖在1734cm^-1处出现了羧基c＝o的伸缩振动峰，复合后红移到1771cm^-1处，1,3-二羟基-6-氧乙酸基呫吨酮在1060cm^-1处归属于c-n的伸缩振动峰蓝移到1050cm^-1处。1660cm^-1-1450cm^-1范围内出现了苯环上出现了c＝c的伸缩振动峰以及酮羰基的伸缩振动峰，可以证明季铵化壳聚糖与1,3-二羟基-6-氧乙酸基呫吨酮成功复合到一起。

从图2中可以看出，季铵化壳聚糖与1,3-二羟基-6-氧乙酸基呫吨酮复合以后，复合材料在3.0-5.5ppm处的化学位移归属于季铵化壳聚糖主链上的氢，在3.2ppm处的化学位移归属于-n⁺(ch3)3基团上甲基的氢；复合材料在化学位移在6.0～13.1ppm之间出现原来1,3-二羟基-6-氧乙酸基呫吨酮苯环上的氢，在4.7ppm附近亚甲基上氢的化学位移，在12.9ppm附近羧基上氢的化学位移消失，羧基变成了羧酸根，进一步表明季铵化壳聚糖与1,3-二羟基-6-氧乙酸基呫吨酮通过静电作用结合到一起。

从图3中可以看出，季铵化壳聚糖与1,3-二羟基-6-氧乙酸基呫吨酮复合以后，1,3-二羟基-6-氧乙酸基呫吨酮有序堆积在季铵化壳聚糖的表面。

从图4中可以看出，季铵化壳聚糖与1,3-二羟基-6-氧乙酸基呫吨酮复合以后在水中具有良好的分散性。

实施例2

(1)制备季铵化壳聚糖：0.1mmol分子量为140kda(脱乙酰度≥90％)壳聚糖和180ml去离子水置于500ml圆底烧瓶中搅拌均匀，再加入甲酸30ml、甲醛40ml，加热到70℃回流搅拌118h。将粘性反应溶液减压蒸馏后，加入1mol/mlnaoh调节ph到12时，出现絮状沉淀，过滤，水洗后干燥，得淡黄色固体；将0.2mmol淡黄色固体溶于30ml二甲基亚砜中，升温至45℃，滴加2-5mlch3i恒温搅拌12h后，向其中加入乙醇和丙酮的混合溶液(体积比1:1)使其沉淀，所得沉淀离心、洗涤、干燥。用100ml5％-10％的nacl溶液透析24h后(透析袋的截留分子量mw＝3500)，再用去离子水透析3d，每天换两次透析液，最后冷冻干燥得季铵化壳聚糖。

(2)将浓度为17.6mmol·l^-1的端羧基呫吨酮衍生物二甲基亚砜溶液与浓度为2.2mmol·l^-1的季铵化壳聚糖水中以体积比1:16均匀混合，端羧基呫吨酮衍生物结构式如式iii所示，调节溶液的ph值为7。冰水浴下超声15-20min后，超声功率为300w，室温下磁力搅拌器搅拌1h，然后将上述溶液经10000r·min^-1离心分离，并用去离子水洗涤3-5次，在50℃烘箱中干燥10h。

本实施例所得化合物如下式iii所示：

实施例3

(1)制备季铵化壳聚糖：0.1mmol分子量为50kda(80≤脱乙酰度≤85％)壳聚糖和180ml去离子水置于500ml圆底烧瓶中搅拌均匀，再加入甲酸30ml、甲醛40ml，加热到70℃回流搅拌118h。将粘性反应溶液减压蒸馏后，加入1mol/mlnaoh调节ph到12时，出现絮状沉淀，过滤，水洗后干燥，得淡黄色固体；将0.2mmol淡黄色固体溶于30ml二甲基亚砜中，升温至45℃，滴加2-5mlch3i恒温搅拌12h后，向其中加入乙醇和丙酮的混合溶液(体积比1:1)使其沉淀，所得沉淀离心、洗涤、干燥。用100ml5％-10％的nacl溶液透析24h后(透析袋的截留分子量mw＝3500)，再用去离子水透析3d，每天换两次透析液，最后冷冻干燥得季铵化壳聚糖。

(2)将浓度为17.6mmol·l^-1的端羧基呫吨酮衍生物二甲基亚砜溶液与浓度为3.9mmol·l^-1的季铵化壳聚糖水中以体积比1:18均匀混合，端羧基呫吨酮衍生物结构式如式iv所示，调节溶液的ph值为4。冰水浴下超声15-20min后，超声功率为350w，室温下磁力搅拌器搅拌2h，然后将上述溶液经9000r·min^-1离心分离，并用去离子水洗涤3-5次，在55℃烘箱中干燥12h。

本实施例所得化合物如下式iv所示：

实施例4

(1)制备季铵化壳聚糖：0.1mmol分子量为30kda(85≤脱乙酰度≤90％)壳聚糖和180ml去离子水置于500ml圆底烧瓶中搅拌均匀，再加入甲酸30ml、甲醛40ml，加热到70℃回流搅拌118h。将粘性反应溶液减压蒸馏后，加入1mol/mlnaoh调节ph到12时，出现絮状沉淀，过滤，水洗后干燥，得淡黄色固体；将0.2mmol淡黄色固体溶于30ml二甲基亚砜中，升温至45℃，滴加2-5mlch3i恒温搅拌12h后，向其中加入乙醇和丙酮的混合溶液(体积比1:1)使其沉淀，所得沉淀离心、洗涤、干燥。用100ml5％-10％的nacl溶液透析24h后(透析袋的截留分子量mw＝3500)，再用去离子水透析3d，每天换两次透析液，最后冷冻干燥得季铵化壳聚糖。

(2)将浓度为35.2mmol·l^-1的端羧基呫吨酮衍生物二甲基亚砜溶液与浓度为10.56mmol·l^-1的季铵化壳聚糖水中以体积比1:20均匀混合，端羧基呫吨酮衍生物结构式如式v所示，调节溶液的ph值为6。冰水浴下超声15-20min后，超声功率为400w，室温下磁力搅拌器搅拌3h，然后将上述溶液经7000r·min^-1离心分离，并用去离子水洗涤3-5次，在60℃烘箱中干燥16h。

本实施例所得化合物如下式v所示：

实施例5

(1)制备季铵化壳聚糖：0.1mmol分子量为50kda(85≤脱乙酰度≤90％)壳聚糖和180ml去离子水置于500ml圆底烧瓶中搅拌均匀，再加入甲酸30ml、甲醛40ml，加热到70℃回流搅拌118h。将粘性反应溶液减压蒸馏后，加入1mol/mlnaoh调节ph到12时，出现絮状沉淀，过滤，水洗后干燥，得淡黄色固体；将0.2mmol淡黄色固体溶于30ml二甲基亚砜中，升温至45℃，滴加2-5mlch3i恒温搅拌12h后，向其中加入乙醇和丙酮的混合溶液(体积比1:1)使其沉淀，所得沉淀离心、洗涤、干燥。用100ml5％-10％的nacl溶液透析24h后(透析袋的截留分子量mw＝3500)，再用去离子水透析3d，每天换两次透析液，最后冷冻干燥得季铵化壳聚糖。

(2)将浓度为35.6mmol·l^-1的端羧基呫吨酮衍生物二甲基亚砜溶液与浓度为12.95mmol·l^-1的季铵化壳聚糖水中以体积比1:22均匀混合，端羧基呫吨酮衍生物结构式如式vi所示，调节溶液的ph值为8。冰水浴下超声15-20min后，超声功率为500w，室温下磁力搅拌器搅拌1h，然后将上述溶液经10000r·min^-1离心分离，并用去离子水洗涤3-5次，在65℃烘箱中干燥10h。

本实施例所得化合物如下式vi所示：

实施例6

(1)制备季铵化壳聚糖：0.1mmol分子量为100kda(80≤脱乙酰度≤85％)壳聚糖和180ml去离子水置于500ml圆底烧瓶中搅拌均匀，再加入甲酸30ml、甲醛40ml，加热到70℃回流搅拌118h。将粘性反应溶液减压蒸馏后，加入1mol/mlnaoh调节ph到12时，出现絮状沉淀，过滤，水洗后干燥，得淡黄色固体；将0.2mmol淡黄色固体溶于30ml二甲基亚砜中，升温至45℃，滴加2-5mlch3i恒温搅拌12h后，向其中加入乙醇和丙酮的混合溶液(体积比1:1)使其沉淀，所得沉淀离心、洗涤、干燥。用100ml5％-10％的nacl溶液透析24h后(透析袋的截留分子量mw＝3500)，再用去离子水透析3d，每天换两次透析液，最后冷冻干燥得季铵化壳聚糖。

(2)将浓度为70.4mmol·l^-1的端羧基呫吨酮衍生物二甲基亚砜溶液与浓度为17.6mmol·l^-1的季铵化壳聚糖水中以体积比1:24均匀混合，端羧基呫吨酮衍生物结构式如式vii所示，调节溶液的ph值为10。冰水浴下超声15-20min后，超声功率为550w，室温下磁力搅拌器搅拌1h，然后将上述溶液经8000r·min^-1离心分离，并用去离子水洗涤3-5次，在70℃烘箱中干燥14h。

本实施例所得化合物如下式vii所示：

实施例7

(1)制备季铵化壳聚糖：0.1mmol分子量为140kda(脱乙酰度≥90％)壳聚糖和180ml去离子水置于500ml圆底烧瓶中搅拌均匀，再加入甲酸30ml、甲醛40ml，加热到70℃回流搅拌118h。将粘性反应溶液减压蒸馏后，加入1mol/mlnaoh调节ph到12时，出现絮状沉淀，过滤，水洗后干燥，得淡黄色固体；将0.2mmol淡黄色固体溶于30ml二甲基亚砜中，升温至45℃，滴加2-5mlch3i恒温搅拌12h后，向其中加入乙醇和丙酮的混合溶液(体积比1:1)使其沉淀，所得沉淀离心、洗涤、干燥。用100ml5％-10％的nacl溶液透析24h后(透析袋的截留分子量mw＝3500)，再用去离子水透析3d，每天换两次透析液，最后冷冻干燥得季铵化壳聚糖。

(2)将浓度为35.6mmol·l^-1的端羧基呫吨酮衍生物二甲基亚砜溶液与浓度为17.1mmol·l^-1的季铵化壳聚糖水中以体积比1:25均匀混合，端羧基呫吨酮衍生物结构式如式viii所示，调节溶液的ph值为12。冰水浴下超声15-20min后，超声功率为600w，室温下磁力搅拌器搅拌1h，然后将上述溶液经6000r·min^-1离心分离，并用去离子水洗涤3-5次，在60℃烘箱中干燥10h。

本实施例所得化合物如下式viii所示：

实施例8

对实施例1-7中的季铵化壳聚糖(tmc)，端羧基呫吨酮衍生物(cxan)以及制备的季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合抗菌材料(tmc-cxan)的抗菌性能进行检测，检测结果如表1和表2所示。

1.实验材料

实验所用液体培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司，实验时把季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合抗菌材料溶于水中配制成1000μg·ml^-1备用。

本实验所用的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌分别是大肠杆菌(atcc25922)和金黄色葡萄球菌(cmcc(b)26003)，它们是从上海鲁微科技有限公司购买，由液体培养基培养并稀释至浓度为1×10⁶cfu·ml^-1，由本实验室保存。

2.实验方法

取灭菌的96孔聚苯乙烯板中并排的11个孔，每个孔分别加入100μl双倍浓度的灭菌mh(b)、50μl浓度为10⁶cfu/ml的细菌悬液以及50μl不同浓度的tmc-cxan溶液。使11个孔中药物浓度依次为800、700、600、500、400、300、200、100、50、25、12.5μg·ml^-1；然后将96孔聚苯乙烯板放入37℃的恒温培养箱中培养24h，同时用酶标仪检测培养前后培养液在630nm处各孔的od值，培养前后od值没有明显变化的最低浓度即为最小抑菌浓度(mic)，然后从浓度高于mic值的各孔中各吸取40μl的培养液分别均匀涂布到mh(a)培养基平板上，放入37℃的恒温培养箱中培养18h。观察到无菌落生长的最低的tmc-cxan浓度即为最小杀菌浓度(mbc)。实验重复进行三次。cxan与tmc的测试方法与此相同。

3.实验结果

表1和表2中列出了各实施例的杀菌效果数据。

表1各实施例中的化合物对大肠杆菌的mic值和mbc值

表2各实施例中的化合物对金黄色葡萄球菌的mic值和mbc值

从表1和表2中可以看出，在实施例1-7中通过静电自组制备的季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合抗菌材料(tmc-cxan)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的mic值和mbc值相比tmc和cxan显著降低。实施例1中，tmc对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的mic都为100μg·ml^-1，mbc分别为300μg·ml^-1和200μg·ml^-1；cxan对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的mic分别为200μg·ml^-1,100μg·ml^-1，mbc分别为400μg·ml^-1,200μg·ml^-1；tmc与cxan复合以后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的mic分别为100μg·ml^-1,25μg·ml^-1，mbc分别为200μg·ml^-1,100μg·ml^-1，复合以后的mic和mbc显著降低，季铵化壳聚糖-端羧基呫吨酮复合抗菌材料具有良好的抗菌活性。