一种简易红曲菌固态分离方法与流程

本发明属于微生物分离技术领域，具体涉及一种简易红曲菌固态分离方法。

背景技术：

现有用固体培养基从混合菌中分离红曲菌的方法有稀释倒平板法，涂布平板法，平板划线法。

稀释倒平板的方法是将混合菌制成菌悬液，之后进行10倍递增稀释，再分别取不同稀释度的菌液少许，加入平皿中，倾注50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀。待琼脂凝固后，保温培养一定时间，即出现菌落。稀释度得当时，培养后在平皿上出现分散的单菌落。这些单菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。

涂布平板法是先将已熔化的培养基倾注到培养皿中，制成无菌平板，待其冷却凝固后，将少量的混合菌悬液滴加在培养基的表面，再用无菌玻璃棒将菌液均匀分散在整个培养基的表面，经培养后挑取单个菌落。

平板划线法是以接种环无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行连续划线，微生物的数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，直至微生物能一一分散开，经培养后，在平板表面得到单菌落。

以上方法是将待分离的材料直接用不同的方法进行分离处理，并没有进行微生物的富集，更没有考虑到富集培养基的优化选择，也没有考虑到在混合菌中，如果目标菌种生长较缓慢，会被优势生长的其它微生物抑制的问题，使用以上方法从混合菌红曲米中分离红曲菌时，会遇到根本不能将红曲菌分离出来的情况。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有红曲菌分离中存在的问题，提供一种简易红曲菌固态分离方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种简易红曲菌固态分离方法，包括以下步骤：培养基的制备，抑制剂的添加，富集培养，划线分离以及点种。

一种简易红曲菌固态分离方法，包括以下具体步骤：

（1）培养基的制备。由于现有的商业化脱水培养基和其它培养基很难富集红曲菌，因此，本发明自制了能够大量富集红曲菌的营养成分丰富的麦芽汁琼脂培养基。

麦芽汁琼脂培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)取大麦或小麦若干，用水洗净，浸水6—12小时，至15℃阴暗处发芽，上面盖纱布一块，每日早、中、晚淋水一次，麦芽伸长至麦粒的两倍时，即停止发芽，摊开晒干或烘干，贮存备用。2)将干麦芽磨碎成麦芽粉，按重量计，一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴中糖化3—4小时，糖化程度用碘滴定至无色为止。3)将糖化液用4—6层纱布过滤，滤液混浊不清时，用鸡蛋白澄清，具体为将一个鸡蛋清加水20ml，将鸡蛋清与水调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再次过滤。4)、将滤液稀释到5—6波美度，ph6.4，加入2%琼脂，121℃灭菌30min，制成麦芽汁琼脂培养基。

（2）抑制剂的添加：因为混合菌中，常混有细菌，酵母菌和其它的霉菌，通过在培养基中添加氯霉素抑制细菌的生长，氯霉素的加量为100单位/ml；同时在培养基中添加脱氧胆酸钠，抑制其它优势霉菌的菌丝蔓延生长。脱氧胆酸钠的加量是0.3wt%。抑制剂添加到麦芽汁琼脂培养基后进行高压蒸汽灭菌。

（3）菌种的富集。将未经处理的，混菌红曲米简单研磨至1mm的小粒，将此小粒的红曲米，取5mg的洒在已制备好的富集培养基的表面，之后置于恒温恒湿培养箱中32℃培养7天-10天，挑选有红曲菌菌落出现的平皿。

（4）划线分离

从有红曲菌菌落出现的平皿中挑取红曲菌表面的孢子进行划线分离，划线分离选用pda培养基。划线分离后，在32℃培养箱中进行培养，培养至红色菌落出现。此步划线分离必要时重复二至三次。

pda培养基制备方法如下：称取洗净去皮的马铃薯200g，切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解分装锥形瓶，121℃灭菌20分钟。

（5）点种

在划线分离至第二天开始进行观察，发现有红曲菌落出现，用接种针小心选择红曲菌点种至新的pda培养基中，即可分离出纯种的红曲菌。

本发明的优点在于：

（1）富集的方法：本发明中采用固态培养法，不是传统的液态培养法，因为红曲菌生长较其它微生物缓慢，当用液态富集时，其它优势菌生长较迅速，容易将营养成分消耗掉，不利于生长较缓慢的红曲菌生长。将红曲米简单研磨至分散的小粒，撒在富集培养基表面，因为红曲菌是丝状真菌，会将菌丝深入到米粒的内部，至于细菌，酵母菌等不具备菌丝的微生物不能够深入到米粒的内部，当将红曲米研成小粒之后，使内部的红曲菌丝暴露出来，使菌丝在落入加有抑制剂的富集培养基之后，益于吸收营养而繁殖，如果没有研成小粒，那么混菌的红曲米会被米粒表面的细菌、酵母这些具有生长优势的微生物而包裹住，没有办法吸收营养而繁殖。

（2）富集的培养基选择：本法明自制的麦芽汁琼脂培养基对红曲菌进行富集，相较于商业化脱水培养基和其它现有培养基，对红曲菌的富集效果显著。

（3）抑制剂的选择：本发明的富集培养基中添加了细菌抑制剂以及抑制其他优势霉菌菌丝蔓延的抑制剂，在菌种富集阶段减少了杂菌的干扰，提高对目的菌种的富集效果。

（4）富集培养时间相较于液体富集培养的时间更长，给予菌丝生长缓慢红曲菌足够的生长时间，利于后期菌种的分离。

（5）划线培养时选择pda培养基，因为此种培养基颜色较淡，易于红曲菌分离时，视觉上更容易分辩出红曲菌。

（6）点种，在划线分离的第二天，及时进行点种分离，会较快的发离出红曲菌。

附图说明：

图1富集培养10天后的结果。

图2第一次划线培养10天结果。

图3第二次划线培养3天结果。

图4点种培养3天结果。

图5不同培养基富集红曲菌结果。a：自制麦芽汁琼脂培养基的富集结果；b：商业化培养基的富集结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不仅限于此。

实施例1

一种简易红曲菌固态分离方法，包括以下步骤：

（1）培养基的配置。由于现有的商业化脱水培养基和其它培养基很难富集红曲菌，因此，本发明自制了能够大量富集红曲菌的营养成分丰富的麦芽汁琼脂培养基，自制培养基的优点是营养成分丰富，更利于微生物的生长。

麦芽汁琼脂培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)取大麦若干，用水洗净，浸水6小时，至15℃阴暗处发芽，上面盖纱布一块，每日早、中、晚淋水一次，麦芽伸长至麦粒的两倍时，即停止发芽，摊开晒干或烘干，贮存备用。2)将干麦芽磨碎成麦芽粉，按重量计，一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴中糖化3小时，糖化程度用碘滴定至无色为止。3)将糖化液用4层纱布过滤。滤液混浊不清时，用鸡蛋白澄清，具体为将一个鸡蛋清加水20ml，将水与鸡蛋清调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。4)将滤液稀释到5波美度，ph6.4，加入2%琼脂，121℃灭菌30min，制成麦芽汁琼脂培养基。

（2）抑制剂的添加：因为混合菌中，常混有细菌，酵母菌和其它的霉菌，通过在培养基中添加氯霉素抑制细菌的生长，氯霉素的加量为100单位/ml；同时在培养基中添加脱氧胆酸钠，抑制其它优势霉菌的菌丝蔓延生长。脱氧胆酸钠的加量是0.3wt%。抑制剂的添加至麦芽汁琼脂培养基中，之后在高压蒸汽灭菌

（3）菌种的富集。以混合菌红曲米为例，将红曲米简单研磨至1mm分散的小粒，将此小粒的红曲米取5mg洒在已制备好的富集培养基的表面，之后置于恒温恒湿培养箱中32℃培养10天，挑选有红曲菌菌落的出现平皿（见图1）。

（4）划线分离

从有红曲菌菌落出现的平皿中挑取红曲菌表面的孢子进行划线分离，划线分离选用pda培养基。划线分离后，在32℃培养箱中进行培养，培养至红色菌落出现。第一次划线分离培养10天的结果见图2；第二次划线分离培养3天的结果见图3。

pda培养基制备方法如下：称取洗净去皮的马铃薯200g，切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解分装至锥形瓶中，121℃灭菌20分钟。

（5）点种

在第二次划线分离至第二天开始进行观察，发现有红曲菌落出现，用接种针小心选择红曲菌点种至新的pda培养基中，点种培养3天结果见图4，分离出纯种的红曲菌。

实施例2

（1）培养基的配置：由于现有的商业化脱水培养基和其它培养基很难富集红曲菌，因此，本发明自制了能够大量富集红曲菌的营养成分丰富的麦芽汁琼脂培养基。

麦芽汁琼脂培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)取小麦若干，用水洗净，浸水12小时，至15℃阴暗处发芽，上面盖纱布一块，每日早、中、晚淋水一次，麦芽伸长至麦粒的两倍时，即停止发芽，摊开晒干或烘干，贮存备用。2)将干麦芽磨碎成麦芽粉，按重量计，一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴中糖化4小时，糖化程度用碘滴定至无色为止。3)将糖化液用6层纱布过滤。滤液混浊不清时，用鸡蛋白澄清，具体为将一个鸡蛋清加水20ml，将鸡蛋清与水调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。4)、将滤液稀释到6波美度，ph6.4，加入2%琼脂，121℃灭菌30min，制成麦芽汁琼脂培养基。

（2）抑制剂的添加：因为混合菌中，常混有细菌，酵母菌和其它的霉菌，通过在培养基中添加氯霉素抑制细菌的生长，氯霉素的加量为100单位/ml；同时在培养基中添加脱氧胆酸钠，抑制其它优势霉菌的菌丝蔓延生长。脱氧胆酸钠的加量是0.3wt%。抑制剂的添加到麦芽汁琼脂培养基中，之后在高压蒸汽灭菌

（3）菌种的富集。以混合菌红曲米为例，将红曲米简单研磨至1mm分散的小粒，不要研成粉末，将此小粒的红曲米取5mg洒在已制备好的富集培养基的表面，之后置于恒温恒湿培养箱中32℃培养10天，挑选有红曲菌菌落出现的平皿。

（4）划线分离

从有红曲菌菌落出现的平皿中挑取红曲菌表面的孢子进行划线分离，划线分离选用pda培养基。划线分离后，在32℃培养箱中进行培养，培养至红色菌落出现，此步划线分离必要时重复三次。

pda培养基制备方法如下：称取洗净去皮的马铃薯200g，切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解分装锥形瓶，121℃灭菌20分钟。

（5）点种

在划线分离至第二天开始进行观察，发现有红曲菌落出现，用接种针小心选择红曲菌点种至新的pda培养基中，即可分离出纯种的红曲菌。

对比例1

以商业化的培养基替换自制的麦芽汁琼脂培养基，添加与实施例1相同比例的氯霉素及脱氧胆酸钠，富集培养不能富集到红曲菌株。自制培养基和商业化培养基的富集结果见图5。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。