本发明涉及用于制备细粒棘球蚴病诊断试剂的多肽及其应用。
背景技术：
：细粒棘球绦虫(echinococcusgranulosus)又称包生绦虫。成虫寄生于犬科食肉动物，而幼虫(棘球蚴)主要寄生于人和牛、绵羊等草食动物，引起一种严重的人兽共患病，称为细粒棘球蚴病。羊采食时吃到犬排出的细粒棘球绦虫的孕卵节片或虫卵后，卵内的六钩蚴在消化道逸出，钻入肠壁，随血液和淋巴散布到身体各处发育成成虫，引起包虫病。羊患包虫病后一般没有很好的治疗办法，发现感染后扑杀、尸体做无害化处理为主，并防止脏器被犬吃掉导致成虫寄生于终末宿主污染周围环境。所以及时的诊断检测扑杀阳性动物是防控该病传染给人的有效手段。国内外学者对筛选细粒棘球蚴的优势诊断抗原做了大量的研究，目前主要研究焦点为抗原b(agb)。抗原b是包虫病囊液中的一种分子量为120～160kda的耐热脂蛋白,具有高度免疫原性,并被认为是目前用于免疫诊断试验中具有较高敏感性和特异性的抗原之一。agb是由数个约8kda的亚基组成的多聚体,免疫印迹显示其最小亚基(8kda)是最具有诊断价值的靶抗原。编码agb基因是一个基因家族，含有agb1、agb2、agb3、agb4基因。江莉等利用pet32a载体、pet28a载体和pgex4t-1载体，表达我国细粒棘球绦虫分离株(新疆源和甘肃源)中克隆的agb1和agb2两个亚单位基因,结果表明agb1在pet28a载体中不能表达,而在pgex4t-1和pet32a中可表达,但表达蛋白均为不溶性。agb2在3种载体中均能表达,表达蛋白的溶解性依次为:不溶-部分可溶-可溶。在我国包虫病主要分为细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病两种类型。我国主要存在由细粒棘球绦虫的幼虫引起的囊型包虫病(细粒棘球蚴病)和多房棘球绦虫的幼虫引起泡型包虫病(多房棘球蚴病)，多房棘球蚴病危害严重，致死率高，又被称为“虫癌”。由于细粒棘球蚴病具有与多房棘球蚴病相似的临床症状，因此需借助实验室检测技术对该病进行确诊。技术实现要素：本发明所要解决的一个技术问题是如何提高细粒棘球蚴抗体检测的特异性，从而更准确地诊断细粒棘球蚴病。为了解决上述技术问题，本发明提供了用于制备细粒棘球蚴抗体(细粒棘球蚴感染抗体或细粒棘球蚴病抗体)检测试剂的成套多肽或用于制备细粒棘球蚴病诊断试剂的成套多肽。本发明所提供的用于制备细粒棘球蚴抗体(细粒棘球蚴感染抗体或细粒棘球蚴病抗体)检测试剂的成套多肽或用于制备细粒棘球蚴病诊断试剂的成套多肽均由eb2-3和eb3-3组成；所述eb2-3是p11、p12或p13的多肽：p11、氨基酸序列为序列表中序列1的多肽，p12、氨基酸序列为序列表中序列1的第2-17位的多肽，p13、在p12的多肽的氨基末端或羧基末端连接氨基酸残基以与载体蛋白偶联得到的多肽；所述eb3-3是p21、p22或p23的多肽：p21、氨基酸序列为序列表中序列2的多肽，p22、氨基酸序列为序列表中序列2的第2-14位的多肽，p23、在p22的多肽的氨基末端或羧基末端连接氨基酸残基以与载体蛋白偶联得到的多肽。上述成套多肽中，序列表中序列1由17个氨基酸残基组成，第1位的半胱氨酸残基是为了与载体蛋白连接，在细粒棘球蚴的agb2的抗原表位多肽的氨基末端添加的连接臂，第2-17位来自细粒棘球蚴的agb2；序列表中序列2由14个氨基酸残基组成，第1位的半胱氨酸残基是为了与载体蛋白连接，在细粒棘球蚴的agb3的抗原表位多肽的氨基末端添加的连接臂，第2-14位来自细粒棘球蚴的agb3。上述成套多肽中，所述eb2-3和所述eb3-3的质量比本领域技术人员可根据对细粒棘球蚴抗体检测效果确定，如可为4:6。上述成套多肽在制备检测细粒棘球蚴抗体(细粒棘球蚴感染抗体或细粒棘球蚴病抗体)的试剂中的应用也属于本发明的保护范围。上述成套多肽在制备细粒棘球蚴病诊断抗原中的应用也属于本发明的保护范围。为了解决上述技术问题，本发明提供了检测细粒棘球蚴抗体(细粒棘球蚴感染抗体或细粒棘球蚴病抗体)的试剂或诊断细粒棘球蚴病的试剂。本发明所提供的检测细粒棘球蚴抗体(细粒棘球蚴感染抗体或细粒棘球蚴病抗体)的试剂或诊断细粒棘球蚴病的试剂均由eb2-3偶联物和eb3-3偶联物组成；所述eb2-3偶联物是上述eb2-3和载体蛋白偶联得到的完全抗原；所述eb3-3偶联物是由上述eb3-3和载体蛋白偶联得到的完全抗原。上述试剂中，所述eb2-3偶联物和所述eb3-3偶联物的质量比本领域技术人员可根据对细粒棘球蚴抗体检测效果确定，如可为4:6。上述试剂中，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、鼠血清白蛋白、甲状腺球蛋白或兔血清白蛋白。上述eb2-3或上述eb3-3也属于本发明的保护范围。上述eb2-3或上述eb3-3在制备检测细粒棘球蚴抗体(细粒棘球蚴感染抗体或细粒棘球蚴病抗体)的试剂中的应用也属于本发明的保护范围。上述eb2-3或上述eb3-3在制备细粒棘球蚴病诊断抗原中的应用也属于本发明的保护范围。为了解决上述技术问题，本发明提供了完全抗原。本发明所提供的完全抗原是上述eb2-3偶联物或上述eb3-3偶联物。上述完全抗原在制备检测细粒棘球蚴抗体的试剂中的应用也属于本发明的保护范围。上述应用中，所述检测细粒棘球蚴抗体(细粒棘球蚴感染抗体或细粒棘球蚴病抗体)的试剂和所述细粒棘球蚴病诊断抗原均可由所述eb2-3偶联物和/或所述eb3-3偶联物组成。实验证明，分别用bsa-eb2-3和/或bsa-eb3-3作为包被抗原制备的检测血清中的细粒棘球蚴抗体的试剂盒对羊细粒棘球蚴病阴性血清、羊多房棘球蚴病阳性血清和羊囊尾蚴病阳性血清均无交叉反应，以bsa-eb2-3和bsa-eb3-3作为包被抗原的本发明trfia方法1与临床诊断的总符合率为91.67％(阳性符合率为91.11％，阴性符合率为92.22％)，以bsa-eb2-3作为包被抗原的本发明trfia方法2与羊细粒棘球蚴血清中和试验方法的总符合率为89.44％(阳性符合率为84.44％，阴性符合率为94.44％)，以bsa-eb3-3作为包被抗原的本发明trfia方法3与羊细粒棘球蚴血清中和试验方法的总符合率为87.22％(阳性符合率为81.11％，阴性符合率为93.33％)。本发明以bsa-eb2-3和/或bsa-eb3-3作为包被原制备的抗体检测试剂盒特异性强、敏感性高，准确性高，操作简单、快速，适用于基层各级兽医部门和出入境检验检疫局对细粒棘球蚴感染血清抗体的快速大量筛选检测。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本
技术领域：
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的铕标记元素(eu3+)为广州达瑞生物技术股份有限公司产品,兔抗山羊二抗为sigma公司产品,auto-delfia1235时间分辨荧光检测仪购自perkinelmer股份有限公司，酶标板，购自美国costar公司。下述实施例中，临床诊断细粒棘球蚴病阳性血清、多房棘球蚴病阳性血清、细粒棘球蚴病阴性血清和多房棘球蚴病阴性血清的方法如下：屠宰场解剖日常屠宰羊只，发现胴体器官有细粒棘球蚴病包囊病变(囊型棘球蚴病变)的羊只确定为感染细粒棘球蚴病的羊只，该羊的血清确诊为细粒棘球蚴病阳性血清，相反为阴性血清；发现胴体器官有多房棘球蚴病包囊病变(泡型棘球蚴病变)的羊只确定为感染多房棘球蚴病的羊只，该羊的血清确诊为多房棘球蚴病阳性血清，相反为阴性血清；发现胴体器官有囊尾蚴病变的羊只确定为感染囊尾蚴病的羊只，该羊的血清确诊为囊尾蚴阳性血清，相反为阴性血清。实施例1、时间分辨荧光免疫分析(trfia)检测细粒棘球蚴感染抗体本发明人在研发过程中，试图按照如下文献的方法利用pet32a(+)、pet28a(+)和pgex4t-1在大肠杆菌bl21(de3)中表达细粒棘球蚴的agb1、agb2、agb3、agb4，均没有表达出目的蛋白。发明人从细粒棘球蚴的agb1、agb2、agb3、agb4中各选择了4个优势抗原表位多肽(eb1-1、eb1-2、eb1-3、eb2-1、eb2-2、eb2-3、eb3-1、eb3-2、eb3-3、eb4-1、eb4-2和eb4-3)，分别与bsa偶联后作为包被抗原建立了时间分辨荧光免疫分析方法，特异性得到了显著提高，可以有效区分细粒棘球蚴阳性血清与多房棘球蚴阳性血清、囊尾蚴阳性血清。将eb2-3与bsa的偶联物(bsa-eb2-3)和eb3-3与bsa的偶联物(bsa-eb3-3)按照4:6的质量比混合得到的混合完全抗原作为包被抗原建立的时间分辨荧光免疫分析方法，特异性得到了显著提高，可以有效区分细粒棘球蚴阳性血清与多房棘球蚴阳性血清、囊尾蚴阳性血清，敏感性也显著提高。具体的实验方法如下：1包括抗原的制备本实施例制备了以下13种包被抗原：1)bsa-eb2-3+bsa-eb3-3，2)bsa-eb2-3(eb2-3偶联物)，3)bsa-eb3-3(eb3-3偶联物)，4)bsa-eb1-1(eb1-1偶联物)，5)bsa-eb1-2(eb1-2偶联物)，6)bsa-eb1-3(eb1-3偶联物)，7)bsa-eb2-1(eb2-1偶联物)，8)bsa-eb2-2(eb2-2偶联物)，9)bsa-eb3-1(eb3-1偶联物)，10)bsa-eb3-2(eb3-2偶联物)，11)bsa-eb4-1(eb4-1偶联物)，12)bsa-eb4-2(eb4-2偶联物)，13)bsa-eb4-3(eb4-3偶联物)。1.1优势抗原表位多肽从细粒棘球蚴的agb1、agb2、agb3、agb4蛋白中选择优势抗原表位多肽，由北京六合华大基因科技有限公司合成c末端或n末端连接有半胱氨酸的多肽eb1-1、eb1-2、eb1-3、eb2-1、eb2-2、eb2-3、eb3-1、eb3-2、eb3-3、eb4-1、eb4-2和eb4-3(表1)。纯度大于95％，冻干保存。表1.多肽名称序列eb1-1ddgltstsrsvmkmfg*ceb1-2c*kyfferdplgqkvveb1-3c*eevfqllrkklrmaeb2-1kdepkahmgqv*ceb2-2c*elrdffrndplrqreb2-3c*kkyvknlveekdddskeb3-1dddevtktkkgvmkais*ceb3-2c*khffqsdplgkklveb3-3c*lkeyvrklvkedeeb4-1c*kaeperckclimrklgeb4-2c*irdffrsdplgqkleb4-3c*kyvkdlleeededdlk注：序列中的*c或c*为半胱氨酸残基，是为了与载体蛋白连接，在细粒棘球蚴的agb的抗原表位多肽的氨基末端或羧基末端添加的连接臂；其它氨基酸残基来源于细粒棘球蚴的agb的抗原。1.213种包被抗原的制备将eb1-1、eb1-2、eb1-3、eb2-1、eb2-2、eb2-3、eb3-1、eb3-2、eb3-3、eb4-1、eb4-2和eb4-3这12种多肽分别与bsa偶联得到12种包被抗原:2)bsa-eb2-3(bsa与eb2-3的偶联物)，3)bsa-eb3-3(bsa与eb3-3的偶联物)，4)bsa-eb1-1(bsa与eb1-1的偶联物)，5)bsa-eb1-2(bsa与eb1-2的偶联物)，6)bsa-eb1-3(bsa与eb1-3的偶联物)，7)bsa-eb2-1(bsa与eb2-1的偶联物)，8)bsa-eb2-2(bsa与eb2-2的偶联物)，9)bsa-eb3-1(bsa与eb3-1的偶联物)，10)bsa-eb3-2(bsa与eb3-2的偶联物)，11)bsa-eb4-1(bsa与eb4-1的偶联物)，12)bsa-eb4-2(bsa与eb4-2的偶联物)，13)bsa-eb4-3(bsa与eb4-3的偶联物)。具体制备方法如下：使用美国kpl公司生产的bsa标签偶联试剂盒(readilinktmbsaconjugationkit)货号：5501，批号：148045，按照说明书要求对合成的多肽片段进行偶联，制备成上述12种包被抗原。将bsa-eb2-3和bsa-eb3-3按照4:6的质量比混合得到包被抗原bsa-eb2-3+bsa-eb3-3。2利用诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒进行时间分辨荧光免疫分析本实施例提供了13种诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒。这13种试剂盒均包括包被抗原、铕标记二抗、包被缓冲液、洗涤液、二抗稀释液。这13种试剂盒的区别仅在于包被抗原不同，其它组分完全相同。这13种试剂盒分别为包被抗原为步骤1的bsa-eb2-3+bsa-eb3-3的诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，以下简称本发明的试剂盒1；包被抗原为步骤1的bsa-eb2-3的诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，以下简称本发明的试剂盒2；包被抗原为步骤1的bsa-eb3-3的诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，以下简称本发明的试剂盒3；包被抗原为步骤1的bsa-eb1-1的诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒1；包被抗原为步骤1的bsa-eb1-2的诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒2；包被抗原为步骤1的bsa-eb1-3的诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒3；包被抗原为步骤1的bsa-eb2-1的诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒4；包被抗原为步骤1的bsa-eb2-2的诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒5；包被抗原为步骤1的bsa-eb3-1的诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒6；包被抗原为步骤1的bsa-eb3-2的诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒7；包被抗原为步骤1的bsa-eb4-1的诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒8；包被抗原为步骤1的bsa-eb4-2的诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒9；包被抗原为步骤1的bsa-eb4-3的诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，以下简称对照试剂盒10。按照如下文献中的方法制备铕标记的兔抗山羊二抗(简称铕标记二抗)：eb病毒核抗原(na1)iga抗体和zta蛋白iga抗体时间分辨荧光免疫分析检测试剂的研制.南方医科大学2012级硕士学位论文。包被缓冲液：0.05mol/l的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(ph9.6)，溶剂为水，溶质及其浓度如下：na2co31.59g/l和nahco32.93g/l。洗涤液为pbst洗涤液。pbst洗涤液按照如下方法配制：在浓度为0.01m，ph值为7.4的pbs缓冲液中加入吐温20至吐温20的含量为5ml/l，得到pbst洗涤液。封闭液为1％bsa封闭液。1％bsa封闭液按照如下方法配制：在浓度为0.01m，ph值为7.4的pbs缓冲液中加10％的bsa溶液，至bsa的体积百分含量为1％，得到1％bsa封闭液。二抗稀释液：在浓度为0.01m，ph值为7.4的pbs缓冲液中加入bsa至bsa的含量为1％(体积百分含量)，得到二抗稀释液。其中，浓度为0.01m，ph值为7.4的pbs缓冲液的配制：8.5gnacl、0.2gkcl、2.9gna2hpo4·12h2o、0.59gnah2po4·2h2o，1l去离子水。2.1利用本发明的试剂盒1，经过优化实验建立了以bsa-eb2-3+bsa-eb3-3为包被抗原的时间分辨荧光免疫分析方法(以下简称本发明trfia方法1),具体如下：2.1.1包被：用包被缓冲液稀释步骤1中的bsa-eb2-3+bsa-eb3-3至bsa-eb2-3+bsa-eb3-3的浓度(bsa-eb2-3+bsa-eb3-3的总质量浓度)为1.0μg/ml，得到包被抗原溶液，用该包被抗原溶液包被实验孔，100μl/孔加至酶标板，4℃孵育16h。2.1.2洗涤：倾去孔内包被原溶液，用pbst洗涤液洗涤5次，每次3min；拍干。2.1.3封闭：加入1％bsa封闭液，250μl/孔，37℃孵育2h。2.1.4加样：2.1.4.1样品孔用包被缓冲液将羊细粒棘球蚴病阳性血清稀释50倍，得到待测血清。将100μl待测血清加到酶标板上，37℃反应1h，倾去孔内液体，然后用洗涤液洗涤5次。羊细粒棘球蚴病阳性血清是采用上述临床诊断为患有羊细粒棘球蚴病的羊血清。2.1.4.2空白对照孔与2.1.4.1的区别仅在于将待测血清替换为等体积的高纯水，其它步骤不变。2.1.5加铕元素标二抗：加入用二抗稀释液进行1:50000稀释的铕标记兔抗山羊igg，100μl/孔，37℃30min。2.1.6显色：加入tmb，100μl/孔，反应10min。2.1.7终止：加入0.2mol/lh2so4溶液终止反应，100μl/孔。2.1.8测定：用时间分辨荧光免疫分析仪读取各孔的荧光检测值。2.1.9阴阳性临界值的确定将400份羊细粒棘球蚴病阴性血清采用步骤2.1.1-2.1.8(将2.1.4.1中的羊细粒棘球蚴病阳性血清分别替换为该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清，其它步骤相同)的方法进行trfia检测，计算该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的荧光检测值的平均值(x)和标准偏差(sd)。判为阳性；判为阴性。该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清均是采用上述临床诊断为未患羊细粒棘球蚴病的羊血清。结果表明，该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均荧光检测值x为2217，sd为114，因此阴阳性临界荧光检测值为2559。2.2利用本发明的试剂盒2，经过优化实验建立了以bsa-eb2-3为包被抗原的时间分辨荧光免疫分析方法(以下简称本发明trfia方法2)如下：2.2.1包被：用包被缓冲液稀释步骤1中的bsa-eb2-3至其浓度为1.0μg/ml，得到包被抗原溶液，用该包被抗原溶液包被实验孔，100μl/孔加至酶标板，4℃孵育16h。2.2.2洗涤：倾去孔内包被原溶液，用pbst洗涤液洗涤5次，每次3min；拍干。2.2.3封闭：加入1％bsa封闭液，250μl/孔，37℃孵育2h。2.2.4加样：2.2.4.1样品孔用包被缓冲液将羊细粒棘球蚴病阳性血清稀释50倍，得到待测血清。将100μl待测血清加到酶标板上，37℃反应1h，倾去孔内液体，然后用洗涤液洗涤5次。羊细粒棘球蚴病阳性血清是采用上述临床诊断为患有羊细粒棘球蚴病的羊血清。2.2.4.2空白对照孔与2.2.4.1的区别仅在于将待测血清替换为等体积的高纯水，其它步骤不变。2.2.5加铕元素标二抗：加入用二抗稀释液进行1:50000稀释的铕标记兔抗山羊igg，100μl/孔，37℃30min。2.2.6显色：加入tmb，100μl/孔，反应10min。2.2.7终止：加入0.2mol/lh2so4溶液终止反应，100μl/孔。2.2.8测定：用时间分辨荧光免疫分析仪读取各孔的荧光检测值。2.2.9、阴阳性临界值的确定将400份羊细粒棘球蚴病阴性血清采用步骤2.2.1-2.2.8(将2.2.4.1中的羊细粒棘球蚴病阳性血清分别替换为该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清，其它步骤相同)的方法进行trfia检测，计算该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的荧光检测值的平均值(x)和标准偏差(sd)。判为阳性；判为阴性。该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清均是采用上述临床诊断为未患羊细粒棘球蚴病的羊血清。结果表明，该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均荧光检测值为1879，sd为106，因此阴阳性临界荧光检测值为2197。2.3利用本发明的试剂盒3，经过优化实验建立了以bsa-eb3-3为包被抗原的时间分辨荧光免疫分析方法(以下简称本发明trfia方法3)如下：2.3.2包被：用包被缓冲液稀释步骤1中的bsa-eb3-3至其浓度为1.0μg/ml，得到包被抗原溶液，用该包被抗原溶液包被实验孔，100μl/孔加至酶标板，4℃孵育16h。2.3.2洗涤：倾去孔内包被原溶液，用pbst洗涤液洗涤5次，每次3min；拍干。2.3.3封闭：加入1％bsa封闭液，250μl/孔，37℃孵育2h。2.3.4加样：2.3.4.1样品孔用包被缓冲液将羊细粒棘球蚴病阳性血清稀释50倍，得到待测血清。将100μl待测血清加到酶标板上，37℃反应1h，倾去孔内液体，然后用洗涤液洗涤5次。羊细粒棘球蚴病阳性血清是采用上述临床诊断为患有羊细粒棘球蚴病的羊血清。2.3.4.2空白对照孔与2.3.4.1的区别仅在于将待测血清替换为等体积的高纯水，其它步骤不变。2.3.5加铕元素标二抗：加入用二抗稀释液进行1:50000稀释的铕标记兔抗山羊igg，100μl/孔，37℃30min。2.3.6显色：加入tmb，100μl/孔，反应10min。2.3.7终止：加入0.2mol/lh2so4溶液终止反应，100μl/孔。2.3.8测定：用时间分辨荧光免疫分析仪读取各孔荧光检测值。2.3.9阴阳性临界值的确定将400份羊细粒棘球蚴病阴性血清采用步骤2.3.2-2.3.8(将2.3.4.1中的羊细粒棘球蚴病阳性血清分别替换为该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清，其它步骤相同)的方法进行trfia检测，计算该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的荧光检测值的平均值(x)和标准偏差(sd)。判为阳性；判为阴性。该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清均是采用上述临床诊断为未患羊细粒棘球蚴病的羊血清。结果表明，该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均荧光检测值为1796，sd为98，因此阴阳性临界荧光检测值为2090。2.4利用对照试剂盒1，经过优化实验建立了以bsa-eb1-1为包被抗原的时间分辨荧光免疫分析方法(以下简称对照trfia方法1)如下：2.4.1包被：用包被缓冲液稀释步骤1中的bsa-eb1-1至其浓度为1.0μg/ml，得到包被抗原溶液，用该包被抗原溶液包被实验孔，100μl/孔加至酶标板，4℃孵育16h。2.4.2洗涤：同2.2.2。2.4.3封闭：同2.2.3。2.4.4加样：同2.2.4。2.4.5加铕元素标二抗：同2.2.5。2.4.6显色：同2.2.6。2.4.7终止：同2.2.7。2.4.8测定：同2.2.8。2.4.9阴阳性临界值的确定将400份羊细粒棘球蚴病阴性血清采用步骤2.4.1-2.4.8(将2.4.4.1中的羊细粒棘球蚴病阳性血清分别替换为该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清，其它步骤相同)的方法进行trfia检测，计算该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的荧光检测值的平均值(x)和标准偏差(sd)。判为阳性；判为阴性。该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清均是采用上述临床诊断为未患羊细粒棘球蚴病的羊血清。结果表明，该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均荧光检测值为2987，sd为232，因此阴阳性临界荧光检测值为3683。2.5利用对照试剂盒2，经过优化实验建立了以bsa-eb1-2为包被抗原的时间分辨荧光免疫分析方法(以下简称对照trfia方法2)如下：2.5.1包被：用包被缓冲液稀释步骤1中的bsa-eb1-2至其浓度为1.0μg/ml，得到包被抗原溶液，用该包被抗原溶液包被实验孔，100μl/孔加至酶标板，4℃孵育16h。2.5.2洗涤：同2.2.2。2.5.3封闭：同2.2.3。2.5.4加样：同2.2.4。2.5.5加铕元素标二抗：同2.2.5。2.5.6显色：同2.2.6。2.5.7终止：同2.2.7。2.5.8测定：同2.2.8。2.5.9、阴阳性临界值的确定将400份羊细粒棘球蚴病阴性血清采用步骤2.5.1-2.5.8(将2.5.4.1中的羊细粒棘球蚴病阳性血清分别替换为该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清，其它步骤相同)的方法进行trfia检测，计算该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的荧光检测值的平均值(x)和标准偏差(sd)。判为阳性；判为阴性。该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清均是采用上述临床诊断为未患羊细粒棘球蚴病的羊血清。结果表明，该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均荧光检测值为3354，sd为287，因此阴阳性临界荧光检测值为4215。2.6利用对照试剂盒3，经过优化实验建立了以bsa-eb1-3为包被抗原的时间分辨荧光免疫分析方法(以下简称对照trfia方法3)如下：2.6.1包被：用包被缓冲液稀释步骤1中的bsa-eb1-3至其浓度为1.0μg/ml，得到包被抗原溶液，用该包被抗原溶液包被实验孔，100μl/孔加至酶标板，4℃孵育16h。2.6.2洗涤：同2.2.2。2.6.3封闭：同2.2.3。2.6.4加样：同2.2.4。2.6.5加铕元素标二抗：同2.2.5。2.6.6显色：同2.2.6。2.6.7终止：同2.2.7。2.6.8测定：同2.2.8。2.6.9阴阳性临界值的确定将400份羊细粒棘球蚴病阴性血清采用步骤2.6.1-2.6.8(将2.6.4.1中的羊细粒棘球蚴病阳性血清分别替换为该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清，其它步骤相同)的方法进行trfia检测，计算该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的荧光检测值的平均值(x)和标准偏差(sd)。判为阳性；判为阴性。该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清均是采用上述临床诊断为未患羊细粒棘球蚴病的羊血清。结果表明，该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均荧光检测值为4150，sd为352，因此阴阳性临界荧光检测值为5206。2.7利用对照试剂盒4，经过优化实验建立了以bsa-eb2-1为包被抗原的时间分辨荧光免疫分析方法(以下简称对照trfia方法4)如下：2.7.1包被：用包被缓冲液稀释步骤1中的bsa-eb2-1至其浓度为1.0μg/ml，得到包被抗原溶液，用该包被抗原溶液包被实验孔，100μl/孔加至酶标板，4℃孵育16h。2.7.2洗涤：同2.2.2。2.7.3封闭：同2.2.3。2.7.4加样：同2.2.4。2.7.5加铕元素标二抗：同2.2.5。2.7.6显色：同2.2.6。2.7.7终止：同2.2.7。2.7.8测定：同2.2.8。2.7.9阴阳性临界值的确定将400份羊细粒棘球蚴病阴性血清采用步骤2.7.1-2.7.8(将2.7.4.1中的羊细粒棘球蚴病阳性血清分别替换为该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清，其它步骤相同)的方法进行trfia检测，计算该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的荧光检测值的平均值(x)和标准偏差(sd)。判为阳性；判为阴性。该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清均是采用上述临床诊断为未患羊细粒棘球蚴病的羊血清。结果表明，该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均荧光检测值为3694，sd为325，因此阴阳性临界荧光检测值为4669。2.8利用对照试剂盒5，经过优化实验建立了以bsa-eb2-2为包被抗原的时间分辨荧光免疫分析方法(以下简称对照trfia方法5)如下：2.8.1包被：用包被缓冲液稀释步骤1中的bsa-eb2-2至其浓度为1.0μg/ml，得到包被抗原溶液，用该包被抗原溶液包被实验孔，100μl/孔加至酶标板，4℃孵育16h。2.8.2洗涤：同2.2.2。2.8.3封闭：同2.2.3。2.8.4加样：同2.2.4。2.8.5加铕元素标二抗：同2.2.5。2.8.6显色：同2.2.6。2.8.7终止：同2.2.7。2.8.8测定：同2.2.8。2.8.9、阴阳性临界值的确定将400份羊细粒棘球蚴病阴性血清采用步骤2.8.1-2.8.8(将2.8.4.1中的羊细粒棘球蚴病阳性血清分别替换为该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清，其它步骤相同)的方法进行trfia检测，计算该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均值(x)和标准偏差(sd)。判为阳性；判为阴性。该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清均是采用上述临床诊断为未患羊细粒棘球蚴病的羊血清。结果表明，该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均荧光检测值为4154，sd为379，因此阴阳性临界荧光检测值为5291。2.9利用对照试剂盒6，经过优化实验建立了以bsa-eb3-1为包被抗原的时间分辨荧光免疫分析方法(以下简称对照trfia方法6)如下：2.9.1包被：用包被缓冲液稀释步骤1中的bsa-eb3-1的浓度为1.0μg/ml，得到包被抗原溶液，用该包被抗原溶液包被实验孔，100μl/孔加至酶标板，4℃孵育16h。2.9.2洗涤：同2.2.2。2.9.3封闭：同2.2.3。2.9.4加样：同2.2.4。2.9.5加铕元素标二抗：同2.2.5。2.9.6显色：同2.2.6。2.9.7终止：同2.2.7。2.9.8测定：同2.2.8。2.9.9阴阳性临界值的确定将400份羊细粒棘球蚴病阴性血清采用步骤2.9.1-2.9.8(将2.9.4.1中的羊细粒棘球蚴病阳性血清分别替换为该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清，其它步骤相同)的方法进行trfia检测，计算该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均值(x)和标准偏差(sd)。判为阳性；判为阴性。该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清均是采用上述临床诊断为未患羊细粒棘球蚴病的羊血清。结果表明，该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均荧光检测值为3107，sd为221，因此阴阳性临界荧光检测值为3770。2.10利用对照试剂盒7，经过优化实验建立了以bsa-eb3-2为包被抗原的时间分辨荧光免疫分析方法(以下简称对照trfia方法7)如下：2.10.1包被：用包被缓冲液稀释步骤1中的bsa-eb3-2至其浓度为1.0μg/ml，得到包被抗原溶液，用该包被抗原溶液包被实验孔，100μl/孔加至酶标板，4℃孵育16h。2.10.2洗涤：同2.2.2。2.10.3封闭：同2.2.3。2.10.4加样：同2.2.4。2.10.5加铕元素标二抗：同2.2.5。2.10.6显色：同2.2.6。2.10.7终止：同2.2.7。2.10.8测定：同2.2.8。2.10.9阴阳性临界值的确定将400份羊细粒棘球蚴病阴性血清采用步骤2.10.1-2.10.8(将2.10.4.1中的羊细粒棘球蚴病阳性血清分别替换为该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清，其它步骤相同)的方法进行trfia检测，计算该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均值(x)和标准偏差(sd)。判为阳性；判为阴性。该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清均是采用上述临床诊断为未患羊细粒棘球蚴病的羊血清。结果表明，该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均荧光检测值为2895，sd为243，因此阴阳性临界荧光检测值为3624。2.11利用对照试剂盒8，经过优化实验建立了以bsa-eb4-1为包被抗原的时间分辨荧光免疫分析方法(以下简称对照trfia方法8)如下：2.11.1包被：用包被缓冲液稀释步骤1中的bsa-eb4-1至其浓度为1.0μg/ml，得到包被抗原溶液，用该包被抗原溶液包被实验孔，100μl/孔加至酶标板，4℃孵育16h。2.11.2洗涤：同2.2.2。2.11.3封闭：同2.2.3。2.11.4加样：同2.2.4。2.11.5加铕元素标二抗：同2.2.5。2.11.6显色：同2.2.6。2.11.7终止：同2.2.7。2.11.8测定：同2.2.8。2.11.9、阴阳性临界值的确定将400份羊细粒棘球蚴病阴性血清采用步骤2.11.1-2.11.8(将2.11.4.1中的羊细粒棘球蚴病阳性血清分别替换为该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清，其它步骤相同)的方法进行trfia检测，计算该400份羊细粒棘球蚴病阳性血清的平均值(x)和标准偏差(sd)。判为阳性；判为阴性。该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清均是采用上述临床诊断为未患羊细粒棘球蚴病的羊血清。结果表明，该400份羊细粒棘球蚴病阳性血清的平均荧光检测值为4859，sd为376，因此阴阳性临界荧光检测值为5987。2.12利用对照试剂盒9，经过优化实验建立了以bsa-eb4-2为包被抗原的时间分辨荧光免疫分析方法(以下简称对照trfia方法9)如下：2.12.1包被：用包被缓冲液稀释步骤1中的bsa-eb4-2至其浓度为1.0μg/ml，得到包被抗原溶液，用该包被抗原溶液包被实验孔，100μl/孔加至酶标板，4℃孵育16h。2.12.2洗涤：同2.2.2。2.12.3封闭：同2.2.3。2.12.4加样：同2.2.4。2.12.5加铕元素标二抗：同2.2.5。2.12.6显色：同2.2.6。2.12.7终止：同2.2.7。2.12.8测定：同2.2.8。2.12.9阴阳性临界值的确定将400份羊细粒棘球蚴病阴性血清采用步骤2.12.1-2.12.8(将2.12.4.1中的羊细粒棘球蚴病阳性血清分别替换为该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清，其它步骤相同)的方法进行trfia检测，计算该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均值(x)和标准偏差(sd)。判为阳性；判为阴性。该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清均是采用上述临床诊断为未患羊细粒棘球蚴病的羊血清。结果表明，该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均荧光检测值为4213，sd为334，因此阴阳性临界荧光检测值为5215。2.13利用对照试剂盒10，经过优化实验建立了以bsa-eb4-3为包被抗原的时间分辨荧光免疫分析方法(以下简称对照trfia方法10)如下：2.13.1包被：用包被缓冲液稀释步骤1中的bsa-eb4-3至其浓度为1.0μg/ml，得到包被抗原溶液，用该包被抗原溶液包被实验孔，100μl/孔加至酶标板，4℃孵育16h。2.13.2洗涤：同2.2.2。2.13.3封闭：同2.2.3。2.13.4加样：同2.2.4。2.13.5加铕元素标二抗：同2.2.5。2.13.6显色：同2.2.6。2.13.7终止：同2.2.7。2.13.8测定：同2.2.8。2.13.9阴阳性临界值的确定将400份羊细粒棘球蚴病阴性血清采用步骤2.13.1-2.13.8(将2.13.4.1中的羊细粒棘球蚴病阳性血清分别替换为该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清，其它步骤相同)的方法进行trfia检测，计算该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均值(x)和标准偏差(sd)。判为阳性；判为阴性。该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清均是采用上述临床诊断为未患羊细粒棘球蚴病的羊血清。结果表明，该400份羊细粒棘球蚴病阴性血清的平均荧光检测值为3280，sd为254，因此阴阳性临界荧光检测值为4042。3、特异性试验利用步骤2的本发明trfia方法1-3(简称本发明方法1-3)和对照trfia方法1-10(简称对照方法1-10)对各10份的羊细粒棘球蚴病阴性血清、羊多房棘球蚴病阳性血清和羊囊尾蚴病阳性血清进行检测，观察与其它疾病有无交叉反应。结果表明结果表明本发明trfia方法1-3对羊细粒棘球蚴病阴性血清、羊多房棘球蚴病阳性血清和羊囊尾蚴病阳性血清均无交叉反应，说明本发明的试剂盒1-3可以对羊细粒棘球蚴病阴性血清、羊多房棘球蚴病阳性血清和羊囊尾蚴病阳性血清进行准确区分。(表2-4)。表2.本发明方法1-3、对照方法1-10对10份羊细粒棘球蚴病阴性血清的检测结果表3.本发明方法1-3和对照方法1-10对10份羊多房棘球蚴病阳性血清的检测结果表4.本发明方法1-3和对照方法1-10对10份羊囊尾蚴病阳性血清的检测结果4、灵敏度试验将羊细粒棘球蚴病阳性血清进行倍比稀释，分别采用本发明trfia方法1-3(简称本发明方法1-3)和对照trfia方法1-10(简称对照方法1-10)进行检测，得出阳性临界值时的最大稀释度。结果表明本发明trfia方法1-3检测阳性血清的最高稀释倍数分别为1:1024倍、1:512倍、1:512倍；对照trfia方法1-10检测阳性血清的最高稀释倍数分别为1:256倍、1:512倍、1:1024倍、1:256倍、1:128倍1:256倍、1:512倍、1:1024倍、1:512倍、1:512倍。5、重复性试验采用本发明trfia方法1-3分别对6份羊细粒棘球蚴病阳性血清在同批次板和不同批次板上分别进行检测，平行测定5次，计算批内、批间变异系数(cv)。结果显示，本发明trfia方法1-3批内重复变异系数小于4％，批间重复变异系数小于6％(表5-7)。结果表明，本发明的试剂盒1-3对羊细粒棘球蚴病阳性血清具有良好的重复性。表5.本发明trfia方法1重复性试验表6.本发明trfia方法2重复性试验表7.本发明trfia方法3重复性试验6、符合性试验(准确性实验)采用上述临床诊断方法从中国动物疫病预防控制中心(农业农村部兽医诊断中心)保存的羊血清(来自中国新疆)挑选出了90份羊细粒棘球蚴病阳性血清与90份羊细粒棘球蚴病阴性血清。对这180份羊血清分别采用本发明trfia方法1-3(简称本发明方法1-3)和对照trfia方法1-10(简称对照方法1-10)进行检测，计算与临床诊断的符合率。敏感性(truepositiverate,tpr，真阳性率，阳性符合率)：实际阳性(患细粒棘球蚴病)而按试验标准被正确判断为阳性的百分率，敏感性越大越好，理想敏感性为100％。特异性(truenegativerate,tnr，真阴性率，阴性符合率)：实际阴性(未患细粒棘球蚴病)而按试验标准被正确判断为阴性的百分率，特异性越大越好，理想特异性为100％。tpr＝tp/(tp+fn)。tnr＝tn/(tn+fp)。acc＝(tp+tn)/(tp+fp+fn+tn)。tp：真阳性。tn：真阴性。fp：假阳性。fn：假阴性。acc：准确性。结果表明该180份羊血清，本发明trfia方法1与临床诊断的总符合率为91.67％(阳性符合率为91.11％，阴性符合率为92.22％)，本发明trfia方法2与羊细粒棘球蚴血清中和试验方法的总符合率为89.44％(阳性符合率为84.44％，阴性符合率为94.44％)，本发明trfia方法3与羊细粒棘球蚴血清中和试验方法的总符合率为87.22％(阳性符合率为81.11％，阴性符合率为93.33％)。对照trfia方法1检测结果与羊细粒棘球蚴血清中和试验方法的总符合率为83.33％(阳性符合率为86.67％，阴性符合率为80％)，对照trfia方法2检测结果与羊细粒棘球蚴血清中和试验方法的总符合率为80.56％(阳性符合率为75.56％，阴性符合率为85.56％)，对照trfia方法3检测结果与羊细粒棘球蚴血清中和试验方法的总符合率为83.33％(阳性符合率为76.67％，阴性符合率为90％)，对照trfia方法4检测结果与羊细粒棘球蚴血清中和试验方法的总符合率为80.56％(阳性符合率为80％，阴性符合率为81.11％)，对照trfia方法5检测结果与羊细粒棘球蚴血清中和试验方法的总符合率为78.89％(阳性符合率为92.22％，阴性符合率为65.56％)，对照trfia方法6检测结果与羊细粒棘球蚴血清中和试验方法的总符合率为80.56％(阳性符合率为82.22％，阴性符合率为78.89％)，对照trfia方法7检测结果与羊细粒棘球蚴血清中和试验方法的总符合率为81.67％(阳性符合率为76.67％，阴性符合率为86.67％)，对照trfia方法8检测结果与羊细粒棘球蚴血清中和试验方法的总符合率为77.78％(阳性符合率为80％，阴性符合率为75.56％)，对照trfia方法9检测结果与羊细粒棘球蚴血清中和试验方法的总符合率为82.78％(阳性符合率为74.44％，阴性符合率为91.11％)，对照trfia方法10检测结果与羊细粒棘球蚴血清中和试验方法的总符合率为77.78％(阳性符合率为91.11％，阴性符合率为64.44％)(表8-20)。说明分别将bsa-eb2-3+bsa-eb3-3、bsa-eb2-3和bsa-eb3-3作为包被抗原制备的诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒与临床诊断的总符合率显著高于分别以bsa-eb1-1、bsa-eb1-2、bsa-eb1-3、bsa-eb2-1、bsa-eb2-2、bsa-eb3-1、bsa-eb3-2、bsa-eb4-1、bsa-eb4-2和bsa-eb4-3作为包被抗原制备的诊断细粒棘球蚴病的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测细粒棘球蚴抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒。表8.本发明trfia方法1对羊血清样品检测结果表9.本发明trfia方法2对羊血清样品检测结果表10.本发明trfia方法3对羊血清样品检测结果表11.对照trfia方法1对羊血清样品检测结果表12.对照trfia方法2对羊血清样品检测结果表13.对照trfia方法3对羊血清样品检测结果表14.对照trfia方法4对羊血清样品检测结果表15.对照trfia方法5对羊血清样品检测结果表16.对照trfia方法6对羊血清样品检测结果表17.对照trfia方法7对羊血清样品检测结果表18.对照trfia方法8对羊血清样品检测结果表19.对照trfia方法9对羊血清样品检测结果表20.对照trfia方法10对羊血清样品检测结果以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。<110>中国动物疫病预防控制中心（农业农村部屠宰技术中心）<120>用于制备细粒棘球蚴病诊断试剂的多肽及其应用<130>gncfh190884<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>17<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cyslyslystyrvallysasnleuvalgluglulysaspaspaspser151015lys<210>2<211>14<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cysleulysglutyrvalarglysleuvallysgluaspglu1510当前第1页12