甲氧基聚乙二醇乙酸虾青素酯及其制备方法与流程

本发明涉及虾青素加工制备技术领域，尤其涉及一种甲氧基聚乙二醇乙酸虾青素酯及其制备方法。

背景技术：

虾青素(astaxanthin，简称ast，又称3,3’-二甲基-4,4’-二酮基-β，β’-胡萝卜素，分子式为c40h52o4)，是类胡萝卜素的一种，具有艳丽的红色和极强的抗氧化性能，能够增强机体的免疫力，促进抗体生成，同时具备抗氧化和清除自由基的能力。由于其强大的着色能力和生理功能活性，近年来虾青素成为国内外水产养殖、食品、药品、化妆品等领域的研究热点。

虾青素具有亲脂性，这一特点极大地限制了其在水相溶液中捕获活性自由基、淬灭单线态氧以及抑制脂质过氧化等功能。除此之外，这一特点也阻碍了虾青素在生物体内的结合与运输，从而限制了虾青素的生物可接受率和生物利用度，导致机体无法有效利用虾青素。另外，虾青素易集结导致其水分散性较差，从而无法充分发挥作用。为了改善这一弊端，国内外科研工作者通过虾青素两端的羟基与一些亲水性脂肪酸或具有两亲性的分子进行酯化反应，改善虾青素的水分散性。

目前有很多研究者也在通过结构改良、乳化或微胶囊化等手段增加虾青素的水溶性。美国科学家jackson.h.l合成的虾青素的二赖氨酸酯的四盐酸盐以及虾青素甘油和聚三梨醇酯等衍生物都不同程度地提高了虾青素的水分散性。对虾青素水相溶液的开发具有重要的意义。虾青素结构中六元环上所特有的羟基使其可以与一些亲水性的脂肪酸或是具有两亲性的分子进行酯化反应，从而改善虾青素的水溶性(水分散性)。hbi公司合成的虾青素琥珀酸二酯二钠盐衍生物(cardax)，此衍生物在水相溶液中的分散度为8.64mg/ml。johanna等在虾青素甘油与聚三梨醇酯的合成过程中发现，所结合的脂肪酸的亲水性越强则合成的衍生物的水相分散度越高。一些科学家通过微囊化的方法提高虾青素的水分散性，但是这种方法制成的一些产品会存在透明度不佳，或者长期储存会出现稳定性差等问题，例如中华人民共和国发明专利zl200810044646.4公开了稳定的水溶性类胡萝卜素干粉的制备方法。在此大环境下，提高虾青素水溶性的研究就具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是虾青素易集结导致其水分散性较差，从而无法充分发挥作用。

为解决上述问题，本发明提供了一种甲氧基聚乙二醇乙酸虾青素酯及其制备方法，以化学改性的方式，使得甲氧基聚乙二醇乙酸(以下采用其英文简称mpeg-cm)和虾青素从结构上合成了可以避免分子聚合的水溶性虾青素，即甲氧基聚乙二醇乙酸虾青素酯(以下采用其英文简称mpeg-cm@ast)。

为达到上述目的，本发明提供一种甲氧基聚乙二醇乙酸虾青素酯的制备方法，以化学合成的游离虾青素或者天然来源的游离虾青素(ast)为主体骨架，以甲氧基聚乙二醇乙酸(mpeg-cm)为酰基供体及亲水基团，利用催化剂催化合成反应，然后纯化得到甲氧基聚乙二醇乙酸虾青素酯(mpeg-cm@ast)的过程，制备得到的mpeg-cm@ast具有较高的水溶性，极大的增大了虾青素的应用范围。

进一步的，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶(英文简称dmap)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(英文简称edci)、n,n-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、十二烷硫酸、乙基二硫酸中的一种或一种以上的组合。如图1所示，游离虾青素与mpeg-cm在催化剂的羰基活化及强烈的水合作用下得到甲氧基聚乙二醇乙酸虾青素单酯(mpeg-cm-ast)或者甲氧基聚乙二醇乙酸虾青素双酯(mpeg-cm/mpeg-cm-ast)。

进一步的，催化反应的溶剂是丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、二甲基亚砜、四氢呋喃中的一种或一种以上的组合，能够溶解游离虾青素更好的进行合成反应。

进一步的，催化反应具体为称取4-2000mg游离虾青素、1-20倍摩尔量的mpeg-cm、15-3000mg催化剂加入到棕色血清瓶中，加入3-300ml有机溶剂搅拌溶解；向溶解后的混合物中填充氮气，并置于20-50℃恒温培养箱中，震荡反应6-24h。其中，虾青素在光、热、氧气条件下都不稳定，容易降解，所以需要控制反应温度、和反应时间、采用棕色血清瓶避光。恒温震荡是为了在使反应底物及催化剂充分接触，加快反应进程。

进一步的，纯化步骤包括(1)旋蒸；(2)清洗；(3)除水三个步骤。

进一步的，纯化步骤具体为：

(1)旋蒸：将震荡反应后的混合物减压旋蒸至干，加入50-300ml二氯甲烷复溶；

(2)将步骤(1)复溶的混合物用100-700ml的盐酸溶液(1mol/l)、100-700ml饱和碳酸氢钠溶液、100-700ml饱和氯化钠溶液依次清洗3次，除去催化剂。

(3)将步骤(2)的混合物用无水硫酸钠除水，减压旋蒸至干得到mpeg-cm@ast粗产物。该粗产物包含mpeg-cm-ast、mpeg-cm/mpeg-cm-ast、游离虾青素、剩余mpeg-cm。

进一步的，除水后进行洗脱，洗脱步骤为梯度洗脱，其程序为：

进一步的，梯度洗脱具体为取10-300mg步骤5)得到的mpeg-cm@ast粗产物，二氯甲烷溶解上样，硅胶分离纯化，梯度洗脱，得到游离虾青素，甲氧基聚乙二醇乙酸虾青素单酯(英文简称为mpeg-cm-ast)，甲氧基聚乙二醇乙酸虾青素双酯(英文简称为mpeg-cm/mpeg-cm-ast)。

一种用上述制备的甲氧基聚乙二醇乙酸虾青素酯，其中，甲氧基聚乙二醇乙酸虾青素酯(mpeg-cm@ast)是甲氧基聚乙二醇乙酸虾青素单酯(mpeg-cm-ast)和甲氧基聚乙二醇乙酸虾青素双酯(mpeg-cm/mpeg-cm-ast)统称，其结构式如下：

进一步的，其中n为自然数，其范围为n＝38-200。

其中，对于上述mpeg-cm@ast粗产物的检测方法如下：取少量步骤(3)除水后得到的mpeg-cm@ast粗产物，二氯甲烷溶解，用于tlc的初步检测，展开剂为氯仿/甲醇(5:1，v/v)。取少量步骤(3)除水后得到的mpeg-cm@ast粗产物，色谱纯二氯甲烷溶解，过0.22μm有机滤膜，装入液相小瓶中，hplc-(apci)ms检测，其中硅胶是200-300目的正相硅胶。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明首次以化学改性的方式，从结构上合成了可以避免分子聚合的水溶性虾青素。

(2)本发明的制备方法适应性更强、稳定性好，合成步骤简单，不会产生大量聚合物，检测方法更精确。

(3)本发明以游离虾青素和mpeg-cm为底物来合成mpeg-cm@ast，反应条件温和，工艺简单，绿色环保。本发明制备的mpeg-cm@ast在25℃条件下，溶解度大于32mg/ml，可以作为水产、畜禽等饲料添加剂；粮食、饮料、肉制品、水产品等行业加工的着色；医药品和化妆品等行业的加工着色及保健食品的开发。其良好的水溶性，极大的提高了虾青素的应用范围。

附图说明

图1是本发明mpeg-cm@ast合成路线图；

图2是本发明粗产物及底物组分的tlc图谱；其中，1：粗产物；2：游离虾青素；3：mpeg-cm；4：催化剂)的tlc图谱(注：左图为自然显色；右图为碘缸显色)；

图3是虾青素标准品、粗产物以及纯化产物的高效液相色谱图；

图4mpeg-cm@ast溶解在水和二氯甲烷中的uv-vis扫描图；

图5mpeg-cm@ast纳米溶液粒径分布图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

合成：40mg游离虾青素、1倍摩尔量的甲氧基聚乙二醇乙酸(mpeg-cm，分子量2000左右)、200mgdmap，装入100ml血清瓶中，加入30ml二氯甲烷搅拌溶解；充氮，避光，于37℃的恒温培养箱中(100rpm/min)震荡12h。mpeg-cm@ast合成率可达90.62％。

纯化：减压旋蒸除去有机溶剂，再用80ml二氯甲烷复溶，用200ml盐酸溶液(1mol/l)、200ml饱和碳酸氢钠溶液、200ml饱和氯化钠溶液依次清洗3次；无水硫酸钠除水。回收有机相，旋蒸至干，得到粗产物，去少量粗产物，色谱纯二氯甲烷复溶，用于tlc和hplc检测。

实施例2：

合成：80mg游离虾青素、1倍摩尔量的甲氧基聚乙二醇乙酸(mpeg-cm，分子量2000左右)、150mgedci，装入100ml血清瓶中，加入25ml丙酮，充氮，避光，于30℃的恒温培养箱中(100rpm/min)震荡6h。

纯化：减压旋蒸除去有机溶剂，再用120ml二氯甲烷复溶，用350ml盐酸溶液(1mol/l)、350ml饱和碳酸氢钠溶液、350ml饱和氯化钠溶液依次清洗3次；无水硫酸钠除水。回收有机相，旋蒸至干，得到粗产物，去少量粗产物，色谱纯二氯甲烷复溶，用于tlc和hplc检测。

实施例3：

合成：40mg游离虾青素、4倍摩尔量的甲氧基聚乙二醇乙酸(mpeg-cm，分子量5000左右)、250mg三乙胺，装入100ml血清瓶中，加入35ml乙酸乙酯，充氮，避光，于25℃的恒温培养箱中(100rpm/min)震荡18h。

纯化：减压旋蒸除去有机溶剂，再用200ml二氯甲烷复溶，用450ml盐酸溶液(1mol/l)、450ml饱和碳酸氢钠溶液、450ml饱和氯化钠溶液依次清洗3次；无水硫酸钠除水。回收有机相，旋蒸至干，得到粗产物，去少量粗产物，色谱纯二氯甲烷复溶，用于tlc和hplc检测。

实施例4：

合成：20mg游离虾青素、8倍摩尔量的甲氧基聚乙二醇乙酸(mpeg-cm，分子量2000左右)、200mg吡啶、100mgedci，装入100ml血清瓶中，加入50ml氯仿，充氮，避光，于40℃的恒温培养箱中(100rpm/min)震荡24h。

纯化：减压旋蒸除去有机溶剂，再用150ml二氯甲烷复溶，用500ml盐酸溶液(1mol/l)、500ml饱和碳酸氢钠溶液、500ml饱和氯化钠溶液依次清洗3次；无水硫酸钠除水。回收有机相，旋蒸至干，得到粗产物，去少量粗产物，色谱纯二氯甲烷复溶，用于tlc和hplc检测。

实施例5：

合成：80mg游离虾青素、1倍摩尔量的甲氧基聚乙二醇乙酸(mpeg-cm，分子量5000左右)、250mgdmap、150mg十二烷硫酸，装入100ml血清瓶中，加入35ml二氯甲烷，充氮，避光，于45℃的恒温培养箱中(100rpm/min)震荡20h。

纯化：减压旋蒸除去有机溶剂，再用250ml二氯甲烷复溶，用600ml盐酸溶液(1mol/l)、600ml饱和碳酸氢钠溶液、600ml饱和氯化钠溶液依次清洗3次；无水硫酸钠除水。回收有机相，旋蒸至干，得到粗产物，去少量粗产物，色谱纯二氯甲烷复溶，用于tlc和hplc检测。

实施例6：

合成：40mg游离虾青素、2倍摩尔量的甲氧基聚乙二醇乙酸(mpeg-cm，分子量10000左右)、50mgdmap、50mgedci、50mg吡啶，装入100ml血清瓶中，加入25ml丙酮，充氮，避光，于30℃的恒温培养箱中(100rpm/min)震荡6h。

纯化：减压旋蒸除去有机溶剂，再用50ml二氯甲烷复溶，用100ml盐酸溶液(1mol/l)、100ml饱和碳酸氢钠溶液、100ml饱和氯化钠溶液依次清洗3次；无水硫酸钠除水。回收有机相，旋蒸至干，得到粗产物，去少量粗产物，色谱纯二氯甲烷复溶，用于tlc和hplc检测。

检测：

(1)tlc检测：

取15ml展开剂加入层析缸中，密封平衡60min；用3mm的毛细管点样，点样线距硅胶板下边缘1.5cm，重复多次，点样过程用氮气及时吹干溶剂，以减小“点样环形色谱效应”和虾青素化合物的降解，待溶剂前沿距硅胶板上边缘1cm时，取出硅胶板，室温下自然显色。

本法明中使用的展开剂为氯仿/甲醇(5:1，v/v)。使用该展开剂可以将游离虾青素、mpeg-cm-ast、mpeg-cm/mpeg-cm-ast以及剩余的mpeg-cm很好的分离开，通过自然显色即可表明合成产物中mpeg-cm-ast和mpeg-cm/mpeg-cm-ast的生成情况，再经过碘显色，就能检测产物中剩余的mpeg-cm清除情况。

实施例1的tlc检测结果如图2所示，自然显色结果中出现3个条带，rf值依次为0.90，0.65和0.55。参照参照游离虾青素对照品的条带可知，rf值0.9的条带为游离虾青素。由于游离虾青素两端羟基被mpeg-cm取代后，会增加合成产物整体的极性，两端被取代的mpeg-cm/mpeg-cm-ast的极性高于单端被取代的mpeg-cm-ast。所以初步推测rf值0.65的条带为mpeg-cm-ast，rf值0.55的条带为mpeg-cm/mpeg-cm-ast。通过碘显色我们可以得到该展开剂条件下，mpeg-cm的rf值为0.50，催化剂rf值为0.35。

(2)hplc检测：

色谱条件：

色谱柱：ymc-packsil-06(4.6mm×250mm，5μm)；流动相a：色谱纯甲醇，b：色谱纯二氯甲烷；线性梯度洗脱：0～5min，b维持在98％；5～15min，b由98％下降至95％；15～22min，b维持在95％；22～25min，b由95％下降至90％；25～35min，b维持在90％；35～40min，b由90％上升至98％。流速1.0ml/min；检测波长476nm；柱温：35℃；dad全波长扫描范围：200～800nm；进样量为20μl。

图3为虾青素标准品、实施例1粗产物以及柱层析纯化得到的mpeg-cm@ast的高效液相色谱图。峰1为虾青素标准的色谱峰，出峰时间为12-13min，峰2的出峰时间在18-20min，结合一级质谱图推测其为mpeg-cm-ast，峰3的出峰时间在25-28min，结合一级质谱图推测其为mpeg-cm/mpeg-cm-ast。出峰时间16-34min时，流动相中极性不断增加，而mpeg-cm@ast单酯和双酯的出峰时间显著高于游离虾青素，这说明产物的极性明显变大。

纯化产物：称取10g硅胶(200～300目)，于105℃高温活化12h后，装入硅胶柱中，用二氯甲烷匀速淋洗直至柱平衡。再用10ml二氯甲烷溶解100mg粗产物，用玻璃棒引流，缓慢倒入硅胶柱中。梯度洗脱分离各个组分，洗脱速度5ml/min，将rf值相同的洗脱液合并，将不同的合并液分别用旋转蒸发仪旋干后称量、氮气封存于-20℃待用。具体的洗脱梯度如下：二氯甲烷/甲醇100:0、98:2、95:5、0:100(v/v)。各个梯度洗脱样品经过tlc检测，得到rf值，初步推测洗脱样品依次为游离虾青素、mpeg-cm-ast、mpeg-cm/mpeg-cm-ast和mpeg-cm。

mpeg-cm@ast的光谱扫描结果如图4所示，结果表明，mpeg-cm@ast在二氯甲烷中最大吸收波长为484nm。相比于游离虾青素，mpeg-cm@ast最大的优势是能够溶解于水相，超纯水特征吸收波长为441nm，并且25℃条件下，溶解度为32mg/ml。水溶液中微粒的大小直接影响到功能因子在水相介质中的分散性、释放特性和生物利用度等。因此，粒径分布特性的考察是mpeg-cm@ast纳米溶液的关键指标之一。mpeg-cm@ast纳米溶液的粒径分布结果，如图5所示，平均粒径为214nm，且mpeg-cm@ast分散到水中的外观澄清透明。另外，多分散指数pdi值是反映乳液粒径分布情况的指标，据研究报道，当pdi值分布在0～0.3之间时，表明溶液体系具较均匀的分散性，其值越小表示粒径分布越集中、越均匀。本专利通过马尔文电位及纳米粒度分布仪测得mpeg-cm@ast纳米溶液的pdi值为0.172，显著小于0.3(p＜0.05)，表明mpeg-cm@ast纳米溶液具有均一的分散性。由此可见，本专利制备的mpeg-cm@ast样品在水相溶液中具有良好的水分散性能。

综上，本发明采用一步合成法就可以制备得到水溶性虾青素，反应条件温和，工艺简单。本发明制备的mpeg-cm@ast在水体系中具有良好的溶解性，解决了虾青素由于溶解度限制而造成的使用范围局限性的问题。本发明制备的mpeg-cm@ast可以作为水产、畜禽等饲料添加剂，可用于粮食、肉制品、水产品、医药品和化妆品等行业。

最后需要说明，以上实施例虽然描述了本发明的具体实施方式，但是并非限制本发明；本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书所限定的。而一切进行修改或等同替换，其均应包含在本发明的保护范围中。