茄二十八星瓢虫生长发育相关基因CHS1及其应用的制作方法

本发明属于虫害防控技术领域。更具体地，涉及一种茄二十八星瓢虫生长发育相关基因chs1及其应用。

背景技术：

茄二十八星瓢虫henosepilachnavigintioctopunctata(fabricius)属于鞘翅目瓢虫科，是一种重要的农业害虫，寄主植物十分广泛，主要为害茄子、马铃薯和番茄等茄科蔬菜。其幼虫和成虫均以叶片为食，喜群集于叶片背面，取食下表皮、叶肉，受害叶片通常形成不规则透明斑或穿孔，严重时造成植株萎蔫甚至整株死亡。茄二十八星瓢虫在我国的分布范围广泛，尤其是长江以南发生密度较大。近年来，由于气候变暖、贸易发展以及保护地蔬菜栽培面积的扩大，其食料一年四季不断，茄二十八星瓢虫的发生和为害愈加严重。2015年，我国启动了马铃薯主粮化战略，必将进一步扩大我国马铃薯的种植面积，茄二十八星瓢虫的防治刻不容缓。

目前，茄二十八星瓢虫的防治包括人工捕捉、引诱剂诱杀、化学农药。其中人工捕捉不仅效果差，还有十分繁重的劳力问题；而引诱剂诱杀的效果也不尽如人意，不彻底；因此更多还是依赖于化学农药，但是化学农药会引起环境污染和农产品质量安全等众多问题。

rna干扰(rnainterference，rnai)是一种在进化上保守，依赖于产生的短片段rnas(sirnas)，从而促进同源mrna的降解或抑制其翻译的作用机制。rnai提供了一个在昆虫中进行功能基因组学研究的重要工具，且为开发对环境友好的害虫治理方法奠定了基础。由于使用rnai技术可以特异性抑制基因的表达，所以该技术已经广泛应用于靶向干扰害虫基因从而达到防治害虫的目的，但是目前国内外对茄二十八星瓢虫基因功能研究较少，未发现具有杀虫活性的靶标基因。

本发明人团队前期研究显示(201710949193.9)，利用直接饲喂合适的外源dsrna的方式即可实现对瓢虫的毒性，因此从基因层面开发适用于防治茄二十八星瓢虫的外源dsrna产品，使用方便、成本低，更由于基因的特异性，可实现精确、优异的防治效果，对环境友好，在茄二十八星瓢虫的防治方面具有很大的应用前景。然而，相关靶标基因的筛选，以及防治效果好、特异、稳定的dsrna的设计是最大的难题和关键问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有茄二十八星瓢虫防治技术的缺陷和不足，提供一种茄二十八星瓢虫的高致死基因，即chs1基因。并基于该基因开发了能够高效防治茄二十八星瓢虫的技术，即直接饲喂对茄二十八星瓢虫具有高致死能力的靶标基因dsrna，利用dschs1对茄二十八星瓢虫的致死效应达到防治目的。该方法操作方便、有效性和灵敏性好、杀虫效率高，且具有环境友好等诸多优点，有很好的应用前景。

本发明的目的是提供一种茄二十八星瓢虫chs1基因及其防治茄二十八星瓢虫的应用。

本发明另一目的是提供一种可用于防治茄二十八星瓢虫的chs1基因的dsrna及其应用。

本发明再一目的是提供一种防治茄二十八星瓢虫的方法及试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明基于茄二十八星瓢虫的转录组文库，筛选得到一个高致死基因——chs1基因，并开发了饲喂chs1基因的dsrna(dschs1)防治茄二十八星瓢虫的技术。本发明把茄子叶片分别浸泡在试剂盒合成的dschs1和dsgfp的溶液中，取出晾干后饲喂茄二十八星瓢虫的1龄幼虫2天，而后以未用dsrna处理的茄子叶片饲喂，观察记录茄二十八星瓢虫的死亡率和发育状态；另外，用菌液表达dschs1的方法测定了其对茄二十八星瓢虫1龄、3龄以及成虫的致死能力，进而全面的评价外源dschs1对茄二十八星瓢虫的杀虫活性。最后，利用荧光定量pcr(qpcr)的方法检测分析了chs1基因在取食了dschs1和dsgfp茄二十八星瓢虫中的表达量变化。结果显示，直接饲喂外源dschs1可显著抑制茄二十八星瓢虫chs1基因表达，直接饲喂外源dschs1对茄二十八星瓢虫具有显著的致死效应。因此，以下主题及应用均应在本发明保护范围之内：

一种茄二十八星瓢虫chs1基因，其序列如seqidno.1所示。

所述chs1基因在防治茄二十八星瓢虫或制备防治茄二十八星瓢虫的产品中的应用。

所述chs1基因在抑制茄二十八星瓢虫生长或制备抑制茄二十八星瓢虫生长的产品中的应用。

所述chs1基因在促进茄二十八星瓢虫死亡或制备促进茄二十八星瓢虫死亡的产品中的应用。

所述chs1基因的抑制剂在防治茄二十八星瓢虫或制备防治茄二十八星瓢虫的产品中的应用。

一种可用于防治茄二十八星瓢虫的dsrna，该dsrna可靶向沉默上述chs1基因。dsrna序列如seqidno.1所示。

一种防治茄二十八星瓢虫的试剂盒，含有chs1基因抑制剂。优选地，所述抑制剂为上述dsrna。

具体地，利用chs1基因防治茄二十八星瓢虫的途径之一，即一种防治茄二十八星瓢虫的方法，直接饲喂外源dsrna，使得dschs1进入茄二十八星瓢虫体内，该dsrna可沉默/抑制茄二十八星瓢虫的chs1基因表达，抑制茄二十八星瓢虫生长、促进茄二十八星瓢虫死亡，从而达到防治茄二十八星瓢虫的目的。

本发明具有以下有益效果：

本发明筛选得到一种茄二十八星瓢虫的高致死基因chs1基因，并开发了其高效沉默dsrna，开发了能够高效防治茄二十八星瓢虫的技术，即直接饲喂对茄二十八星瓢虫具有高致死能力的靶标基因dsrna，利用dschs1对茄二十八星瓢虫的致死效应达到防治目的。该方法操作方便、有效性和灵敏性好、杀虫效率高，且具有环境友好等诸多优点，有很好的应用前景。

附图说明

图1为菌液表达的dsgfp和dschs1电泳图。

图2为不同浓度的dschs1对茄二十八星瓢虫幼虫死亡率的影响。利用实验开始后10天的幼虫死亡率数据，用cox回归程序建立存活曲线。不同字母(如a、b)表示对照曲线与处理曲线有显著性差异。

图3为取食菌液表达的dschs1对茄二十八星瓢虫存活率的影响(图a：1龄幼虫的存活率；图b：3龄幼虫的存活率；图c：成虫的存活率)。分别利用10天、10天、14天的1龄幼虫、3龄幼虫和成虫的死亡率数据，用cox回归程序建立存活曲线。不同字母(如a、b)表示对照曲线与处理曲线有显著性差异。

图4为饲喂dsrna开始的第3天，正常发育的dsgfp对照组(a)和死亡的dschs1处理组(b)茄二十八星瓢虫表型差异。

图5为取食dschs1和dsgfp后的第2天和第4天，茄二十八星瓢虫中chs1基因表达量的变化。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

下述实施例中所用茄二十八星瓢虫，于华南农业大学昆虫学系饲养。饲养茄二十八星瓢虫的茄子为万盛元帅圆茄苗，将瓢虫放与含滤纸的培养皿中，滤纸用棉球保湿，放入人工气候箱中(温度25±1℃，湿度70％-80％，光周期l：d＝14：10)进行繁殖。

rna提取利用trizol提取法(invitrogen,usa)，反转录试剂(primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser)购自takara生物技术有限公司，dsrna合成试剂盒(megascript^tmt7)购自thermofisherscientific，pcr反应体系所用试剂盒(extaq^tm)购自takara生物技术有限公司，dna纯化回收试剂盒(universaldnapurificationkit)购自天根生化科技(北京)有限公司。

以下实施例的数据处理方法：对于两种类型的dsrna对茄二十八星瓢虫进行生物测定的结果分析，使用excel2010对茄二十八星瓢虫的存活率进行统计，利用spss19.0软件采用cox回归分析作图，不同浓度间的差异性分析采用单因素分析。对rna干扰后靶标基因表达量变化的分析，qpcr数据采用2^-△△ct法(ct表示循环数)进行计算。应用spss19.0软件采用单因素方差分析进行数据分析。

实施例1生长发育相关基因chs1试剂盒合成dsrna的获得

我们根据茄二十八星瓢虫的基因组构建其转录组文库，再基于构建的转录组文库，研究筛选与茄二十八星瓢虫生长发育相关基因，筛选得到chs1基因片段，如seqidno.1所示。然后合成dsrna。

1、茄二十八星瓢虫总rna提取及第一链cdna的合成。

取茄二十八星瓢虫的2龄幼虫10只于2ml离心管中，利用trizol法提取茄二十八星瓢虫的总rna，rna的浓度和质量利用仪器nanodropone^c进行测定，利用反转录试剂盒(primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser,takara)依照说明书步骤进行反转录，合成cdna第一链。

2、引物设计

从茄二十八星瓢虫的转录组文库中得到chs1的基因序列，设计chs1基因的dsrna引物p1(表1)，绿色荧光蛋白基因(gfp)从实验室保存的含有gfp的质粒上扩增获得，gfp基因的dsrna引物p2(表1)。在dschs1的引物p1和dsgfp的引物p2上分别加上与酶切位点相关的同源臂，设计与dschs1构建表达载体相关的引物p3，与dsgfp构建表达载体相关的引物p4(表1)。根据chs1基因的序列，设计chs1基因的qpcr引物p5，内参基因gapdh的qpcr引物p6(表1)。

表1：dsrna合成及qpcr引物

3、试剂盒合成chs1基因和gfp基因的dsrnas

利用表1中的引物p1和p2进行pcr扩增，pcr扩增的反应体系为10xextaqbuffer5μl、takaraextaq0.25μl、dntpmixture4μl、上游引物(10μmol/l)1μl、下游引物(10μmol/l)1μl、cdna/gfp质粒1μl，ddh2o补齐至50μl。

pcr扩增的反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min。将扩增产物置于4℃保存。程序反应完成后，利用琼脂糖凝胶电泳法对扩增结果进行检测。用dna纯化回收试剂盒(universaldnapurificationkit,tiangen)回收纯化上述得到的两种pcr产物，作为体外转录dsrna的模版，dsrna的体外转录体系为10xreactionbuffer5μl、(atp、gtp、ctp、utp)溶液各5μl、enzymemix5μl、模版20μl，ddh2o补足至50μl。37℃放置4h。反应结束后加入2.5μl的turbodnase去除残留的模版dna和单链rna，然后纯化dsrna，最后用50μlddh2o溶解dsrna，分别得到dschs1和dsgfp，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳验证dsrna的条带。

茄二十八星瓢虫的chs1dsrna为双链rna，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列表中的seqidno.1，其反义链的核苷酸序列为序列表中seqidno.1的反向互补序列，chs1dsrna编码基因的核苷酸序列为序列表中的seqidno.1。gfpdsrna为双链rna，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列表中的seqidno.2，其反义链的核苷酸序列为序列表中seqidno.2的反向互补序列。

4、生长发育相关基因chs1菌液表达dsrna的获得

在l4440的序列上选择两个酶切位点，分别为bamhi(ggatcc)和saci(gagctc)。根据l4440的序列信息(此序列信息已经公开)，在dschs1的引物p1和dsgfp的引物p2上分别加上与两个酶切位点相关的同源臂，设计与dschs1构建表达载体相关的引物p3，与dsgfp构建表达载体相关的引物p4(表1)。以茄二十八星瓢虫的cdna为模板，pcr扩增的反应体系及扩增程序如上文所示，得到构建载体的dschs1和dsgfp的目的片段，用dna纯化回收试剂盒(universaldnapurificationkit,tiangen)回收上述得到的两种pcr产物。根据两个酶切位点的序列利用quickcut^tmsaci和quickcut^tmbamhi将l4440载体线性化，酶切的反应体系详见说明书，酶切反应完成后，用dna纯化回收试剂盒(universaldnapurificationkit,tiangen)回收线性化的l4440载体。

利用广州擎科生物科技有限公司的trelief^tmsosoocloningkitver.2试剂盒分别将dsgfp和dschs1与线性化的l4440载体在50℃反应20min，进行重组。随后将含有dschs1和dsgfp的重组表达载体导入到ht115感受态细胞中，置于冰上放置30min，随后37℃热激1min；在冰上静置3min，然后加入不含氨苄的lb液体培养基700μl，在37℃，210rpm的条件下培养1h，之后用含有氨苄和四环素的lb平板过夜培养。挑取单菌落放置在4ml含有氨苄(100μg/ml)和四环素(10μg/ml)的lb液体培养基中，37℃，210rpm培养12h，然后取50μl转移到5ml含有氨苄(100μg/ml)和四环素(10μg/ml)的lb液体培养基中，37℃，210rpm培养3h，使菌液的od值在0.5-0.8之间，加入1mm的iptg，37℃，120rpm培养5h，诱导dsrna。

将含有dsgfp和dschs1的两种菌液，在4℃，5000rpm的条件下收集菌丝，利用trizol提取法(invitrogen,usa)提取rna，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，验证是否成功诱导dsrna。

5、结果

用p1引物进行扩增，得到大小为458bp的pcr扩增产物，经测序并删去t7启动子序列后，得到大小为418bp的核苷酸序列即为目的基因chs1，如seqidno.1所示。以载有gfp的质粒为模版，用p2引物进行扩增，得到大小为507bp的pcr产物，dsgfp和dschs1的目的条带与测序结果相符。

利用菌液表达目的基因的dsrna，提取菌丝的rna，利用琼脂糖凝胶电泳验证是否成功诱导出目的基因的dsrna，根据电泳结果(图1)可以看到成功诱导出dsgfp和dschs1的目的条带。

实施例2dsrna对茄二十八星瓢虫的抑制作用

1、试剂盒合成的dsrna在抑制茄二十八星瓢虫生长发育中的应用

茄二十八星瓢虫dschs1喂养组：在放有滤纸和加湿棉球的培养皿中放入10只茄二十八星瓢虫的1龄幼虫。分别用浓度50ng/μl、250ng/μl和500ng/μl的dschs1溶液浸泡直径12mm的圆形茄子叶盘1min，室温风干1h后饲喂幼虫，每隔24h更换一次叶盘，连续饲喂dschs1浸泡的叶盘两天后，用正常茄子叶片饲喂幼虫。

茄二十八星瓢虫dsgfp喂养组：在放有滤纸和加湿棉球的培养皿中放入10只茄二十八星瓢虫的1龄幼虫。用试剂盒合成的浓度500ng/ul的dsgfp溶液浸泡直径12mm的圆形茄子叶片1min，风干1h后饲喂幼虫，每隔24h更换一次叶盘，连续饲喂dsgfp浸泡的叶盘两天后，用未经处理的茄子叶片饲喂幼虫。

每组设置5个重复，每隔24h统计每个培养皿中茄二十八星瓢虫的死亡数目，并更换新的叶片，培养皿置于人工气候箱(温度25±1℃，湿度70％-80％，光周期l：d＝14：10)。统计各组每个培养皿中茄二十八星瓢虫的死亡个数，计算对照组和不同浓度dsrna处理下茄二十八星瓢虫的存活率变化。

2、菌液表达的dschs1对茄二十八星瓢虫致死效应的应用

茄二十八星瓢虫dschs1喂养组：在放有滤纸和加湿棉球的培养皿中放入10只1龄幼虫、10只3龄幼虫、5只成虫，一共设置3组实验，每组设置5个重复。用表达dschs1的菌液浸泡直径12mm的圆形茄子叶片1min，室温风干1h后饲喂幼虫。处理组中的1龄幼虫每个培养皿中放置2片叶盘；3龄幼虫的每个培养皿中放置5片叶盘；成虫的每个培养皿中放置5片叶盘。每隔24h更换一次叶盘，连续饲喂dschs1菌液浸泡的叶盘两天后，用正常茄子叶片饲喂。

茄二十八星瓢虫dsgfp喂养组：在放有滤纸和加湿棉球的培养皿中放入10只1龄幼虫、10只3龄幼虫、5只成虫，一共设置3组对照，每组设置5个重复。用表达dsgfp的菌液浸泡直径12mm的圆形茄子叶片1min，室温风干1h后饲喂幼虫。对照组中的1龄幼虫每个培养皿中放置2片叶盘；3龄幼虫的每个培养皿中放置5片叶盘；成虫的每个培养皿中放置5片叶盘。每隔24h更换一次叶盘，连续饲喂dsgfp菌液浸泡的叶盘两天后，用正常茄子叶片饲喂。

每隔24h统计每个培养皿中茄二十八星瓢虫的死亡数目，并更换新的叶片，培养皿置于人工气候箱(温度25±1℃，湿度70％-80％，光周期l：d＝14：10)。统计各组每个培养皿中茄二十八星瓢虫的死亡个数，计算对照和不同处理组茄二十八星瓢虫存活率的变化。

3、根据统计的结果可知，连续饲喂茄二十八星瓢虫1龄幼虫dschs1两天后，茄二十八星瓢虫1龄幼虫的存活率随着时间的增加而呈现下降的趋势，处理组的饲喂浓度分别是50ng/μl、250ng/μl和500ng/μl，对照组的饲喂浓度为500ng/μl。根据图2的结果，发现不同浓度的处理组与对照组之间均存在显著差异(χ2＝98.373,df＝3,p<0.0001)，处理组饲喂浓度50ng/μl(p<0.0001,exp(b)＝4.185)、250ng/μl(p<0.0001,exp(b)＝6.189)和500ng/μl(p<0.0001,exp(b)＝26.214)，3个不同浓度的处理组之间均存在显著差异。从统计的结果中可以得到以下结论，当处理组的浓度分别为50ng/μl，10ng/μl，5ng/μl时与对照组相比死亡率分别增加4.185倍，6.189倍和26.214倍。

根据统计的结果可知(如图3)，连续饲喂茄二十八星瓢虫菌液表达的dschs1两天后，1龄幼虫(p<0.0001,exp(b)＝11.297)和3龄幼虫(p<0.0001,exp(b)＝7.748)的存活率和对照组相比均存在显著性的差异，处理组成虫的存活率和对照组相比没有差异。处理组的1龄幼虫和3龄幼虫与对照组相比死亡率分别增加了63.217倍和65.528倍。

另外，用显微镜观察饲喂dschs1两天后，茄二十八星瓢虫表型特征的变化。发现从饲喂dschs1开始的第3天，dsgfp对照组的茄二十八星瓢虫正常进入2龄阶段，处理组中的幼虫无法正常蜕皮进入2龄阶段而死亡，表型特征表现为幼虫前胸背板的枝刺和斑点无法形成如图4所示，说明取食dschs1能够在茄二十八星瓢虫的体内引发强烈的rnai效应，导致瓢虫死亡。

实施例3dschs1抑制茄二十八星瓢虫体内chs1基因的表达

1、实验方法

分别在开始取食dsrna后的第2天和第4天，收集用250ng/μldschs1和dsgfp处理的茄二十八星瓢虫1龄幼虫，每个处理收集3个生物学重复。提取收集的茄二十八星瓢虫的rna，然后反转录成cdna，稀释10倍作为qpcr的模版。以p5和p6作为引物进行相对定量qpcr分析。qpcr体系为(15μl)包含5.25μl的ddh2o，7.5μl的2×sybrgreenmastermix(bio-radinc,hercules,ca)4μm引物和1.0μl的cdna第一链模版。qpcr的反应仪器bio-radc1000real-timepcrsystem(bio-rad,usa)。反应条件为95℃5min；95℃10s，60℃30s，39个循环，每个样本3个技术重复，反应在96孔板(bio-rad,usa)中进行。

2、实验结果

以饲喂dsgfp为对照，分别统计饲喂dschs1后在第2天和4天，茄二十八星瓢虫体内chs1基因的相对表达量变化(如图5所示)。图5中表明，从饲喂dschs1开始的第2天，chs1的表达量与对照组没有显著差别(f1,4＝0.901,p＝0.396)；从饲喂dschs1开始的第4天，chs1的表达量与对照组相比下降了2.83倍(f1,4＝222.698,p<0.0001)，进一步说明通过饲喂dschs1能够在茄二十八星瓢虫体内引起强烈的rnai效应，导致体内chs1基因的表达量明显降低，进而导致茄二十八星瓢虫发育受到抑制或死亡。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>华南农业大学

<120>茄二十八星瓢虫生长发育相关基因chs1及其应用

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<213>chs1基因片段

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