一种对非洲猪瘟病毒基因I型和II型的快速鉴别诊断方法与流程

本发明属于家禽病害检测技术领域，具体涉及一种对非洲猪瘟病毒基因i型和ii型的快速鉴别诊断方法，即基于探针导向的重组酶介导的等温扩增技术应用于检测非洲猪瘟病毒基因i型和ii型特异差异位点和快速鉴别诊断方法。

背景技术：

非洲猪瘟(asf)是由非洲猪瘟病毒(asfv)引起的猪的急性、接触性传染病，主要特征是高热、皮肤发绀以及淋巴结和内脏器官的严重出血，死亡率可高达100％，被世界动物卫生组织(oie)列为a类传染病。由于该病毒特殊的免疫逃避机制，目前尚无有效治疗手段。因此对该病毒的检测检疫显得尤为重要。

非洲猪瘟病毒只有1个血清型，但利用编码vp72蛋白的b646l基因可以将现有流行毒株分为24个基因型。1957年，非洲猪瘟病毒基因i型首次从非洲大陆传出，先后在欧洲、拉丁美洲流行，迄今仍在非洲和意大利撒丁岛等地呈地方性流行。2007年，非洲猪瘟病毒基因ii型首次从非洲大陆蔓延到其他洲，先后在欧洲、亚洲流行。特别是2018年8月3日在我国首次报道了非洲猪瘟疫情，为基因ii型非洲猪瘟病毒。不同的基因型的asfv毒株分布有一定的区域性特点，鉴于非洲猪瘟病毒基因i型、ii型在非洲以外的其他大陆呈蔓延之势，通过快速鉴别分析基因型差异，可以进一步了解毒株在相应地区的分布以及流行趋势,追溯疫源及其可能的传播方式，以便及时采取应对措施。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种对非洲猪瘟病毒基因i型和ii型的快速鉴别诊断方法，基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测特异差异位点，所述探针既可以作为探针产生荧光信号使用，又可以作为引物使用，从而简化raa检测方法所需引物组分。

本发明提供了一种重组酶介导的等温扩增法检测的探针，所述的探针中在待检测的特异差异位点的后一位碱基被四氢呋喃替代，探针的5’端距四氢呋喃位点至少间隔30个碱基，3’端距四氢呋喃位点至少间隔15个碱基；所述探针修饰有荧光基团和猝灭基团；所述的荧光基团和猝灭基团分别修饰在四氢呋喃位点的上下游的t碱基上；

所述的荧光基团修饰在四氢呋喃3’端方向的任一t碱基上，猝灭基团修饰在特异差异位点的5’端方向任一t碱基上；

荧光基团修饰的t碱基与猝灭基团修饰的t碱基间隔2～5个碱基；

优选的，所述荧光基团修饰在四氢呋喃位点的上一位t碱基上。

优选的，所述猝灭基团修饰在特异差异位点的下一位t碱基上。

优选的，所述荧光基团包含有6-羧基荧光素或六氯-6-甲基荧光素；所述淬灭基团包含有bhq猝灭基团。

优选的，探针的3’末端碱基由磷酸盐阻滞剂进行修饰。

当检测序列为seqidno：4的asfvb646l基因时，所述探针包括两条，分别具有如序列表中seqidno：1所示的核苷酸序列和具有如序列表中seqidno：2所示的核苷酸序列，所述特异差异位点是220位核苷酸，为a或g(r)。

本发明另一个方面还提供了基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测特异差异位点的诊断方法，包括10～100μmol/l的上游引物和10～100μmol/l上述的探针；所述上游引物用于与探针起来扩增包含有特异差异位点的核酸片段；

其一种具体上游引物为序列表中seqidno.3所示的核苷酸序列。

优选的，所述诊断方法还包括酶混合物、反应缓冲液、280mmol/l醋酸镁；所述酶混合物包括800ng/μl的单链结合蛋白，60ng/μl的噬菌体uvsx蛋白，50ng/μldna聚合酶和40ng/μl外切酶iii。

本发明提供了基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测特异差异位点用探针，所述探针在重组酶介导的等温扩增法用探针的基础上，将特异差异位点后一位碱基的后一位碱基被四氢呋喃替代，外切酶iii从探针的3’端进行切割，到四氢呋喃位点切割中断，切掉的荧光基团修饰的碱基在体系中产生荧光信号，发挥探针的作用；余下的探针部分充当下游引物，当特异差异位点的探针与样品中特异差异位点发生正确配对时，余下的探针作为下游引物进行扩增延伸，而不正确配对的碱基无法正常扩增。所述探针既可以作为探针产生荧光信号使用，又可以作为引物使用，减省了检测过程中必需下游引物组分，同时避免了探针与引物发生非特异性扩增。同时本发明提供的探针与下游引物联合使用，打破了以往在上游引物3’末端与特异差异位点配对的设计思路，实现对特异差异位点检测，同时能够准确、快速得到样品的基因型。

附图说明

图1为本发明中raa探针设计原则示意图；

图2为不同基因型和浓度引物探针组合在a、g反应的扩增情况；其中图2-1为asfv基因i型样品在a、g反应中扩增情况；图2-2为asfv基因ii型样品在a、g反应中扩增情况；图2-3为asfv基因i型在不同浓度引物探针组合a、g反应中扩增情况；图2-4为asfv基因ii型在不同浓度引物探针组合a、g反应中扩增情况。

图3为实施例1中不同浓度质粒在raa检测的准确度评估，其中图3-1为不同浓度的asfvi型质粒在a反应中的扩增情况；图3-2为不同浓度的asfvi型质粒在g反应中的扩增情况；图3-3为不同浓度的asfvii型质粒在g反应中的扩增情况；图3-4为不同浓度的asfvii型质粒在a反应中的扩增情况。

图4为实施例2中本方法a反应、g反应对非洲猪瘟病毒(asfv)i型、ii型、口蹄疫病毒(fmdv)、猪细小病毒(ppv)、伪狂犬病毒(prv)、猪圆环病毒(pcv)、流行性乙型脑炎病毒(jev)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrv)、猪瘟病毒(csfv)、传染性胃肠炎病毒(tgev)、阴性对照水中的特异性检测；其中图4-1为a反应的特异性检测，只有asfv基因i型出现明显的扩增线，说明a反应检测asfv基因i型的特异性良好；图4-2为g反应的特异性检测，只有asfv基因ii型出现明显的扩增线，说明g反应检测asfv基因ii型的特异性良好。

图5为实施例3中asfvi、ii型临床样本核酸raa法和测序结果。

具体实施方式

本发明所涉及的名词记载如下：

1、单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，特异差异点snp)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性，占所有已知多态性的90％以上。特异差异位点是在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。

2、重组酶介导的等温扩增法(recombinaseaidedamplification，raa)，raa使用从细菌或真菌中获得的重组酶，在39℃恒温下，该重组酶可与引物dna紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板dna上搜索到与之完全互补的序列时，在单链dna结合蛋白(single-strandeddnabinding，ssb)的帮助下，使模板dna解链，并在dna聚合酶的作用下，形成新的dna互补链，反应产物同样以指数级增长。通常在30min内可以完成检测，同样它也可以通过添加带有荧光标记的探针来检测产物的实时扩增。但尽管raa检测方法具有较高的灵敏度和特异度，但是传统的raa检测方法依赖于设计一对扩增引物和一条探针，而且避免引物产生非特异性扩增及引物与探针的非特异性结合，这对引物和探针的要求较高。

本发明提供了基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测特异差异位点用探针，所述探针的长度为46～52nt，其中特异差异位点的后一位碱基被四氢呋喃替代，探针的5’端距四氢呋喃位点至少间隔30个碱基，3’端距四氢呋喃位点至少间隔15个碱基；所述探针修饰有荧光基团和猝灭基团，所述荧光基团修饰在四氢呋喃位点的3’端t碱基上，所述猝灭基团修饰在特异差异位点的5’端t碱基上；荧光基团修饰的碱基与猝灭基团修饰的碱基间隔2～5个碱基。

在本发明中，所述探针的设计思路见图1所示。在本发明中，所述探针的核苷酸序列是5’端向3’端方向排列。所述荧光基团修饰优选在四氢呋喃位点的下一位t碱基上。所述猝灭基团优选修饰特异差异位点的上一位t碱基上。

在本发明中，所述荧光基团优选包括fam(6-羧基荧光素)或hex(六氯-6-甲基荧光素)；所述淬灭基团包括bhq。

在本发明中，探针的3’末端碱基优选由磷酸盐阻滞剂修饰。所述磷酸盐阻滞剂修饰的作用是防止聚合酶可能引导的扩增。

在本发明中，所述探针中荧光基团和淬灭基团修饰的碱基必须为t碱基上，依照模板正负链中特异差异位点前后a和t碱基的分布情况，所述探针优选包括正向探针和反向探针。所述正向探针与模板的负链结合。所述正向探针中设计包含特异差异位点。所述反向探针与模板的正链结合。所述反向探针中设计包含特异差异位点互补位点。所述模板中特异差异位点或特异差异互补位点的前后存在a碱基就可以满足探针的构建。

在本发明中，当检测基因为asfvb646l基因序列时，所述特异差异位点表现为a/g多态性时，所述特异差异位点互补碱基对应为t/c，满足反向探针的构建。检测asfv基因i型(特异差异位点为a)和ii型(特异差异位点为g)基因特异差异位点用反向探针优选为具有如序列表中seqidno：1所示的核苷酸序列和具有如序列表中seqidno：2所示的核苷酸序列。模板asfvb646l基因序列具有如序列表中seqidno：4所示的核苷酸序列。所述探针和上游引物的序列具体如下表1所示：

其中a代表a,g反应所用的正向引物；b代表a反应的特异性探针；c代表g反应的特异性探针；d代表探针的修饰:fam(6-羧基荧光素)代表荧光基团；thf(四氢呋喃)；bhq代表淬灭基团；

以检测asfvb646l基因序列(seqidno：4)为例，说明探针的反应原理。当样品中为asfv基因i型时，即发生a反应，分别向两个扩增反应体系中添加两个探针，添加627-a-p^b,d的探针中特异差异位点互补碱基为t，能够与模板中的a碱基互补配对，外切酶iii切割到thf位点中断，余下的探针的3’端能够与模板严格互补配对，因此余下的探针作为下游引物进行延伸扩展，产生扩增曲线；而另一个体系中添加的628-g-p^c,d探针，特异差异位点互补碱基为c，不能与模板中特异差异位点的a碱基严格互补配对，相比互补碱基t无法正常扩增。当样品中为asfv基因ii型时，添加的628-g-p^c,d探针的体系能够正常扩增，发生g反应，产生扩增曲线。添加627-a-p^b,d的探针的体系相比互补碱基c无法正常扩增。因此，根据是否产生扩增曲线的有无或出现的早晚及使用的探针种类判断基因型。

本发明提供了基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测非洲猪瘟病毒基因i型和ii型之间特异差异位点的诊断方法，包括10～100μmol/l的上游引物和10～100μmol/l的所述下游引物/探针。

在本发明中，所述上游引物与所述下游引物/探针以不同正负链的模板设计得到，即当所述下游引物/探针以负链作为模板设计时，所述上游引物以正链为模板设计得到。本发明对所述设计引物的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物设计方法即可。本发明对所述上游引物的合成没有特殊限制，委托本领域所熟知的引物合成公司即可。在本发明实施例中，所述探针委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

所述上游引物的浓度优选为15μmol/l。当检测asfvb646l基因序列的特异差异位点时，所述上游引物优选具有如序列表中seqidno.3所示的核苷酸序列。

在本发明中，所述诊断方法包括所述探针。所述探针的下游引物/浓度独立优选为15μmol/l。所述探针为两条，优选独立分装。

在本发明中，所述诊断方法优选还包括酶混合物、反应缓冲液和280mmol/l醋酸镁；所述酶混合物包括800ng/μl的单链结合蛋白，60ng/μl的噬菌体uvsx蛋白，50ng/μldna聚合酶和40ng/μl外切酶iii。本发明对所述酶混合物、反应缓冲液和醋酸镁的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶混合物、反应缓冲液和醋酸镁的来源即可。在本发明实施例中，所述酶混合物、反应缓冲液和醋酸镁分别选自江苏奇天基因公司生产的raa荧光法基础反应单元试剂盒。

所述诊断方法的检测原理是在传统的raa检测方法的基础上进行了改进，利用未水解的部分探针作为下游引物扩增，得到一种新的检测方法，即探针导向的重组酶介导的等温扩增法(raa)。

在本发明中，所述诊断方法的使用方法，包括以下步骤：

1)将酶混合物、反应缓存液、无核酶水、醋酸镁、模板dna和上游向引物进行混合，将得到的混合液均分成3份，分别向2份混合液中各加入一种探针，向另一份混合液中加入无核酶水作为对照；

2)将3份混合液进行等温扩增,得到扩增情况。

在本发明中，所述上游引物和下游引物/探针浓度优选为15μmol/l。所述模板dna的浓度优选为10～75ng/μl。所述醋酸镁的浓度优选为280mmol/l。所述等温扩增用仪器没有特殊限制，采用本领域所熟知的等温扩增用仪器即可。在本发明实施例中，所述等温扩增用仪器为江苏奇天公司生产的qt-raa-f7200荧光检测仪。所述反应温度优选为39℃。所述等温扩增的时间优选为25min。

如图2为不同基因型和浓度引物探针组合在a、g反应的扩增情况；其中图2-1为asfv基因i型样品在a、g反应中扩增情况，当样品为asfvi型时，a反应扩增线条先出；图2-2为asfv基因ii型样品在a、g反应中扩增情况，当样品为asfvii型时，g反应扩增线条先出；图2-3为asfv基因i型在不同浓度引物探针组合a、g反应中扩增情况，当样品为asfvi型时，引物探针浓度选15μm时，a反应和g反应扩增线条先后区分明显；图2-4为asfv基因ii型在不同浓度引物探针组合a、g反应中扩增情况，当样品为asfvii型时，引物探针浓度选15μm时，g反应和a反应扩增线条先后区分明显。

下面结合实施例对本发明提供的基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测特异差异位点用探针和诊断方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

为了进一步探究样本浓度对raa方法特异性的影响，本发明构建了asfv基因i型和ii型质粒，分别对其进行了一系列的稀释，包括了10⁵,10⁴,10³,10²，10¹拷贝/反应，然后分别用raa方法(a和g反应)进行了检测(图3)。

其中图3-1为不同浓度的asfvi型质粒在a反应中的扩增情况，浓度为10²-10⁵的asfvi型质粒在a反应中扩增梯度明显；图3-2为不同浓度的asfvi型质粒在g反应中的扩增情况，浓度为10¹-10⁵的asfvi型质粒在g反应中扩增梯度不明显，只有10⁴-10⁵的扩增线较明显，并且比图3-1中a反应扩增线后出；图3-3为不同浓度的asfvii型质粒在g反应中的扩增情况，浓度为10¹-10⁵的asfvii型质粒在g反应中扩增梯度明显；图3-4为不同浓度的asfvii型质粒在a反应中的扩增情况，扩增梯度不明显，只有10⁴-10⁵的扩增线较明显，并且比图3-3中g反应扩增线后出。对于质粒来说，发现a，g反应所能检测到的模板下限均在10²拷贝/反应(图3)。提示raa方法可能在模板拷贝数位于10²～10⁵时具有较高特异性。

实施例2

为了探究a反应和g反应的特异性，以非洲猪瘟(asfv)i、ii型基因、口蹄疫(fmd)、猪细小病毒(ppv)、伪狂犬病毒(prv)、猪圆环病毒(pcv)、流行性乙型脑炎(jev)、蓝耳病(prrv)、猪瘟病毒(csfv)、传染性胃肠炎病毒(tgev)的核酸作为模板，进行raa方法(a和g反应)检测(图4)。

其中图4-1为a反应的特异性检测，只有asfv基因i型出现明显的扩增线，说明a反应检测asfv基因i型的特异性良好；图4-2为g反应的特异性检测，只有asfv基因ii型出现明显的扩增线，说明g反应检测asfv基因ii型的特异性良好。

实施例3

1、临床标本的收集

通过天隆自动核酸提取仪提取猪组织及全血样本中的dna，并放入-20℃保存待用。所得标本的dna浓度范围10～75ng/μl。

2、对20例临床标本进行raa检测

采用江苏奇天基因公司生产的raa荧光法基础反应单元试剂盒。a、c反应均在一个0.2ml的反应管中进行，该管包括了预先进行冻干的酶混合物(ssb,uvsx,dnapolymerase,exonucleaseiii),然后加入25μl反应缓存液，17μl无核酶水，2.1μl正向引物(15μm)，1.4μl相应特异性反向探针(15μm)，2μl模板(10～75ng/μl)，2.5μl醋酸镁(280mm)。配液完成后转入到江苏奇天公司生产的qt-raa-f7200荧光检测仪上进行检测，39℃条件下反应25min。每次反应均由无核酶水作为阴性对照。

3、raa的结果及分析

a和g反应的阳性通过反应出现特异性曲线的先后来判定，反应时间为25min。例如，如果a反应先出现特异性曲线，那么判定为asfv基因i型；如果g反应先出现特异性曲线，那么判定为asfv基因ii型。

对比实施例

1、对检测的临床标本其中4例进行直接测序

采用takalaextaqhotstartversion(大连宝生物工程有限公司)的pcr诊断方法，配置25μl的pcr反应体系，其中包含无核酶水16.375μl,10×pcr反应缓冲液2.5μl,dntp2μl，taq酶0.125μl,相应的上下游引物1μl(10μmol/l)，模板3μl(50-150ng/μl)。pcr反应条件：95℃预变性5min；进入循环：94℃变性30s，58℃30s，72℃30s,40个循环；72℃7min；最后4℃保存。委托青岛市睿博兴科测序公司对全部样本pcr后进行sanger测序。

2、测序结果及分析

图5-1和5-2分别为asfvi、ii型临床样本核酸raa和测序结果，用raaa反应检测出的asfvi型核酸和g反应检测出的asfvii型核酸与测序结果的准确度一致。

序列表

<110>中国动物卫生与流行病学中心

<120>一种对非洲猪瘟病毒基因i型和ii型的快速鉴别诊断方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>51

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tcatcgcacccggatcatcgggggttttaattncattgcctccgtagtgga51

<210>2

<211>51

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tcatcgcacccggatcatcgggggttttaatcncattgcctccgtagtgga51

<210>3

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tacagctcttccagacgcatgttcatctatatc33

<210>4

<211>417

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

atgcagcccactcaccacgcagagataagctttcaggatagagatacagctcttccagac60

gcatgttcatctatatctgatattagccccgttacgtatccgatcacattacctattatt120

aaaaacatttccgtaactgctcatggtatcaatcttatcgataaatttccatcaaagttc180

tgcagctcttacatacccttccactacggaggcaatgcgattaaaacccccgatgatccg240

ggtgcgatgatgattacctttgctttgaagccacgggaggaataccaacccagtggtcat300

attaacgtatccagagcaagagaattttatattagttgggacacggattacgtggggtct360

atcactacggctgatcttgtggtatcggcatctgctattaactttcttcttcttcag417