一种利用凝胶迁移检测H7N9亚型禽流感病毒基因组vRNA-vRNA相互作用的方法与流程

本发明涉及病毒分子生物学技术领域，具体涉及一种利用凝胶迁移检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法。

背景技术：

h7n9亚型禽流感病毒自2013年出现以来一直周期性流行至今，且范围在不断的扩大，不仅给养禽业带来了巨大的经济损失，也对人类健康造成了巨大的威胁。因此需要加大h7n9亚型禽流感病毒的研究力度，防止其在人际中大流行。

流感病毒基因组rna(viralrna,vrna)经特异的选择性包装过程进入子代病毒粒子。基因组内各片段之间存在vrna-vrna相互作用，目前尚未阐明这种特异性相互作用是否直接影响新型重排h7n9病毒的产生。因此，探究重排h7n9病毒的vrna-vrna相互作用对了解其重排机制具有重要意义。

凝胶迁移试验(electrophoreticmobilityshiftassay,emsa)是检测蛋白质-核酸、核酸-核酸相互作用的快速且灵敏的方法，具有技术操作简单、结果稳定、可适应各种结合条件等优点。

目前，核酸水平研究a型流感病毒vrna-vrna相互作用主要利用体外实验技术：通过emsa鉴定vrna间的相互作用，利用部分片段缺失、寡聚核苷酸定位及生物信息学软件预测确定相互作用序列，之后引入突变检测相互作用序列的功能。该技术已应用于h3n2和h5n2的检测。

基于不同病毒的基因组rna序列结构等特点，不同亚型流感病毒的vrna-vrna互作方式和互作条件存在较大差异。目前，尚无在体外检测重排h7n9亚型流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的有效方法。因此，开发高效特异的h7n9亚型流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的检测方法对于h7n9亚型流感病毒的进化和基因组重排机制研究具有重要意义。

技术实现要素：

为解决现有技术中的技术问题，本发明的目的在于提供一种利用凝胶迁移技术、高效特异检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种利用凝胶迁移检测h7n9亚型禽流感病毒rna相互作用的方法，其为：将h7n9亚型禽流感病毒的待测rna对经变性、杂交后进行凝胶迁移，分析所述待测rna对的相互作用。

本发明首先对杂交反应体系进行了优化，发现采用如下杂交反应缓冲液能够有效降低rna之间的非特异性结合，更好地保证杂交反应的特异性和敏感性，以及杂交条带的清晰度和完整性。

所述杂交的杂交反应缓冲液包括如下组分：二甲基胂酸、kcl和mgcl2；所述二甲基胂酸在杂交反应体系中的终浓度为10～12mm，kcl在杂交反应体系中的终浓度为60～65mm，mgcl2在杂交反应体系中的终浓度为1～2mm。

作为优选，所述二甲基胂酸在杂交反应体系中的终浓度为10mm，kcl在杂交反应体系中的终浓度为60mm，mgcl2在杂交反应体系中的终浓度为1mm。

进一步优选地，所述杂交反应液的ph为7.5。

作为优选，所述杂交为在52～55℃下反应25～30min。在上述条件下杂交能够在保证具有相互作用关系的rna的充分结合的情况下，同时控制非特异性结合，更好地保证杂交反应的特异性和敏感性，以及杂交条带的清晰度和完整性。

作为优选，所述变性为在80～85℃下反应2～3min。在上述条件下变性能够更好地保证h7n9亚型禽流感病毒的rna的二级结构充分打开，为杂交反应提供有利条件，提高杂交的敏感性和特异性。

作为本发明的优选实施方式，所述利用凝胶迁移检测h7n9亚型禽流感病毒rna相互作用的方法包括如下步骤：

(1)体外转录模板的制备：采用特异性引物扩增获得ha、na、pb2、pb1、pa、np、m、ns基因中的任意两个，分别连接至载体后将载体线性化得到模板dna；

(2)h7n9亚型禽流感病毒rna的制备：以步骤(1)制备的线性化载体为模板，以ntp为原料进行体外转录制备h7n9亚型禽流感病毒rna；

(3)rna变性和杂交：将所述h7n9亚型禽流感病毒rna在85℃下变性2～3min，冰上放置2～3min，加入所述杂交反应缓冲液，在55℃下反应25～30min；

(4)凝胶迁移：低温条件下进行凝胶迁移，根据凝胶迁移率变化分析待测rna对的相互作用。

本发明通过优化和筛选，获得了分别扩增h7n9亚型禽流感病毒的8个基因的特异性引物对。

作为优选，上述步骤(1)中，所述ha、na、pb2、pb1、pa、np、m、ns基因的特异性引物的序列分别如seqidno.1-16所示。

其中，ha基因的特异性引物如seqidno.1-2所示，na基因的特异性引物如seqidno.3-4所示，pb2基因的特异性引物如seqidno.5-6所示，pb1基因的特异性引物如seqidno.7-8所示，pa基因的特异性引物如seqidno.9-10所示，np基因的特异性引物如seqidno.11-12所示，m基因的特异性引物如seqidno.13-14所示，ns基因的特异性引物如seqidno.15-16所示。

进一步优选地，上述步骤(1)中，提取h7n9亚型禽流感病毒提取其全基因组rna，将全基因组rna反转录得到cdna，以cdna为模板，扩增ha、na、pb2、pb1、pa、np、m、ns基因，与pspt19质粒连接。

作为优选，上述步骤(2)中，所述体外转录为在37℃反应30-50min。所述体外转录的45μl反应体系为：5×转录缓冲液9μl，10mmntp8μl，线性化载体模板dna300ng，recombinantrnaseinhibitor1.5μl，t7rnapolymerase2μl，depc处理水补至45μl。

进一步优选地，上述步骤(2)中，将体外反转录得到的rna，通过rnase-freednasei消化除去模板，经纯化得到h7n9亚型禽流感病毒rna。

采用上述体外转录模板的制备和体外转录方法，更有利于得到纯度和浓度较高的h7n9病毒基因组rna片段，为rna相互作用的分析提供基础条件，更好地保证rna互作检测结果的特异性和敏感性。

作为优选，上述步骤(3)中，所述变性的8μl反应体系如下：成对的步骤(2)制备的h7n9亚型禽流感病毒rna各2pmol，250mmedta1μl，rnase-free水补至总体积。

作为优选，上述步骤(4)中，所述电泳迁移为采用1～1.5％的琼脂糖凝胶电泳1.5～2h。所述电泳的缓冲液包括如下组分50-60mmtris、40-45mm硼酸、0.1-0.15mmmgcl2。

进一步优选地，上述步骤(4)中，所述电泳的缓冲液包括如下组分50mmtris、44.5mm硼酸、0.1mmmgcl2。

进一步优选地，上述步骤(4)中，所述凝胶迁移为在4～6℃进行。

本发明中，发生相互作用的rna片段之间能够形成相互作用复合物，通过对电泳迁移结果进行观察以判断待测rna对之间是否发生rna-rna相互作用。

本发明的有益效果在于：

本发明利用凝胶迁移技术建立了检测h7n9病毒基因组内各vrna相互作用的方法。本发明筛选得到了h7n9亚型流感病毒各基因片段的特异性引物，构建了h7n9体外转录载体，并以此为模板进行体外转录，获得了高纯度高浓度的vrna。通过对变性、杂交等步骤的条件参数的全面、整体优化，显著提高了杂交的特异性和敏感性，检测得到的rna条带清晰、完整，进而显著提高了vrna-vrna相互作用检测的准确性。本发明提供的h7n9病毒rna的体外互作检测方法能够直观地观察到病毒rna在体外的相互作用情况，不需要进行同位素标记，具有较高的检测效率，能够更加安全、快速地检测h7n9病毒vrna-vrna相互作用，为鉴定新型h7n9亚型流感病毒的基因组各片段vrna-vrna相互作用网络提供有效方法。

附图说明

图1为本发明实施例1中利用凝胶迁移技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的流程图。

图2为本发明实验例1中利用实施例1提供的利用凝胶迁移技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法分析na基因和ha基因的vrna相互作用的结果图；其中，+代表加入相应基因的vrna，-代表未加入相应基因的vrna。

图3为本发明实验例1中利用实施例1和对比例1～5提供的利用凝胶迁移技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法分析na基因和np基因的vrna相互作用的结果图；其中，+代表加入相应基因的vrna，-代表未加入相应基因的vrna，温度为实施例1和各对比例使用的杂交温度。

图4为本发明实验例1中利用对比例6和7提供的利用凝胶迁移技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法分析na基因和np基因的vrna相互作用的结果图；其中，+代表加入相应基因的vrna或相应杂交缓冲液，-代表未加入相应基因的vrna或相应杂交缓冲液。

图5为本发明实验例2中对实施例1提供的利用凝胶迁移技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法进行检测敏感性分析的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，t7rna聚合酶是promega公司生产的，货号为p207e；dnasei是neb公司生产的，货号为r0303s；rna清洁纯化试剂盒是艾德莱公司生产的，货号为rn1401；低熔点琼脂糖是lon2a公司生产的，货号为50002。

实施例1利用凝胶迁移技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法

本实施例提供一种利用凝胶迁移技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法(流程如图1所示)，具体包括如下步骤：

(一)体外转录模板的制备

1、引物设计：分别针对h7n9亚型流感病毒8个基因(ha、na、pb2、pb1、pa、np、m、ns)的高度保守区域，设计8对扩增引物。引物均委托商家合成。各基因的特异性扩增引物见表1。

表18个基因pcr扩增所用特异性引物

2、病毒rna的提取与反转录

病毒rna提取(roche病毒rna提取试剂盒)

(1)取200μl病毒液加入400μlbindingbuffer，混匀，静置10min；

(2)将以上混合液过柱，12000r/min离心1min；

(3)将层析柱移到另一干净的收集管中，加入500μlinhibitorremovalbuffer，12000r/min离心1min；

(4)将层析柱移到另一干净的收集管中，加入450μlwashbuffer，12000r/min离心1min；

(5)重复操作(4)；

(6)弃去收集管中液体，12000r/min离心1min；

(7)再将层析柱移到1.5ml离心管中，加入50μlelutionbuffer，12000r/min离心1min。

反转录40应体系如下：rna抽提产物24μl，反转录引物uni122μl，5×m-mlvrtbuffer8μl，dntpmix4μl，m-mlvreversetranscriptase(rt)1μl，recombinantrnaseinhibitor(rri)1μl。

反应体系加完样后，瞬时离心。

反应程序如下：37℃反应1h，4℃保存。

3、pcr反应

以步骤2反转录得到的cdna为模板，分别采用表1中所示的各基因的特异性引物进行pcr扩增，得到ha、na、pb2、pb1、pa、np、m、ns基因片段(双链dna片段)。

每管反应体系为50μl，反应体系如下：fastpfuflydnapolymerase1μl，fastpfuflybuffer10μl，dntps4μl，上游引物1μl，下游引物1μl，cdna4μl，加双蒸水至终体积为50μl。

将反应体系混匀，并作好标记。

反应程序如下：94℃5min；94℃30s，50～58℃退火30s，72℃延伸1min-2min30s，共进行30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

以上反应程序中，退火温度根据各引物对的tm值计算，退火温度＝tm-5℃。

延伸时间根据各基因扩增片段的大小以及酶的扩增速度确定。

4、体外转录载体的制备

体外转录载体的构建方法如下：将上述步骤3扩增得到的各基因片段分别插入pspt19质粒的酶切位点之间，得到体外转录载体。

各基因插入的酶切位点如表2所示。

表28个基因插入pspt19质粒的酶切位点

5、体外转录载体的线性化

为获得特定长度的rna转录产物，需在插入位点下游选择合适的限制酶(切割产生平末端或5’-突出末端为佳)切割质粒dna使之线性化。

不同基因片段的体外转录载体线性化所用限制性内切酶以及buffer如表3所示：

表3体外转录载体线性化所用限制性内切酶

将含有目的片段的pspt19质粒酶切，使之线性化。酶切体系如表4所示：

表4体外转录载体线性化反应体系

酶切反应条件：37℃，3-5h。

将酶切后产物进行、切胶回收，再进行电泳鉴定。用nanodrop2000测定回收产物浓度，作为体外转录的模板。

(二)体外转录制备vrna

1、体外转录

以上述(一)中制备的体外转录模板作为模板进行各基因的vrna的体外转录，具体方法如下(采用以下操作方法可从1μgdna模板中制备10μgrna转录产物，反应体系可以放大或缩小)：

(1)解冻冻存的试剂，混匀后短暂离心；

(2)酶蛋白和核苷酸需冰上放置，反应缓冲液需室温放置；

(3)室温配制反应体系(如表5所示)；

表5体外转录的反应体系

(4)37℃孵育3小时。

2、消化dna模板

体外转录完成后，为得到纯度较高的rna，需消化dna模板。在体外转录产物中加入5μl10×dnaseⅰbuffer，1μldnaseⅰ，置于金属浴上反应15分钟后，获得的rna溶液，用nanodrop2000测定rna浓度，做好记录。

3、rna清洁纯化

使用rnacleanrna清洁纯化试剂盒最大限度的除去蛋白质、无机盐离子和许多有机杂质。清洁纯化步骤可在室温进行，但是应该迅速操作，减少rna降解机会，具体方法如下：

(1)冰上rna样品加入rnase-freewater补足至100μl，加入350μl溶液rc，混匀。

(2)加入250μl无水乙醇，混匀，无需离心。

(3)上一步所得溶液和可能有的沉淀一起转入吸附柱ra中(吸附柱套在收集管内)，4℃12000rpm离心45s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新套回收集管。如需除去dna微量残留，可在本步骤后进行dna酶柱子上直接消化。

(4)加0.5μl漂洗液rw(先检查是否已加入乙醇)，4℃12000rpm离心45s，弃废液。

(5)加0.5μl漂洗液rw，4℃12000rpm离心45s，弃废液

(6)4℃13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

(7)取出吸附柱ra，放入rnase-free离心管中，根据预期rna产量在吸附膜的中间部位加50-80μlrnase-freewater(事先在65-70℃水浴中加热效果更好)，室温放置2分钟。如需较多的rna，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟，或者另外在加入30μlrnase-freewater，离心1分钟，合并两次洗脱液。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要rna浓度较高，可适当减少洗脱体积，但是最小体积最好不少于30μl，体积过小降低rna洗脱效率，减少rna产量。

(8)获得的rna溶液，用nanodrop2000测定rna浓度,做好记录，-80保存。

(三)vrna的变性、杂交和电泳迁移率分析

1、预电泳

将配置好的1×tbm电泳缓冲液放在4℃预冷，使用该电泳缓冲液配制不含goldenview的1％的低熔点琼脂糖凝胶，待胶凝固后，在预冷的1×tbm电泳缓冲液中进行预电泳，电压为120v，电流为30ma，电泳时间为15分钟。

1×tbm电泳的缓冲液的组分如下：50mmtris、44.5mm硼酸、0.1mmmgcl2。

2、变性和杂交反应

将上述步骤(二)制备的、需要验证是否发生相互作用的h7n9亚型禽流感病毒的两种vrna样品(待测vrna对，分别命名为vrna1和vrna2)从-80℃冰箱中取出，放置在冰上融化，配制如表6所示的rna-rna相互作用反应体系(8μl)。

表6vrna变性的反应体系

体系配制过程中使用无rna酶200μlep管与无rna酶枪头。体系配制完成后，轻弹管壁使体系混匀，瞬离。

提前打开金属浴升温至85℃，将配置好的变性反应体系样品置于85℃下变性2分钟，迅速放置在冰上，冰上静置2分钟。每管加入2μl的5×杂交反应缓冲液，轻弹管壁使体系混匀，瞬时离心；提前打开金属浴，将rna互作样品以55℃温育30分钟，使rna发生结合。

5×杂交反应的缓冲液(nahb1)的组分如下：二甲基胂酸50mm，kcl300mm，mgcl25mm，ph7.5。即杂交反应体系中，二甲基胂酸的浓度为10mm，kcl的浓度为60mm，mgcl2的浓度为1mm。

取出杂交后的rna样品后，迅速将样品与5×rnaloadingbuffer按比例混合，即每管加入2μl的5×rnaloadingbuffer，吹打混匀。将混合后的样品全部加入点样空中，点样时，使样品均匀铺在点样孔底部或者使用微量进样器直接在靠近点样孔底部的位置点样。4℃条件下进行电泳迁移，电压为120v，电流为30ma，电泳时间为1.5小时。

对比例1

本对比例提供一种利用凝胶迁移技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法，其与实施例1的区别仅在于：杂交反应为在33℃反应30min。

对比例2

本对比例提供一种利用凝胶迁移技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法，其与实施例1的区别仅在于：杂交反应为在37℃反应30min。

对比例3

本对比例提供一种利用凝胶迁移技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法，其与实施例1的区别仅在于：杂交反应为在41℃反应30min。

对比例4

本对比例提供一种利用凝胶迁移技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法，其与实施例1的区别仅在于：杂交反应为在45℃反应30min。

对比例5

本对比例提供一种利用凝胶迁移技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法，其与实施例1的区别仅在于：杂交反应为在50℃反应30min。

对比例6

本对比例提供一种定量检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法，其与实施例1的区别仅在于：使用的5×杂交反应的缓冲液(nahb2)的组分如下：二甲基胂酸50mm，kcl40mm，mgcl25mm，ph7.5；即杂交反应体系中，二甲基胂酸的浓度为10mm，kcl的浓度为8mm，mgcl2的浓度为1mm。

对比例7

本对比例提供一种定量检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法，其与实施例1的区别仅在于：使用的5×杂交反应的缓冲液(nahb3)的组分如下：二甲基胂酸50mm，kcl40mm，mgcl20.1mm，ph7.5；即杂交反应体系中，二甲基胂酸的浓度为10mm，kcl的浓度为8mm，mgcl2的浓度为0.02mm。

实验例1na基因和ha基因的vrna相互作用分析

利用实施例1提供的利用凝胶迁移技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法进行na基因和ha基因的vrna相互作用分析，结果如图2所示，vrna条带清晰完整，na基因的vrna与ha基因的vrna发生相互作用，ha基因与na基因的vrna-vrna相互作用较强。

分别利用实施例1和对比例1～7提供的利用凝胶迁移技术检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法进行na基因和np基因的vrna相互作用分析，其中，对比例1～5与实施例1的凝胶迁移检测的对比实验结果如图3所示；对比例6和7与实施例1的凝胶迁移检测的对比实验结果如图4所示；结果表明，采用实施例1的检测方法更有利于相互作用rna的结合，能够获得更清晰完整的vrna条带及更准确的vrna-vrna互作检测结果。

实验例2vrna-vrna相互作用检测方法的敏感性分析

以na和np基因的vrna相互作用检测为例分析实施例1的检测方法的敏感性。对于用于变性和杂交的na和np基因的vrna用量分别设置0.0625pmol、0.125pmol、0.25pmol、0.5pmol、1pmol、2pmol的用量梯度。结果如图5所示，结果显示，当vrna片段的量为0.5pmol时仍能检测到vrna-vrna相互作用，说明实施例1的方法用于检测vrna-vrna相互作用的敏感性较高。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种利用凝胶迁移检测h7n9亚型禽流感病毒基因组vrna-vrna相互作用的方法

<130>khp191113229.9

<160>16

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