H5n1型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法

专利名称：：H5n1型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法
技术领域：
：本发明涉H5N1型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法，更具体说是一种釆用超声乳化改性制备的量子点标记禽流感病毒单抗或多抗进行检观啲方法，属于检验检疫领域。
背景技术：
：禽流行性感冒(简称禽流感，avianinfluenza,AI)是由A型流感病毒引起的禽类烈性传染病，被国际兽疫局定为A类传染病，其中H5N1亚型禽流感是近年来爆发的最为频繁一种高致病性禽流感，给家禽业带来了巨大的经济损失，也威胁着人类的生命健康。随着我国也发现了人感染禽流感的病例，高致病性禽流感的防控工作尤为重要。禽流感的控制关键在于建立快速诊断禽流感病毒的方法，而现有的禽流感诊断技术不能满足我国高致病性禽流感的快速诊断的需要，因此,建立快速诊断禽流感技术已成为我国预防和控制高致病性禽流感的当务之急。对禽流感的快速检测是控制该病的根本前提。由于禽流感的临床症状和病理变化因感染禽的种类、龄期、病程长短、并发感染情况及感染毒株力等的不同而有所不同，因此，禽流感的症状一直依赖于病原的分离鉴定。目前禽流感的诊断的主要是通过病毒分离和血清学试验检测病毒或是检测感染鸡的抗体进行鉴定。其中血清学诊断包括琼脂扩散试验(AGP)、血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)、神经氨酸酶抑制试验(NI)、中和试验(NT)、免疫荧光技术(IFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等六种检测方法。近年来，随着分子生物学技术的发展，RT-PCR方法也逐渐应用于禽流感的检测。现有技术的不足之处在于1.病毒的分离鉴定是诊断AI的一种可靠方法，但病毒分离培养耗时长，至少需7d,不利于快速诊断和免疫程序的合理制定，难以胜任对高致病性AI快速诊断的需要。2.琼脂扩散(AGP)试验进行病毒抗原性特异性试验，此法虽然简单易行，但敏感性较差，易出现假阳性。在进行HA实验时，应先出去非特异性非凝集抑制因子。血凝实验(HA)和血凝抑制实验(HI)特异性好，但其过程繁琐费时，但其操作相对繁琐，同时必须具备一定血凝效价的标准病毒和新鲜制备的红细胞。血清学检査对最后确诊有回顾性的诊断价值，一般只能在发病23周甚至更长时间才能有抗体阳性出现。神经氨酸酶试验(NI)试验比HI试验复杂得多，一般的诊断实验室不能完成，应由专门从事禽流感检测的参比实验室完成。中和试验(NT)是一种比较敏感而特异的血清学方法，但是其操作繁琐、耗时费料，临床几乎不用。3.ELISA是近年来发展得较为成熟的一种方法，敏感性较高，缺点是试验的敏感性受样本质量的影响很大。阴性结果并不表明未感染禽流感病毒，只能解释为未检出。免疫荧光技术(IF)即荧光抗体(fluoresentantibody,FA)技术，是鉴定和定位流感病毒感染细胞中特异性的抗原，主要是流感病毒的核蛋白(NP)或基质蛋白(MP抗原)。禽流感病毒的检测通常采用的是直接荧光法，这种方法用于诊断具有快速、简便和敏感等特点，但是有时会出现假阳性(非特异性荧光)，间接免疫荧光技术也可以用来检测NP及MP抗原与抗体的反应，其敏感性很高。但对抗原制备要求较高，需用非离子型去污剂对纯化的病毒粒子进行裂解。4.RT-PCR方法是一种敏感特异的方法，灵敏度要高于ELISA，由于该技术条件要求高，且田间样本复杂多变,干扰大,样本处理难，因此大规模检测比较困难。纳米量子点(quantumdot,QD)又可称为半导体纳米微晶体(semiconductornanocrystal)，是一种由II-VI族或III-V族元素组成的稳定的、溶于水的、尺寸在220nm之间的纳米晶粒。目前研究较多的是CdS、CdSe、CdTe、ZnS等。近年来，半导体量子点由于其独特的性质越来越受到人们的重视，其研究内容涉及物理、化学、材料、生物等多学科，已成为一门新兴的交叉学科。量子点由于粒径很小，电子和孔穴被量子限域，连续能带变为具有分子结构的分立能级结构。因此光学行为与一些大分子很相似，可以发射荧光。与传统的荧光染料相比，量子点有很多优点无机微晶能够承受多次的激发和光发射，而有机分子却会分解.持久的稳定性可以让研究人员更长时间地观测细胞和组织，并毫无困难地进行界面修饰连接。量于点最大的好处是有丰富的颜色。生物体系的复杂性经常需要同时观察几种组分，如果用染料分子染色，则需要不同波长的光来激发，而量于点则不存在这个问题，使用不同大小(进而不同色彩)的纳米晶体来标记不同的生物分子。使用单一光源就可以使不同的颗粒能够被即时监控。并且从紫外线到红光，量子点有广泛的激发光谱范围，能够用量子点的大小和成分来调节激发光谱。同时量子点具有狭窄对称的荧光发射谱峰，这样就可以同时使用不同光谱特性的量子点，而发射光谱不出现重叠。因此，纳米量子点作为一种新型的荧光标记材料，在生物领域中的应用越来越受到了关泛的关注,特别是在临床诊断方法取得了长足的进展。
发明内容本发明要解决的第一个技术问题是提供一种H5N1型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法。本发明要解决的第二个技术问题是提供一种可用于标记抗体进行生物检测的新型水溶性羧基化纳米量子点。本发明要解决的第三个技术问题是提供超声乳化改性制备量子点的方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案H5N1型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法，包括如下步骤(1)制备和纯化H5N1型禽流感单克隆抗体或多克隆抗体；(2)制备水溶性羧基化纳米量子点；(3)纳米量子点标记H5N1型禽流感单克隆抗体或多克隆抗体；(4)样品测定。所述(1)制备和纯化H5N1型禽流感单克隆抗体的方法为用纯化浓缩的H5N1型禽流感病毒作为免疫抗原免疫8周龄Balb/c小鼠；获得免疫脾细胞与SP2/0细胞融合得到杂交瘤细胞；筛选阳性杂交瘤细胞的克隆进行培养获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞株注射入Balb/c小鼠腹腔以体外诱生腹水法获得含单克隆抗体的腹水；采用辛酸-饱和硫酸胺法浓縮和纯化腹水获得单克隆抗体。所述(1)制备和纯化H5N1型禽流感多克隆抗体的方法为用纯化浓缩的H5N1型禽流感病毒作为免疫抗原，免疫新西兰大白兔；10天后心脏采血，分离血清；饱和硫酸铵粗提多抗；DEAE-纤维素层析过柱后纯化的IgG置透析袋中，用固体聚乙二醇包埋进行浓縮获得多克隆抗体。所述(3)纳米量子点标记H5N1型禽流感单克隆抗体或多克隆抗体的方法为制备醛基化玻片；利用交联剂EDC和sulfo-NHS采用共价键连接的方法进行抗体的量子点标记。玻片由于样品不易在其表面渗透和扩散以及它的疏水性，特别是荧光背景低便于荧光观察等特点，因而被我们作为此课题研究中实验反应的载体。将玻片表面进行醛基化是在玻片表面固定蛋白最常用的途径。采用氨基硅烷和戊二醛先后进行氨基化和醛基化反应，在玻片表面形成活化的醛基，活化的醛基与蛋白质的氨基縮合反应，形成共价键的方法从而在玻片表面固定蛋白质。所述制备醛基化玻片是指将玻片用洗液(K2Cr0720g+浓H2S04350ml+H2040ml)浸泡过夜，然后用大量的去离子水冲洗，6(TC烘干2h后，将玻片浸入5。/。APTES的乙醇溶液中作用60min进行玻片表面的氨基化，取出水洗，晾干后，将玻片浸入含5%戊二醛的PBS(0.2mol/L,pH8.0)溶液中进行玻片的醛基化，PBS溶液清洗晾干后备用。EDC和量子点表面的羧基反应生成酰基异脲，但酰基异脲在水溶液中容易水解，又生成羧基产物。如果在溶液中加入sulfo-NHS，酰基异脲就极易和sulfo-NHS反应，生成具有胺反应活性的sulfo-NHS酯，sulfo-NHS酯与抗体表面的氨基反应生成稳定的酰胺，从而进行抗体的量子点标记。根据条件试验，我们最后确定的量子点标记抗体的实验条件为偶联剂EDC和sulfo-NHS的最佳使用浓度为2.OmM和5.OmM,量子点的浓度为3.0mM，抗体与量子点最佳的比例为3:1，抗体标记的最佳pH值为7.5，最佳的反应时间为2h。所述利用交联剂EDC和sulfo-NHS采用共价键连接的方法进行抗体的量子点标记是指在1.5ml的印pendorf中加入lml的活化缓冲液(0.1MMES，0.5MNaCl,P服.0)，然后加入加入适量的EDC和sulfo-NHS溶液；再在溶液中加入20ul量子点溶液，不停地混合溶液，室温下反应20min;加入1.4ul(20mM)2-巯基乙醇在室温下反应10min，得到活化的量子点溶液；在活化的量子点溶液中，加入lml含适量H5N1型禽流感抗体的PBS溶液(0.01M，pH7.5)，并用NaOH溶液调节PH至7.5，室温下搅拌反应2小时；4000，离心分离1分钟，除去小分子和未反应完全的抗体；用5ml去离子水溶解沉淀,重复对量子点标记的禽流感单克隆抗体溶液进行溶解/沉淀2次，最后用2ml去离子水溶解沉淀，4'C保存。所述(4)样品测定的方法为在醛基化的玻片表面滴加待检样品尿囊液，37°C孵育2h;用洗涤玻片3次，每次5min;然后在玻片表面滴加含5%BSA的PBS-Tween溶液，37i:孵育45rain;用0.01M，pH7.2的PBS洗涤玻片3次，每次5min后，加入量子点标记的禽流感抗体，37"孵育45min，用0.01M，pH7.2的PBS洗涤玻片3次，每次5min;室温下晾干后在荧光显微镜下观察，判断样品的阴阳性。一种可用于标记抗体进行生物检测的新型水溶性羧基化纳米量子点，采用如下方法制备得到。制备水溶性羧基化纳米量子点的方法，包括如下步骤(1)制备CdSe核壳量子点；(2)制备CdSe/CdS核壳量子点；(3)巯基乙酸修饰CdSe/CdS量子点；(4)双亲性高分子疏水自组装改性量子点；(5)超声乳化改性量子点。现在通常使用的量子点表面都被大量有机溶剂分子包覆而呈疏水性，而生物大分子或者药物一般是溶解或分散在水溶液中的，所以量子点与它们既不能充分接近更不能直接7有效的结合，因此要得到稳定的荧光探针，大多先要将量子点表面进行修饰。利用Zn、Cd等IIB族原子与硫原子之间有效的键合作用，用带巯基的双功能分子，如巯基羧酸类、二硫苏糖醇(DTT)、硫代胆碱等取代QDs表面的有机分子，以使其从疏水性转变为亲水性，然后通过另一端的功能基团可以与生物大分子连接，这种方法简单、重复性好。但由于使用的是小分子作为连接物，修饰以后原有的有机分子对量子点的保护和稳定作用得不到有效的替代，所以稳定性不好。用双亲性高分子疏水自组装改性量子点虽然所得的量子点粒径较小，但是此种方法纯化比较困难，且环境不友好。乳化有利于形成微胶囊的形成，然而，假如只是简单的机械搅拌，所形成的微胶囊体系不够稳定。超声作用有助于乳化且可以形成气穴，维持乳液稳定。所以我们采用超声乳化的方法来实现水溶性改性。采用的超声乳化改性制备的量子点具有方法创新性，高分子层较厚且严实致密，能更好的保护量子点，避免环境介质渗入而造成量子点的发光性能的破坏如光降解，光漂白，以及Cd离子的渗出而产生毒性；该方法纯化简单，只需离心，而一般水溶性改性(通过疏水作用自组装改性)需要过膜—浓縮一凝胶过滤一再浓縮等步骤；采用0/W法，有机溶剂用量少，省时节能，环境友好；疏水作用自组装修饰的纳米粒子表面不光滑，而超声乳化制备的纳米粒子表面光洁，不容易引起非特异性吸附，能更好的应用在生物检测方面。本文研制出了CdSe/CdS核壳量子点，并采用超声乳化的方法对量子点迸行了水溶性改性，建立了纳米量子点用于H5N1型禽流感病毒的检测方法。此检测方法检测速度快，从样品的处理到出结果只需4个小时。检测结果稳定，荧光不易发生淬灭，检测过的样本在数十天后仍可观察结果。并且量子点标记禽流感抗体的方法十分简单，只需简单离心就可对标记产物进行纯化。而传统的抗体的荧光素标记方法需要反应过夜，标记产物还需要透析法或层析法进行纯化，整个过程耗时，且操作繁琐。该方法对鸡胚尿囊液检测最高稀释度为10"6，与鸡胚病毒分离的灵敏度基本相当，高于RT-PCR的检测灵敏度。本发明的优点是纳米量子点应用于H5N1型高致病性禽流感检测的诊断方法，该方法快速、稳定、便于高通量检测、条件要求低、操作简便，易于推广，具有操作简单、快速和灵敏度高等特点。该方法的建立将为我国高致病性禽流感的监测和诊断提供了一种有效的手段，在进出口检疫上具有良好的推广和应用前景。下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，并非对本发明的限制。凡是依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。图l为三种不同粒径大小的CdSe/CdSQDs的吸收光谱(a)和荧光光谱(b)。图2为巯基乙酸修饰CdSe/CdS油溶性量子点的紫外吸收光谱。图3为双亲性高分子材料自组装改性量子点的TEM照片190，000X。图4(a)是双亲性高分子疏水自组装改性量子点的紫外吸收光谱。图4(b)是改性后的荧光光谱。图5为超声乳化改性量子点后的TEM照片。图6是超声乳化改性量子点的紫外吸收光谱。图7为醛基化玻片结果验证结果图(a)加入羊抗兔IgG;(b)加入羊抗鸡IgG。图8为量子点标记抗体的反应原理图。图9为沉淀离心量子点标记多抗后过柱的峰形图。图10为沉淀离心量子点标记的产物反应荧光图片。图11为过柱纯化量子点标记的禽流感多抗产物图。图12为过柱纯化各组分与抗原反应荧光图片。图13为过柱纯化量子点标记的禽流感单抗图。图14为沉淀离心纯化量子点标记单抗产物后过柱的峰形图。图15a、b、c和d分别表示量子点标记的H5N1型禽流感单抗检测新城疫F48E9、IBDV、鸭瘟病毒和鸭肝炎病毒结果图。图16为本发明方法和间接荧光免疫法对未感染禽流感病毒的尿囊液进行检测的结果图。具体实施例方式主要材料和仪器1.HT培养基(Sigma公司)，HATA选择培养基(Sigma公司)，DMEM高糖培养基(CIBC0BRL公司)，细胞融合剂(Sigma公司)，青霉素钠(华北制药)，硫酸链霉素(华北制药)；十二烷基磺酸钠(SDS)(Sigma公司)，正辛酸(北京化学试剂公司)，HRP标记的羊抗鼠IgG(欣经科生物制品有限公司)，聚乙二醇(PEG,分子量6000)(欣经科生物制品有限公司)，凝胶过滤填料S印hadexG-200(Amershambioscience)，禽流感H5N1病毒、鸡新城疫病毒(NDV)、产蛋下降综合症病毒(EDS76V)为本实验室保存，SPF鸡胚购自梅里亚动物保健品有限公司，BALB小鼠购自北京市实验动物研究所，SP2/0细胞为本实验室保存，新西兰大白兔购自北京实验动物中心。自动纯水机(美国PALI.CO)，二氧化碳培养箱(日本三洋)，倒置显微镜(日本Olympus)，高速离心机(美国Optime)，酶联检测仪(美国ThermoLabsystems)，台式电子天平(德国SAT0RI0VS)，恒温水浴箱(芬兰HETO),微孔细胞培养板()，电泳成套设备(美国Invitrogen)，倒置荧光显微镜(日本Olympus)，centrifuge5810R台式冷冻离心机(德国印pendorf公司)；AKTABasic蛋白纯化仪(AmershamBiosciences)。2.量子点的制备三正辛基氧化磷(TOPO，90%,Aldrich)，三正丁基磷(TBP,90%,TCI，Japan)、十八胺(ODA，90%'ACROS)、十八烯(ODE,90%,ACROS)，单质硫(S，99.9%Aldrich)、油酸(OA，90%,Aldrich)，氧化镉(CdO，99.5%,Aldrich)以及Se粉(lOOmesh,99.99%,Aldrich)、甲苯、乙醇，甲醇、正己垸，氯仿，二氯甲烷和丙酮均为分析纯，购自天津大学科威试剂公司。UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，PJEM-IOOCXII型透射电子显微镜(erkinElmerInc.)，F-4500荧光分光光度计(日立)，G2F20透射电子显微镜(Tecnai)，SHJM-1型数显恒温搅拌电热套(山东省鄄城福利科研仪器厂)，HettichMikro22R型冷冻离心机(JEOL公司)，电子天平ALC-100.4(北京赛多利斯天平有限公司)3.抗体的量子点标记EDC(l-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐，Pierce)，sulfo-NHS(sulfo-N_羟基琥珀酰亚胺，Acrose)，(3-氨甲基)三乙氧基硅烷(APTES，((3-Amin叩ropyl)，triethoxysilane，AlfaAcesar)，凝胶过滤填料Superdex200(Amershambioscience)，凝胶过滤填料s印harose6FastFlow(Amershambioscience)。UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，centrifuge5810R台式冷冻离心机(德国印pendorf公司)，BX51正置荧光显微镜(日本Olympus)，AKTABasic蛋白纯化仪(AmershamBiosciences)，wd-9403f紫外透射仪(北京六一仪器厂)。4.样品的检测牛血清蛋白(BSA，北京化学试剂公司)，Tween-20(北京化学试剂公司)，新城疫F48E9、IBDV、鸭瘟病毒和鸭肝炎病毒由本实验室留存(本发明的实施也可选取其他的同类病毒，不影响效果)。BE500恒温培养箱(德国ME羅ERT)，BX51正置荧光显微镜(日本Olympus)。实施例l:病毒的繁殖、纯化及浓縮1.病毒的繁殖取AIVH5N1病毒，作1X1(T倍稀释，尿囊腔接种10日龄鸡胚，0.2ml/枚，37。C培养，每日照蛋3次，淘汰24小时内死亡的死胚，收集24-96小时仍未死亡的鸡胚。放4'C冷却，无菌收集尿囊液。2.病毒的灭活及纯化(1)灭活:在收集的尿囊液中加入甲醛使其终浓度为O.1%，置于37。C生化培养箱中灭活。(2)差速离心4000rpm，4。C离心45分钟，弃去沉淀。上清夜于100，OOOXg，4。C超速离心2小时，收集沉淀，以原尿囊液1/20体积的PBS(pH7.4)重悬病毒，-8(TC保存。(3)凝胶过滤用0.OIM，PH7.4的PBS作为平衡液和洗脱液。取lgS印hadexG-200，以蒸馏水煮沸30min,充分溶涨后装柱，用平衡液充分平衡柱床。将粗提病毒装入柱内，待病毒液全部进入层析柱后，关闭下口完成上样，然后加入洗脱液进行洗脱，控制流速为0.3ml/min，2ml/管，根据各管的OD娜值和HA价，收集符合要求的个管洗脱液。(4)洗脱液的浓缩将收集的各管洗脱液装入透析袋，用固体聚乙二醇(PEG，分子量6000)包埋10h进行浓縮。取出病毒浓縮液，用紫外分光光度计测定其OD加。和0D280，根据公式蛋白质浓度(mg/ml)=1.45乂0028。_0.74乂0026。,计算病毒蛋白的浓度，并测定浓縮蛋白的HA价。3.结果取200ml尿囊液进行纯化，差速离心，以初体积的1/20的PBS虫悬沉淀，紫外分光光度计测定其0D2s。和OD加。，并根据公式病毒蛋白浓度(mg/ml)二(1.45XOD28。_0.74X0D260)X稀释倍数，计算得到病毒蛋白的含量为1.3564mg/ml。凝胶过滤后，共收集洗脱液20管(l.Oml/管)，根据ATAKBASIC蛋白纯化仪显示的各收集组分的0D28。，合并OD，处于第一个缝的各管，共得到lOml，用固定乙二醇(PEG，分子量6000)包埋，10h后体积为1.5ml。用紫外分光光度计测得浓缩病毒蛋白浓度为2.6859mg/ml。血凝试验结果表明，所获得的病毒浓縮液的HA价为1:211。实施例2:制备和纯化H5N1型禽流感单克隆抗体l.小鼠免疫程序用实施例l纯化浓縮的病毒作为免疫抗原免疫8周龄Balb/c小鼠。共免疫四次，第一次免疫用等量氟氏佐剂完全乳化，第二次和第三次免疫加等量的氟氏不完全佐11剂，第四次不加佐剂。每次免疫间隔2周。每次免疫的病毒剂量为每只小鼠150yg,免疫途径为颈背部下多点注射。第四次免疫2周后尾哺采血测定血清的HA价，若血清效价合理，融合前三天进行一次加强免疫，用不加佐剂的病毒抗原经腹腔注射。2.杂交瘤细胞的建立(1)SP2/0细胞的准备融合前24-48h将SP2/0细胞分瓶扩大培养,融合前6h,弃去瓶中培养液，换上新液。融合时，选择形态良好、呈对数生长的SP2/0细胞，将其从瓶壁上轻轻吹下，收集于50ml离心管内，1500rpra离心3min，用5mlDMEM基础培养液悬浮沉淀，再离心一次，然后用DEME重新悬浮后计数备用。(2)饲养细胞的制备将未经免疫的ICR小鼠眼球放血处死；将处死的小鼠置75%酒精中浸泡5min，转入超净台，置于无菌腰盘中；剥离小鼠皮肤，无菌取出脾脏，放入盛有10mlDMEM基础培养液的平皿中，剔出结缔组织，并轻轻漂洗；将睥脏移入另一盛有10mlDMEM基础培养液的平面皿中，用灭菌的钝头反复夹取积压睥脏，充分释放其中的脾细胞；将含有脾细胞的DMEM移入离心管内，1500rpm离心3min，弃上清；用10mlDMEM基础培养液重悬沉淀，吸吹均匀，1500rpm，离心3min:弃上清。此步骤重复2-3次；沉淀用10mlHAT选择培养基悬浮备用。(3)免疫脾细胞的制备在强化免疫72h后，将免疫小鼠摘除眼球放血并分离血清作为抗体阳性对照；免疫脾细胞的制备同上述饲养细胞的制备过程；最后，沉淀用DMEM基础培养液悬浮计数备用。(4)细胞融合分别取2.4X108个脾细胞和含有6.0X107个SP2/0细胞的悬液，加入到一只50ml离心管内，轻轻混匀；1500rpm离心3min，将上清尽量弃去;用手掌轻轻震动管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状；用移液管吸取lml细胞融合剂，使移液管尖部接触细胞，缓缓加入融合剂，使细胞与融合剂充分接触，控制在60s加完；加入25mlDMEM液终止细胞融合剂的作用，方法如下第1分钟缓缓加入lmlDMEM液，第2分钟加入4mlDMEM液，然后在3分钟内加入20mlDMEM液;将离心管置于37。CC02培养箱静置5min;1500rpra/min离心3min,弃上清，用105mlHAT选择培养基融合细胞，将制备好的10ml饲养细胞悬液全部加入，轻轻将细胞混合均匀；将悬浮细胞液滴入到6块96孔板中，每孔200ul，置于37°C0)2培养箱中培养；融合第二天，用HAT选择培养基半量换液，融合后第四天，再用HAT选择培养基半量换液一次，第八天改用HT选择培养基半量换液。每天记录细胞生长情况。(5)获得阳性杂交瘤细胞用血凝试验(HI)进行检测。先用4单位AIVH5亚型血凝抗原检测，对于阳性孔，再用8单位血凝抗原检测一次，筛选强阳性孔。所用的血球为0.5%(V/V)浓度的鸡红血球，直接对上清液原液进行HI检测；筛选待融合后的细胞克窿生长到覆盖细胞孔底部面积的1/10时，用确立好的HI方法对其培养上清进行检测。对于用8单位血凝抗原检测呈阳性的细胞孔，及时进行克隆；4单位血凝抗原检测呈阳性，而8单位抗原检测呈阴性的细胞，换上细胞冻存液，放入-8(TC冰箱保存。(6)阳性杂交瘤细胞的克隆(采用有限稀释法)克隆的当天制备饲养细胞，制备过程如前所述，将制备好的饲料细胞悬液加入到96孔板中，100ul/孔；将检测为强阳性的细胞孔用吸管轻轻吸使细胞分散均匀，吸至lml含20%胎牛血清的DMEM液中，取少量悬液进行细胞计树；用HT选择培养液稀释阳性杂交瘤至20个/ml、10个/ml、5个/ml;将稀释好的细胞悬液加到有饲养细胞的96孔板中，100ul/孔，每一种稀释度加到32孔；每天观察细胞的生长情况。第四天用HT选择细胞培养液半量换液；待孔中细胞液变黄进行检测；选择仅有一个克隆上生长的阳性孔再次进行克隆化，直至阳性克隆达到100%;获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后，及时扩大培养并冻存。3.细胞的冻存与复苏(1)细胞的冻存选择处于对数生长期的细胞，轻轻将细胞从瓶壁上吹下；1500rpm离心3rain，弃上清；用冻存液将细胞沉淀悬浮，分装于细胞冻存管内，L5ml/管，加盖封严，注明细胞代号；将冻存管置于无水乙醇的小烧杯内，于4"C冰箱静置2h后转入-8(TC冰箱过夜，再将之移入液氮罐内长期保存。(2)细胞的复苏从液氮管装中取出冻存管，迅速放入37X:水浴中，轻轻晃动使其尽快融化；1500rpm离心3rain，弃上清；用含20%血清的DMEM液将沉淀悬浮，移入细胞瓶，置C02培养箱内培养。4.单克隆抗体的制备(采用体外诱生腹水法)挑选经产Balb/c小鼠，腹腔注射灭菌石蜡油0.5ml/只；10-14天后，将杂交瘤细胞吹打下来，1500rpm离心3min，弃上清，用5mlDMEM重新悬浮，计数备用；每只小鼠腹腔接种杂交瘤细胞106个；7-IO天后，可见小鼠腹部明显增大，采集腹水；将腹水3000rpm离心10min，收集上清，-2(TC保存备用。5.单克隆抗体的浓縮及纯化(采用辛酸-饱和硫酸胺法)取腹水10ml，加入0.06M醋酸钠-醋酸缓冲液(pH4.0)20ml(边加边搅拌)；用1M氢氧化钠将腹水pH调至4.8后，边搅拌边加入正辛酸0.33ml,室温搅拌30min;腹水经6000rpm离心30min，弃沉淀，上清用1M氢氧化钠将pH调至7.2，边加边搅拌，缓慢加入等体积的饱和硫酸铵，搅拌30min后，经6000rpm/min离心30min后，弃去上清，沉淀溶于6mlPBS中；缓慢加入4ml饱和硫酸铵胺，并不断搅拌，30min后，6000rpm/min离心30min，将沉淀溶于适量PBS中，移至透析袋中进行透析。6.单克隆抗体的鉴定(1)HI价测定将收集的腹水3000rpm，10min离心处理，弃掉杂质，测定HI价。(2)ELISA效价的测定包被以差速离心提纯的H5病毒作为包被抗原，用包被液稀释，100"1/孔，4。C过夜；洗涤甩干包被液，以洗涤液洗涤3次，3min/次；加入封闭液，100yl/孔，37°C2h.甩干，同上洗涤；加二抗用PBS将HRP标记羊抗鼠IgG按工作浓度稀释，100iil/孔，37°C60min.甩干，同上洗涤；加底物每孔加入新鲜配制的底物溶液，100ul/孔，37°C，15min。g:终止液每孔加入100yl1MH2S0J冬止反应；读数自动酶联检测仪检测各孔的0D280。抗原包被浓度和抗体稀释度的测定将包被抗原作l:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560稀释，小鼠阳性和阴性血清作l:2500、1:5000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000稀释，间接ELISA法测定各孔0D655，方阵法确定抗原最佳稀释度。(3)单克隆抗体ELISA效价测定将腹水从l:IO起作倍比稀释，按确定的间接ELISA方法测定其效价。(4)交叉试验分别用H7、H9、NDV、EDS76V的血凝抗原对腹水做HI交叉反应。有HI反应的判为有交叉反应，无HI反应的判为无交叉反应。(5)单抗重链、轻链分子量的测定采用SDS-PAGE检测单抗分子量，腹水的辛酸-饱和硫酸铵纯化产物作电泳样品。浓縮胶和分离胶浓度分别为5%和12%。7.单抗的鉴定结果经测定，做制备的禽流感H5亚型单克隆抗体的HI效价为1:211，ELISA效价为106。针对H7和H9的血凝抑制活性，只对H5具有血抑活性，说明所制备的抗体为抗H5亚型禽流感血凝素的特异性单抗。用辛酸-饱和硫酸胺法纯化单抗，然后进行SDS-PAGE电泳，在约50KD和27KD处各有一条明显的条带，重链约为50KD，轻链约为27KD。实施例3:制备和纯化H5N1型禽流感多克隆抗体1.用纯化浓縮的H5N1型禽流感病毒作为免疫抗原，免疫3只健康的体重在2kg左右成年雄性新西兰大白兔，免疫程序如表l。前三次免疫每次间隔2周，第三次免疫后10d耳缘静脉采血，分离血清，用琼脂免疫扩散试验(AGID)检测兔血清的效价，若琼扩效价达1:16以上，用不加佐剂的浓缩的重组蛋白自耳静脉缓慢注射加强免疫l次，10d后心脏采血，分离血清，用于兔抗AIVH5亚型的重组蛋白的IgG的提取。表1兔免疫程序<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2.多克隆抗体的提纯(1)饱和硫酸铵粗提取20ml血清，加生理盐水20ml，再加入饱和硫酸铵溶液10ml，使成20%的硫酸铵溶液，边加边搅拌，充分混匀后，静置30min。3000rpm离心20min，弃沉淀。在上清液中加入再加入饱和硫酸铵30ml，使成50%硫酸铵溶液，充分混匀，静置30min。3000rpm离心20min，泣上清。于沉淀中加入20ml生理盐水，使之溶解，再加饱和的硫酸铵溶液10ml，充分混匀后，静置30in。3000rpm离心20min，弃上清，重复溶解/沉淀2-3次，用10ml生理盐水溶解沉淀。在生理盐水中4r透析过夜，中间换液数次(用线的BaCl检査透析液中的SO/'，直到无S0/—为止)。离心去沉淀，上清液即为粗提的IgG，将粗提的IgG溶解于PBS(0.OIM，pH7.2)中用于过柱。(2)DEAE-纤维素层析过柱用0.0175M，pH6.7的PBS作为平衡液和洗脱液。取适量的DEAE-纤维素于0.5M的氢氧化钠溶液中，浸泡lh，不时搅拌，用布氏漏斗抽滤，用蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液接近中性为止。再将纤维素浸泡于0.5M的HC1中，同样抽滤至中型，再将纤维素浸泡于0.5M的NaOH中，同样处理，洗至中型。然后进行平衡、装柱、上样后进行洗脱。连接洗脱瓶，打开柱下口开始洗脱，用20%的磺基硫酸钠检査，开始产生白色沉淀时收集洗脱液，直到收集液中无蛋白质为止，即为纯化的IgG。将提纯的IgG置透析袋中，用固体聚乙二醇(PEG，分子量6000)包埋10h进15行浓縮；测定蛋白的浓度。3.多克隆抗体测定经紫外分光光度计测定其浓度为2.8345mg/ml。实施例4:水溶性羧基化量子点的制备1.CdSe核壳量子点的制备取O.1429g硒粉，溶于lml十八烯和1.2mlTBP(三辛基磷)，密封保存备用。在三口瓶中称取0.3mmo1氧化镉，0.4ml油酸和4ml十八烯，在氩气氛围中保持30min后加热至氧化镉完全溶解。称取0.5gT0P0(三辛基氧化磷)，于室温下加入上述混合溶液中。再通氩气45min后，混合溶液加热至260°C,快速加入已经制备好的硒溶液，反应2min后，继续搅拌冷却至室温。制备好的CdSe量子点用丙酮沉淀、洗涤两遍后，溶于三氯甲烷中备用。2.CdSe/CdS核壳量子点的制备称取51.9mg氧化镉，溶于0.4ml油酸和10ml十八烯中。通氩气30min后，混合溶液加热至270°C，此时溶液呈淡黄透明状，冷却到室温备用。称取硫粉12.8mg，溶于10ml十八烯中，通氩气30min后，混合溶液加热至170°C，溶液呈黄色透明状，冷却到室温备用。取2mlCdSe核量子点，加5ml十八烯，十八胺、TOPO各0.5g于烧瓶中，通氩气40min后，加热至10(TC，保持10min以除去多余的三氯甲垸，再加热到220°C,此时保持系统稳定。按照文献数据，计算出制备每层量子点所需要CcT、S2—的量。先逐滴加入第一层所需的镉溶液，待8min后，加入第一层所需的硫溶液，25min后，再加入第二层所需的镉溶液，同样待8min后，加入第二层所需的硫溶液。制备好的CdSe/CdS量子点用丙酮沉淀、洗涤两遍后，避光密封保存在冰箱中待用。3.纳米量子点的表面修饰(1)巯基乙酸修饰CdSe/CdS量子点CdSe/CdS油溶性量子点先用丙酮洗涤三次，离心分离取沉淀，再用氯仿溶解分散CdSe/CdS油溶性量子点。取过量巯基乙酸加入到CdSe/CdS油溶性量子点氯仿溶液中，避光搅拌6小时，油溶性量子点表面的TOPO/TOP有机小分子大都就被水溶性的巯基乙酸分子所替代，从而实现油溶性量子点的水溶性化。反应6小时后，离心取沉淀，再用PBS溶解分散，再离心，反复三次以除去过量的巯基乙酸和其他有机分子。(2)双亲性高分子疏水自组装改性量子点取适量的油溶性量子点粉末和双亲性三嵌段高分子溶解在3:1的氯仿/乙醇溶液中。搅拌数小时以除去氯仿有机溶剂。当氯仿被除去后(闻不到氯仿气味时)，加入适量的PBS缓冲溶液，再超声分散3分钟。所得到的溶液再过0.22um膜以除去大量未结合的高分子，过膜后溶液变得光学透明。所得到的过膜溶液再用超滤管浓縮到一定浓度后再过凝胶色谱柱，进一步除去未结合的高分子。收集组分再用超滤管浓縮到适当浓度以备用。(3)超声乳化改性取合适摩尔比的油溶性量子点/三嵌段高分子，溶解在二氯甲烷中。溶解完全后，用洁净干燥的lml注射器移取量子点/高分子溶液。称取6.Omg的F-68乳化剂溶解在去离子水中，剧烈搅拌得到均匀的乳液后放入超声探头下，超声探头伸入液面0.5cm以下，注射器针头与超声探头底部并行。开动超声，功率50瓦，工作时间设置为5秒，间歇时间为3秒。在超声进行时，缓慢注入量子点/高分子溶液，此时溶液变为乳白色且在手提紫外灯照射下发出明亮的荧光。注射完毕，迅速将乳液放在磁搅拌仪上搅拌以维持稳定乳液状态，且进一步除去二氯甲烷有机溶剂。半小时后离心分离取沉淀，反复3次以除去没有结合的高分子和F-68乳化剂分子。4.测定制得的CdSe量子点的紫外吸收和发射光谱如图1所示，其吸收光谱宽且连续分布，在吸收光谱上有4个激子吸收峰，表明所得产物的强量子效应。第一激子吸收峰尖锐，且随着粒径变大而红移。发射谱窄而对称，而且没有长波拖尾现象，半峰宽只有23nm。随着产物的粒径大小不同，其发射光谱也不同，粒径变大，其发射光谱也随之红移。如此狭窄的谱峰说明产物的粒径分布非常狭窄(可以从HRTEM照片中看出其单分散性质)。图2是巯基乙酸修饰CdSe/CdS油溶性量子点的紫外吸收光谱。从图上可以看出，修饰后第一激子吸收峰变得平坦，第一激子吸收峰几乎没有偏移，说明改性后光谱特性变动甚少。跟踪巯基乙酸修饰后产物的稳定性，修饰后的量子点在一周后出现少许沉淀物，且出现沉淀现象的程度与量子点溶液的浓度相关，浓度越大，出现沉淀现象越明显。油溶性量子点表面的有机物层被亲水性的巯基乙酸取代，Cd-S键结合的牢固程度决定了量子点的聚集程度。巯基乙酸修饰后，由于破坏了原有量子点表面化学结构，且在空气水溶液介质中，巯基乙酸小分子也会由于量子点表面光氧化，光降解而脱离量子点，量子点浓度越大，其相互之间聚集的机会越大，从而加大沉淀的形成。双亲性高分子自组装核心是通过疏水作用结合。油溶性量子点表面的T0P0/T0P均是含有8个碳原子的烷基疏水链，我们所采用的三嵌段高分子含有丰富的亲水性羧基基团，经过部分羧基烷基化改性，使之连接上具有8个碳原子的辛胺。这样通过高分子上的8碳原子与量子点表面的8碳原子疏水作用结合，在量子点表面进行自组装，且高分子上的羧基提供亲水性，使得油溶性量子点水溶性化。图3为双亲性高分子材料自组装改性量子点的TEM照片190，000X。图4a是双亲性高分子疏水自组装改性量子点的紫外吸收光谱。高分子材料由于对光也有吸收和折射，水溶改性后第一激子吸收峰变得平坦，且最大吸收峰红移少许，表明量子点表面有高分子包裹。图4b是改性后的荧光光谱。其半峰宽基本没有变化，但最大发射波长有红移(585-596nm)，进一步说明了量子点表面有被高分子包裹。图5是超声乳化改性量子点后的TEM照片。从图上可以看出粒径均匀，纳米颗粒表面光滑，呈球形。且实现了量子点的单个包裹。每个颗粒里面的小黑点是油溶性CdSe/CdSQDs。超声乳化改性，可以在量子点表面形成比较致密严实的高分子层，能更好的保护量子点，避免环境介质渗入而造成量子点的发光性能的破坏(如光降解，光漂白，以及Cd离子的渗出而产生毒性)；纯化简单，只需离心，而一般水溶性改性(通过疏水作用自组装改性)需要过膜一浓縮一凝胶过滤一再浓縮等步骤。采用0/W，有机溶剂用量少，省时节能，环境友好；疏水作用自组装修饰的纳米粒子表面不光滑，而超声乳化制备的纳米粒子表面光洁，不容易引起非特异性吸附，能更好的应用在生物检测方面。图6是超声乳化改性量子点的紫外吸收光谱。高分子材料由于对光也有吸收和折射，水溶改性后第一激子吸收峰变得平坦，表明量子点表面有高分子包裹且最大吸收峰几乎没有变化，说明量子点原有的光谱特性得以保留。从改性后的荧光光谱看最大发射波长有红移(612-619nm)，进一步说明了量子点表面有被高分子包裹。实施例5:抗体的量子点标记1.醛基化玻片的制备将玻片用洗液(K2Cr0720g+浓H2S04350ml+H2040ml)浸泡过夜，然后用大量的去离子水冲洗，6(TC烘干2h后，将玻片浸入5%APTES的乙醇溶液中作用60min进行玻片表面的氨基化，取出水洗，晾干后，将玻片浸入含5%戊二醛的PBS(0.2mol/L，pH8.0)溶液中进行玻片的醛基化，PBS溶液清洗晾干后备用。为了验证醛基化玻片的效果，用PAPpen在玻片上画圈，标记出溶液反应的位置。在圆圈内加入兔IgG，37。C温孵2h，PBS-T(0.01mol/L，pH7.2，0.05%Tween20)洗涤4次，10s/次；同等条件下，再以含1%BSA的0.02mol/LPBS溶液封闭lh。双蒸水清洗，晾干后，加入量子点标记的羊抗兔IgG和量子点标记的羊抗鸡的IgG(如图7所示)，孵育30min，PBS-T洗涤4次，每次10min，最后用双蒸水冲洗，荧光显微镜下观察。如图7所示，加入羊抗兔IgG可以看见橙黄色的荧光，而加入羊抗鸡的IgG没有荧光，从而证明我们制作的醛基化玻片表面能固定蛋白，并能保持所固定蛋白的活性。2.用交联剂EDC和sulfo-NHS，采用共价键连接的方法进行抗体的量子点标记参见图8所示，EDC和量子点表面的羧基反应生成酰基异脲，但酰基异脲在水溶液中容易水解，又生成羧基产物。如果在溶液中加入sulfo-NHS，酰基异脲就极易和sulfo-NHS反应，生成具有胺反应活性的sulfo-NHS酯，sulfo-NHS酯与抗体表面的氨基反应生成稳定的酰胺，从而进行抗体的量子点标记。具体的反应条件如下(1)在lml的活化缓冲液(O.1MMES，0.5MNaCl，PH6.0)中加入0.4mg(2.OmM)EDC和1.lmg(5.OmM)sulfo-NHS。(2)在溶液中加入20ul量子点溶液(3.0mM)，不停地混合溶液，在室温下反应20min。(3)加入1.4ul(20mM)2-巯基乙醇在室温下反应10min，得到活化的量子点溶液。(4)在lml连接缓冲液(PBS,PH7.5)中加入禽流感所需标记的(抗体与量子点分子数比例为3:1)。并用NaOH溶液调节PH至7.5，在室温下搅拌反应2小时。(5)4000rpm离心分离1分钟，除去小分子和未反应完全的抗体。(6)吸去并弃置上清液。(7)用2ml去离子水溶解沉淀，用反复离心或凝胶填料S印harose6FF过滤方法纯化量子点标记产物。3.量子点标记产物的纯化(1)沉淀离心纯化把反应后的溶液14000rpm离心30min。取其沉淀，用去离子水洗涤后，用适量的PBS(PH7.4，0.01M)溶解沉淀得到量子点标记的抗体复合物。(2)凝胶过滤纯化和浓縮(在AKTABasic蛋白纯化仪上进行)取适量的S印harose6FF填料，用抽滤器进行抽滤，并用蒸馏水洗涤2-3次。在滤过的填料中按l:l的体积比加入蒸馏水，混匀；把填料连续地倒如柱中，打开泵装置，并用蒸馏水进行洗涤，直至填料的液面位置不再下降为止，标记此时填料的液面位置；松开柱头，调整柱头的位置为填料液面以下2-3mm;用0.OIM，pH7.4的PBS作用平衡液，流速为2ml/min,观察测定的实时的0D28。值曲线，至UOD，值曲线稳定为一条直线时停止平衡；用自动加样器加入量子点标记的抗体溶液，用0.01M，pH7.4的PBS作为洗脱液，流速为2ml/min;收集洗脱液，每管lml，直到显示的OD，值曲线为一条平直的直线时停止收集；按照0D28。值曲线显示的各峰的0D28。值，合并各峰的洗脱液，其中峰1的洗脱液为量子点标记的抗体溶液；将提纯的量子点标记的抗体溶液装入透析袋中。用固体聚乙二醇(PEG，分子量6000)包埋10h进行浓縮。4.结果测定(1)量子点标记禽流感多抗我们把最后PBS溶解沉淀得到的溶液用凝胶过滤填料s印harose6FF过柱。用PBS(O.lM,pH7.4)作为平衡液和洗脱液，得到一个尖峰，峰形如图9所示。由此看出，沉淀离心后得到的量子点标记多抗的产物为量子点标记多抗的复合物，并通过离心去除了未连接的游离的抗体、未反应的小分子偶联剂以及其他的中间产物等。合并该峰的收集组分，在表面固定有禽流感抗原的玻片上进行封闭和洗涤后，滴加该峰的收集组分，洗涤后，在荧光显微镜下观察，可以观察到橙黄色的荧光(如图10)。由此看出，沉淀离心后得到的量子点标记多抗的产物为量子点标记多抗的复合物,并通过离心去除了未连接的游离的抗体、未反应的小分子偶联剂以及其他的中间产物等。合并沉淀洗涤过程中的上清液，测定D280、D260，计算上清液中游离抗体浓度，根据反应前加入的抗体的量，由此我们计算得到抗体的量子点标记效率为41.83%.取量子点标记后的抗体溶液，不经过离心，直接用凝胶过滤填料s印harose6FF进行纯化，用PBS(O.1M，pH7.4)作为平衡液和洗脱液，得到的谱图如图11。合并峰1、峰2和峰3的收集组分，在紫外透射仪下观察，收集的峰1组分发出橙黄色的荧光，而峰2和峰3的组分没有发出荧光。在表面固定有禽流感H5NI抗原的玻片上进行封闭和洗涤后，滴加各峰的收集组分，洗涤后，在荧光显微镜下观察，可以观察到加入峰l组分的玻片发出橙黄色的荧光，可以证明峰1为量子点标记的禽流感多抗(如图12a),而加入峰2和峰3的组分的玻片在荧光显微镜下没有观察到荧光(如图12b、12c)，从而证明峰1组分为我们的目标产物即量子点标记禽流感多抗复合物。分别测定峰l、峰2、峰3组分的吸光度，按照各峰收集的体积和浓度可以算出禽流感多抗的量子点标记效率为42.64%。由此,我们可以看出，可以用沉淀离心和过柱的方法对量子点标记禽流感多抗的反应产物进行纯化，两种方法得到量子点标记禽流感多抗的效率分别为41.83%和42.64%。(2)量子点标记禽流感单抗我们采用了同样的方法用制备的量子点标记禽流感单抗，并分别用沉淀离心和过柱的方法对标记的产物进行了纯化取峰1的组分加到表面固定有禽流感抗原的玻片上进行封闭和洗涤后，滴加该峰的的组分，洗涤后，在荧光显微镜下观察，可以观察到滴加峰1组分的玻片发出橙黄色的荧光，可以证明峰1为量子点标记的禽流感单抗。通过沉淀离心方法得到的量子点标记物，过柱以后得到一个尖峰(如图14):通过计算，沉淀离心和凝胶过滤的方法对量子点标记的多抗产物进行纯化，最后得到量子点标记的禽流感多抗复合物的产率45.38%和46.18。从上述实验中可以看出，通过沉淀离心和凝胶过滤的方法都可以对标量点标记禽流感的单抗和多抗进行纯化，沉淀离心得到的目标产物的产率略低于凝胶过滤，但是凝胶过滤其操作费时，凝胶过滤后还需要浓缩，故我们采用沉淀离心的方法对量子点标记产物进行纯化。实施例6:样品的检测1.检测方法在醛基化的玻片表面滴加待检样品尿囊液，37i:孵育2h.。用PBS(0.OIM，pH7.2)洗涤玻片3次，每次5min。然后在玻片表面滴加含5%BSA的PBS-Tween溶液，37。C孵育45min。用PBS(0.01M，pH7.2)洗涤玻片3次，每次5min后，加入量子点标记的禽流感抗体，37。C孵育45min，用PBS(0.OIM，pH7.2)洗涤玻片3次，每次5min，室温下晾干后在荧光显微镜下观察，判断样品的阴阳性。2.降低方法的非特异性研究在玻片上孵育阴性样品后，进行封闭和洗涤,然后加入量子点标记的禽流感多抗和禽流感标记的单抗，进行以下的方法非特异性研究(1)分别加入浓度为0.5%、0.8%、1.0%和1.5%的BSA进行封闭，研究不同浓度BSA封闭的效果。(2)实验浓度为O.1、0.05、0.02、0.01、0.005缓冲体系中，样品检测出现的非特异性，确定缓冲溶液的离子强度。(3)中Tween-20浓度的确定在PBS缓冲液中分别加入浓度为0.01%、0.05%、0.1%、0.2%和0.5%的Tween-20,试验洗涤液中Tween-20的浓度。结果通过在阴性样品上加入不同浓度BSA的封闭效果研究，我们选定浓度为1。/oBSA作为封闭液。由于量子点表面修饰羧基，带负电,所以离子强度过高，会引起静电吸附，我们适当降低了缓冲溶液的离子强度，以降低非特异性吸附。经过实验，我们釆用了0.OIM、pH7.4的PBS为缓冲溶液。为了减少非特异性吸附，我们在洗涤液PBS中加入不同浓度的Tween。通过实验确定，我们选用0.1%的PBS-T作为洗涤缓冲液。通过实验验证，本方法中，用量子点标记的单抗其特异性要略优于量子点标记的禽流感多抗。3.方法的特异性研究(1)标记选择的禽流感单抗或多抗，用量子点标记的抗体分别检测常见的禽类病毒新城疫F48E9、IBDV、鸭瘟病毒和鸭肝炎病毒进行检测，观察是否出现假阳性结果，验证方法的特异性。(2)取一份未感染禽流感病毒的鸡胚尿囊液，分别按本研究所建立的方法和间接免疫荧光法进行检测，在荧光显微镜下观察，比较两种方法的非特异性。结果(1)图15a、b、c和d分别表示量子点标记的H5N1型禽流感单抗检测新城疫F48E9、IBDV、鸭瘟病毒和鸭肝炎病毒，实验结果证明，没有出现假阳性结果。证明方法的特异性较好。(2)分别按本研究建立的方法和间接荧光免疫法对未感染禽流感病毒的尿囊液进行检测，两种方法检测的结果如图16，a为本研究建立方法的检测结果，b为免疫荧光检测的结果。从图16可以看出，本研究所建立的检测方法，其非特异性较好，没有观察到非特异性的荧光，而用免疫荧光方法出现了少量的非特异性荧光。证明此方法的特异性要优于免疫荧光的方法。4.方法的灵敏度研究取感染的尿囊液作10倍梯度稀释，然后用本研究所建立的方法进行检测，确定方法的灵敏度。结果通过实验验证，我们在检测尿囊液时，本研究所建立的方法能检测积胚尿囊液的最高稀释倍数为1Q—6。5.检测结果的稳定性研究用本研究所建立的方法对阳性样本进行检测，然后在室温下放置l天、3天、5天、10天、15和30天后再观察检测结果。结果通过实验证明，检测过的样本在室温下放置30天后仍能观察到明亮的荧光。权利要求1.H5N1型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法，其特征在于包括如下步骤(1)制备和纯化H5N1型禽流感单克隆抗体或多克隆抗体；(2)制备水溶性羧基化纳米量子点；(3)纳米量子点标记H5N1型禽流感单克隆抗体或多克隆抗体；(4)样品测定。2.根据权利要求1所述的H5N1型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法，其特征在于所述(1)制备和纯化H5N1型禽流感单克隆抗体的方法为用纯化浓縮的H5N1型禽流感病毒作为免疫抗原免疫8周龄Balb/c小鼠；获得免疫脾细胞与SP2/0细胞融合得到杂交瘤细胞；筛选阳性杂交瘤细胞的克隆进行培养获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞株注射入Balb/c小鼠腹腔以体外诱生腹水法获得含单克隆抗体的腹水；采用辛酸-饱和硫酸胺法浓縮和纯化腹水获得单克隆抗体。3.根据权利要求1所述的H5N1型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法，其特征在于所述(1)制备和纯化H5N1型禽流感多克隆抗体的方法为用纯化浓縮的H5N1型禽流感病毒作为免疫抗原，免疫新西兰大白兔；10天后心脏采血，分离血清；饱和硫酸铵粗提多抗；DEAE-纤维素层析过柱后纯化的IgG置透析袋中，用固体聚乙二醇包埋进行浓縮获得多克隆抗体。4.根据权利要求1所述的H5N1型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法，其特征在于所述(3)纳米量子点标记H5N1型禽流感单克隆抗体或多克隆抗体的方法为制备醛基化玻片；利用交联剂EDC和sulfo-NHS采用共价键连接的方法进行抗体的量子点标记。5.根据权利要求4所述的H5N1型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法，其特征在于所述制备醛基化玻片是指将玻片用洗液(K2Cr0720g+浓H2S04350ml+H2040ml)浸泡过夜，然后用大量的去离子水冲洗，6CTC烘干2h后，将玻片浸入5。MPTES的乙醇溶液中作用60min进行玻片表面的氨基化，取出水洗，晾干后，将玻片浸入含5%戊二醛的PBS(0.2mol/L，pH8.0)溶液中进行玻片的醛基化，PBS溶液清洗晾干后备用。6.根据权利要求4所述的H5N1型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法，其特征在于:所述利用交联剂EDC和sulfo-NHS采用共价键连接的方法进行抗体的量子点标记是指在1.5ml的印pendorf中加入lml的活化缓沖液(O.腦ES，0.5MNaCl，PH6.0)，然后加入加入适量的EDC和sulfo-NHS溶液；再在溶液中加入20ul量子点溶液，不停地混合溶液，室温下反应20min;加入1.4ul(20mM)2-巯基乙醇在室温下反应10min,得到活化的量子点溶液；在活化的量子点溶液中，加入lml含适量H5N1型禽流感抗体的PBS溶液(0.01M,pH7.5)，并用NaOH溶液调节PH至7.5，室温下搅拌反应2小时；4000rpm离心分离1分钟，除去小分子和未反应完全的抗体；用5ml去离子水溶解沉淀，重复对量子点标记的禽流感单克隆抗体溶液进行溶解/沉淀2次，最后用2ml去离子水溶解沉淀，4。C保存。7.根据权利要求1所述的H5N1型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法，其特征在于所述(4)样品测定的方法为在醛基化的玻片表面滴加待检样品尿囊液，37"C孵育2h;用洗涤玻片3次，每次5min;然后在玻片表面滴加含5%BSA的PBS-Tween溶液，37。C孵育45rain;用0.OIM，pH7.2的PBS洗涤玻片3次，每次5min后，加入量子点标记的禽流感抗体，37t孵育45min，用0.OIM，pH7.2的PBS洗涤玻片3次，每次5min;室温下晾干后在荧光显微镜下观察，判断样品的阴阳性。8.—种水溶性羧基化纳米量子点，其特征在于采用如下方法制备得到(1)制备CdSe核壳量子点；(2)制备CdSe/CdS核壳量子点；(3)巯基乙酸修饰CdSe/CdS量子点；(4)双亲性高分子疏水自组装改性量子点；(5)超声乳化改性量子点。9.一种制备水溶性羧基化纳米量子点的方法，包括如下步骤-(1)制备CdSe核壳量子点；(2)制备CdSe/CdS核壳量子点；(3)巯基乙酸修饰CdSe/CdS量子点；(4)双亲性高分子疏水自组装改性量子点；(5)超声乳化改性量子点。全文摘要本发明公开了一种H5N1型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法，属于属于检验检疫领域。该方法包括如下步骤(1)制备和纯化H5N1型禽流感单克隆抗体或多克隆抗体；(2)制备水溶性羧基化纳米量子点；(3)纳米量子点标记H5N1型禽流感单克隆抗体或多克隆抗体；(4)样品测定。本发明的优点是纳米量子点应用于H5N1型高致病性禽流感检测的诊断方法，该方法快速、稳定、便于高通量检测、条件要求低、操作简便，易于推广，具有操作简单、快速和灵敏度高等特点。该方法的建立将为我国高致病性禽流感的监测和诊断提供了一种有效的手段，在进出口检疫上具有良好的推广和应用前景。文档编号G01N33/533GK101290319SQ20071006555公开日2008年10月22日申请日期2007年4月16日优先权日2007年4月16日发明者刘全国,刘旭辉,史喜菊,津常,张兵波,李冰玲,李炎鑫,马贵平申请人:北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心;天津大学