专利名称：一种治疗高致病性禽流感病毒h5n1引发疾病的多肽药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物医学领域，特别是一种关于高致病性禽流感 病毒H5N1引发疾病的多肽药物。
(二) 背景技术：
禽流行性感冒(Avian influenza)简称禽流感，是由A型流感 病毒(AIV)引起的禽类广泛发生的传染病。据不完全统计，全球禽 流感疫情已波及47个国家和地区，人发禽流感病例己达195起以上， 其中死亡至少110人，死亡率高达56.4。Z。 1997年在香港发生的禽 流感引起了人的发病和死亡，从而引起了全世界的高度重视。AIV依 据其血凝素(Hemagglutinin ， HA)禾卩神经氨酸酶(Neuraminidase ， NA) 抗原性的差异目前可分为16个H亚型(H1 H16)和10个N亚型(Nl N10) [Alexander DJ. A review of avian influenza in different bird species. Vet Microbiol ，2000 ，74(1-2) :3-13]。根据禽流感病 毒毒力和致病性的不同，可以将其分为高致病性、低致病性和无致病 性三类。H7、 H5亚型所致禽类疾病具有传播快、危害大、病情凶险等 特征，除急性呼吸道炎症外，常伴有全身出血性改变，心、肺、肾等 多脏器衰竭，死亡率达100%,故称为高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza),目前将H5N1归为高致病性禽流感病 毒。
对于人类而言，最大的威胁在于，如果同时感染人类流感病毒和 禽流感病毒，就有可能在体内重组成可以在人类之间互相传播的新型 病毒，而人们对此几乎没有免疫力，那势必将导致又一次的流感大流 行。由于水禽和飞禽是AIV的天然宿主，这种病毒的长期存在，将为其 与感染人或其他哺乳动物的流感病毒混合、产生新毒株提供条件。 目前针对AIV的疫苗或者药物主要有以下几种-1、 质粒疫苗Lalor PA等对比了分别构建的HA、 NP (核蛋白)、 M2基因的质粒疫苗的免疫效果。三种疫苗都对实验鼠和雪貂有明显的 保护效果，而同时构建了 NP和M2基因的疫苗效果最佳Lalor PA， Webby RJ, Morrow J. Plasmid DNA-based vaccines protect mice and ferrets against lethal challenge with A/Vietnam/1203/04 (H5N1) influenza virus. J Infect Dis. 2008;197 (12) :1643-1652。
Li C等构建了优化后的质粒疫苗H5N1/PR8-5B19。该疫苗包括H5N1 病毒的HA和NA基因。并对HA和NA基因做了修饰-修改了 HA切割位 点使其和低致病性情流感相似、将NA的茎区用鼠肝炎病毒的S2糖蛋 白的5B19表位代替，以降低其致病性和增强其免疫原性。最后该疫 苗表现出较强的体液免疫应答，对实验鸡产生了较好的免疫保护Li C， Ping 了, Jing B. H5N1 influenza marker vaccine for serological differentiation between vaccinated and infected chickens. Biochem Biophys Res Commun. 2008;372(2):293-297.。
2、 重组体疫苗
Wei CJ等系统分析了几种不同形式的重组体HA蛋白应用为疫苗 的潜力。单体、三聚体和低聚体的H5N1 HA蛋白从细胞分理处分离出， 采用中和抗体反应对其免疫原性进行评估。结果高分子量的低聚体 HA蛋白疫苗引发的抗体反应最强烈，三聚体次之，单体最弱WeiC丄 Xu L， Kong WP. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J Virol. 2008 Jul;82(13):6200-6208。
Watanabe等研究发现，将H5N1病毒M2羟基端切除11个氨基酸 后，该病毒与野生型相比有相似的生长能力，但在小鼠体内的复制效 率大大降低。作者构建了重组体病毒-VN1203M2de111 ，该重组病毒HA 的切割位点由切除11个氨基酸后的突变体代替。结果该疫苗对小 鼠产生了较好的保护性。M2胞质尾部突变体有发展成为H5N1病毒减 毒活疫苗的潜力Watanabe T, Watanabe S， Kim J"H. Novel approach to the development of effective H5N1 influenza A virus vaccines: use of M2 cytoplasmic tail mutants. _J Virol. 2008 Mar;82(5):2486-92。3、病毒载体疫苗Rmer等利用新城疫病毒作载体，表达HA免疫 原作为疫苗。结果显示这种疫苗(NDVNDVH5m)在一次免疫后就 对鸡有了较好的效果。由新城疫病毒做载体的减毒疫苗对感染H5禽 流感的保护水平由该疫苗与感染H5N1病毒的H5序列的同源性大小决 定Rmer-0berd， rf er A， Veits J丄evel of protection of chickens against highly pathogenic H5 avian influenza virus with Newcastle disease virus based live attenuated vector vaccine depends on homology of H5 sequence between vaccine and challenge virus. Vaccine. 2008;26 (19):2307-13。
Mar等用HIV病毒颗粒作载体，包被H5N1的HA、 NA、 M2基因， 构建成为H5N1 HaNaM-pseudotyped HIV载体系统。该载体系统可以 较精确的模拟禽流感病毒在体内的反应，可代替禽流感病毒，用来评 估疫苗、药物。特别在是安全性较低的实验室应用该系统有实用意义 Mar Ao Z, Patel A， Tran K.Characterization of a trypsin-dependent avian influenza H5N1-pseudotyped HIV vector system for high throughput screening of inhibitory molecules. Antiviral Res. 2008 Jul;79(1):12-8。
Singh等将牛腺病毒AD的一个亚型(BAd3)作为载体表达H5N1 的HA基因，构建成BAd-H5NA疫苗，有较好的免疫效果Singh N， Pandey A， Jayashankar L.Bovine adenoviral vector-based H5N1 influenza vaccine overcomes exceptionally high levels of pre-existing immunity against human adenovirus. Singh Mol Ther. 2008;16 (5) :965-71。
发明内容
本发明的目的就是提供一种治疗高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病 的多肽药物，它可以专门针对高致病性禽流感病毒H5N1型感染的细胞进行 有效地破坏，而且对人体无毒副作用。本发明的目的是通过这样的技术方案实现的，它的氨基酸序列为 氨基端-FLNVEWSYI-羧基端；以赖氨酸为接头，将多个该氨基酸序列组成 多拷贝的串联结构。
正常人体的外周血单核细胞(简称PBMC) —般不具有特异性溶破受 到高致病性禽流感病毒H5N1感染的细胞的功能，本发明提供的多肽在体 外与HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞共同孵育，可以增加这些外 周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量45%-80°/。， 还可以诱导激活CTL溶破受高致病性禽流感病毒H5N1感染的阳性细胞， 溶破率为60%-88%。
本发明的基本的氨基酸序列来源于GENBANK报道的高致病性禽 流感病毒H5N1的H5蛋白的氨基酸序列，采用蛋白质表位分子设计的原 理和方法，高致病性禽流感病毒H5N1的H5蛋白序列进行CTL表位分析， 主要是基于量化基序法确定H5蛋白的CTL表位，具体做法是从H5蛋白 第l位氨基酸残基开始，逐个截取九肽段或十肽段，共获得13条九肽段。 对于每一条肽段，在结合矩阵中査找各位点氨基酸残基的结合系数，这九 肽结合系数相乘后再乘以标准系数，即为该九肽或十肽与HLA-AM201的 结合系数。最后，选取结合系数最高的几条肽段作为候选CTL表位。以此 方法找到了具有功能的本发明所述的氨基酸序列，即氮基端-FLNVEWS YI-羧基端。
合成本发明所述的氨基酸序列方法均是现有的成熟技术，它是按照如 下的方法制成的
采用标准Fmo c方案，起始选用0.0125 mmol， P S C树脂(A B I公司生产，批号A5F013)，分别按照权利要求1、 2、 3或4所述的序 列特征，使肽链从C端逐个向N端延伸，各氨基酸原料(美国A B I公 司生产)的用量为0. lmmo 1 。各种氨基酸保护基团是各氨基酸的 alpha氨基为P m o c保护，其余侧链保护基团，A r g (M t r ) 、 t yr(tBu)、 Thr(tBu)、 Tyr(tBu)、 Asp(OtB u)。每步缩合都加入H o B t /D c c活化保护氨基酸的羧基。每步 縮合用含有20。/。六氢吡啶的NMP溶液去除Fm o c保护基，肽链合成后，按照A B I公司推荐的步骤，将含树脂的肽链加入处于冰浴条
件下的混合反应液中，反应液的成分结晶苯酸0. 75g 、酒石酸乙二胺 (E D T )0. 25m 1 、苯硫基甲烷(T h i o n a i s o 1 e ) 0. 5 m 1 、 去离子水0.5m 1 、三氟乙酸10m 1 。在室温条件下持续搅拌，反应 时间为4. 5小时，把肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基。将 混合液经4G的玻璃滤器过滤，以滤掉切下的树脂及保护基团，并用三 氟乙酸冲洗反应瓶和滤器，将滤液在常温下低压蒸发至l 2m 1 ，加 乙醚50m 1使多肽沉淀后，经6G滤器过滤后，冷冻干燥，所得便是肽 产品。以上过程都是在AB I —431A固相自动肽合成仪(美国生产) 上完成。
本发明涉及的合成多肽药物或疫苗可以室温保存、运输，也可以 自动化批量生产。
使用现有的成熟技术，制备表达高致病性禽流感病毒H5N1感染的靶 细胞，叫HEK293细胞；
按照本领域公知的方法获得HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞 (简称PBMC);
培养上述PBMC细胞24小时后，取悬液(2X 106/ ml) 4瓶。加入本发 明所述的氨基酸序列多肽(20ug/ml)，加入等量完全培养基作为对照组， 37 °C， 5"K)C02环境下孵育。7天后重复该刺激过程，共反复刺激3次。 最末一次刺激后第3天收集悬浮细胞，这些细胞具有针对高致病性禽流感 病毒H5N1之H5蛋白的靶细胞的细胞毒性CTL细胞，计数检测发现使 用本发明涉及的合成多肽药物或疫苗可以使CTL细胞数量较对照组增 加45%誦88%。
将转染了高致病性禽流感病毒H5N1之H5基因的HEK293细胞与上述 CTL细胞共同孵育，发现该CTL细胞可以溶破转染了高致病性禽流感病毒 H5N1之H5基因的HEK293细胞，溶破率得到60%-88%。
由于采用了上述技术方案，本发明具有便于运输保存和自动化批 量生产的优点，它具有激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能 力，该特异性CTL细胞具有杀伤、溶破具有高致病性禽流感病毒H5N1 之H5基因的靶细胞，效果明显，而且无毒副作用。具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明
本发明的氨基酸序列为氨基端-FLNVEWSYI-羧基端；以赖氨酸为接
头，将多个该氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。
该多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以 增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量 提高50%-80%，还可以激活CTL溶破高致病性禽流感病毒H5N1之H5基 因的细胞，溶破率为60%-88%。
实施例l:它的氨基酸序列可以为.-
该多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以 增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量 提高60%，还可以激活CTL溶破对高致病性禽流感病毒H5N1之H5基因 的细胞，溶破率为83.10%。
实施例2:它的氨基酸序列也可以为
该多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以 增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量 提高50%，还可以激活CTL溶破对高致病性禽流感病毒H5N1之H5基因 的细胞，溶破率为79.0%。
氨基端-TIGECPKYV-羧基端实施例3:它的氨基酸序列还可以为
氨基端-FLNVEWSYI -羧基端 氨基端-NLYDVRLQL -羧基端 氨基端-FLNVEWSYI -羧基端 氨基端-TIGECPKYV -羧基端
该多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以 增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量 提高55%，还可以激活CTL溶破对高致病性禽流感病毒H5N1之H5基因 的细胞，溶破率为68.0%。
以上所述的氨基酸序列方法均是现有的成熟技术，它是按照如下的方 法制成的
采用标准Fmo c方案，起始选用0.0125 mmol，P S C树脂(AB I 公司生产，批号A5 F013)，分别按照权利要求1、 2、 3或4所述的序列特 征，使肽链从C端逐个向N端延伸，各氨基酸原料(美国A B I公司生 产)的用量为O.lmmo 1 。各种氨基酸保护基团是各氨基酸的alpha 氨基为Pm o c保护，其余侧链保护基团，A r g(M t r)、 t y r(t B u)、 Th r(tBu)、 Ty r(tBu)、 As p(OtBu)。每步縮合都加 入H o B t/D c c活化保护氨基酸的羧基。每步縮合用含有20%六氢 妣啶的NMP溶液去除Fmo c保护基，肽链合成后，按照AB I公司 推荐的步骤，将含树脂的肽链加入处于冰浴条件下的混合反应液中， 反应液的成分结晶苯酸0. 75g、酒石酸乙二胺(EDT)0.25m 1 、苯 硫基甲垸(T h i o n a i s o 1 e)0.5m 1 、去离子水0.5m 1 、三氟 乙酸10m 1 。在室温条件下持续搅拌，反应时间为4.5小时，把肽链从 树脂上裂解下来，同时去除多种保护基。将混合液经4G的玻璃滤器过滤，以滤掉切下的树脂及保护基团，并用三氟乙酸冲洗反应瓶和滤器，
将滤液在常温下低压蒸发至l 2m 1 ，加乙醚50m 1使多肽沉淀后， 经6G滤器过滤后，冷冻千燥，所得便是肽产品。以上过程都是在A B I-431A固相自动肽合成仪(美国生产)上完成。
下面结合实验例对本发明作如下说明
实验例1:制备表达高致病性禽流感病毒H5N1之H5蛋白的靶细胞模 型(HEK293细胞)
1、 主要仪器微量高速冷冻离心机；MJ. Research PCR扩增仪； 凝胶成像分析系统；电泳系统；FX-302型暗箱式紫外检测仪；YJ-875 SA 型超净工作台；THZ-C恒温振荡器；FA 1004电子天平；康乐电热恒温水浴 箱；《300型pH计。
2、 主要材料1)菌株E. coli DH5a。 2)质粒HA/pIRES2-EGFP 为含目的基因H5N1之H5的重组质粒；pIRES2-EGFP为含绿色荧光蛋白报 告基因的真核表达载体，含有Kana抗性基因。购自Clontech公司。
3 、主要溶液配制
1) LB培养液胰蛋白胨10g，酵母提取物5g， NaCl 10g，溶于800ml ddH20中，用5MNaOH调整pH至7. 4，定容至1000ml，分装成100ml 后，高压蒸气灭菌，4X:保存。
2) LB固体培养基100ml LB培养液中加入L8g琼脂粉，高压蒸气灭 菌后，铺板，4。C保存。
3) LB琼脂+Amp培养液配制LB，高压消毒。冷却至5(TC左右，加Amp 使终浓度为100!ig/ml， 4。C保存。
4) LB琼脂+Amp固体培养基配制LB固体培养基，高压消毒。冷却 至5(TC左右，力卩Amp使终浓度为100|ug/ml，铺板，4。C保存。
5) LB琼脂+Kana培养液配制LB，高压消毒。冷却至5(TC左右， 加Kana使终浓度为50吗/ml， 4"C保存。
6) LB琼脂+Kana固体培养基配制LB固体培养基，高压消毒。冷 却至50。C左右，加Kana使终浓度为50|ig/ml，铺板，4。C保存。7) 电泳缓冲液(50xTAE): Tris碱24. 2g， 0. 5M EDTA(pH8. 0) 10ml， 冰乙酸5. 71ml，加水至100ml。应用浓度为lxTAE。
8) 溴化乙锭(EB):在20mlH20中溶解0. 2gEB，混匀后于4。C避光 保存。
9) 0. 1M CaC12: CaC12-2H20 1. 47g，溶解于100ml水中，高压消毒， 4'C保存。
4
反应体系
Pl(10nmol/L)
P2(10|umol/L)
dNTP(2.5mM)
10xBuffer
MgCl2 (25mM)
pBR322/HPV16
口fu Taq (5u/ul)
ddH20 up to 反应条件 1 cycle 30cycle
1 cycle
反应完毕后取4)ul反应产物
l|Lll
5^il 3jul
ljLll
50^1
94°C 94 °C 54 °C 72 °C 72 °C 4°C
2min
50sec
30sec
2min
lOmin
Hold
在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。
6、 HEK293细胞的培养
1) 细胞寄到后，置于37。C、 5%<:02培养箱中培养，在倒置显微 镜下观察，待细胞贴壁至70-80%的时候，进行传代培养
2) 弃去细胞培养液，PBS洗涤2 3遍
3) 用0.25%胰蛋白酶(含0.02^EDTA)消化至悬浮状态迅速加 入含血清的1640培养基终止消化4) 500rpm/min离心5min
5) 弃上清，加入新鲜培养基4mL，吹打重悬细胞
6) 分装至3个培养瓶内，每个培养瓶内再加入2mL培养基
7、质粒DNA转染HEK293细胞
细胞准备收获处于指数生长期细胞约lxl()S个细胞接种于6孔细胞培 养板中，使细胞达到40-60%融合，置于37t:、 5XC02培养箱中，无血清 培养24小时。转染48小时后，将6孔培养板直接置于荧光显微镜下，在 479nm的激发波长下激发绿色荧光，观察绿色荧光蛋白EGEP以及H5N1 之H5蛋白在细胞中的定位和表达情况。
实验例2:体外诱导特异性性细胞毒性T淋巴细胞(CTL) 1、试剂和材料
1) 含10%胎牛血清的RPMI1640培养基。
2) PBS洗涤液。
3) 重组人白介素(recombinant human IL-2)。
4) 规格为1毫升和IO毫升的刻度吸管。
5) 75%酒精，无菌棉球，镊子。
6) 显微镜、水平式离心机。
7) HLA-A*0201阳性人体血液20mL (4x5mL)。按照本领域公知的方 法获得外周血单核细胞(PBMC)。
2、方法
培养PBMC细胞24小时后，取悬液(2X106/ ml) 4瓶。加入本发明所 述的基本的氨基酸序列多肽(20w g/ ml)和等量完全培养基，同时培养瓶内 加入rhlL-2使终浓度为50U/mL 、 37 °C、 5。/。C02下孵育。7天后重复该 刺激过程，共刺激3次。每次刺激之间，视情况加入新鲜RPMI1640培养 基，每一次刺激时均需吹打贴壁细胞至悬浮状态，洗涤，换培养瓶。按照 该方法便可以得到细胞毒性CTL细胞。实验例3:51Cr释放试验检测CTL细胞溶破hek293细胞的能力
1、 主要仪器YJ-875 SA型超净工作台；水平式离心机；康乐电热恒 温水浴箱；恒温孵箱；y-计数仪
2、 主要实验材料靶细胞为转染了 H5N1之H5基因的HEK293细胞； 效应细胞为本发明所述的基本的氨基酸序列多肽与重组人IL-2协同刺激 人外周血单个核细胞后得到的T淋巴细胞。放射性同位素Na251Cr 04 ; RPMI1640培养基；盐酸(HC1);规格为6孔、96孔培养瓶。
3 、靶细胞准备收获处于对数生长期的耙细胞(转染了 pIRES2-EGFP-H5Nl之H5质粒的HEK293细胞)，洗涤后调整细胞浓度为 2xl06/ml。取lxl()6细胞(0.5ml)，加Na251Cr O4100fici， 37。C孵育2 3h， 每15min轻轻振摇一次。用含有10%FCS的RPMI-1640洗涤3次，每次 800rpm离心，5min，弃上清，重悬细胞至浓度为1 x105 / ml。 96孔培养板 中，每孔加100^1(1><104细胞)，每份3个复孔，共42孔。
4、 ctl细胞的加入每孔加入100pl不同细胞浓度的CTL细胞，最 大释放组加入100pl的l^mol/LHCL，以此溶破靶细胞效率为100%;自 然释放组加lOO]il完全培养基，以此为阴性对照组。每孔取出100(^1上清， 按照本领域公知的方法在y计数仪上测定cpm值。
结果表明该多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核 细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL) 的数量提高45%-88%，还可以激活CTL溶破对H5N1之H5蛋白的细胞， 溶破率为60%-88%。H5N1之H5氨基酸系列表的计算机可读形式 〈110〉吕凤林
〈120〉一种治疗高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病的多肽药物
〈130〉无
〈140〉申请号
<141〉2008-10-8
<160〉3
〈170〉Patent In Version 2. 1
〈210〉1
〈211〉9
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
<400〉1
PheiLeu Asn Val Glu Trp Ser Tyr Iley
〈210〉2
〈211〉9
〈212〉PRT
<213〉人工序列
<400〉2
Asn, Leu Tyr Asp Val Arg Leu Gin Leu9
〈210>3
〈211>9
〈212〉PRT
<213>人工序列
〈400〉3
Th:n lie Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val9
权利要求
1. 一种治疗高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病的多肽药物，其特征在于它的氨基酸序列为氨基端-FLNVEWSYI-羧基端；以赖氨酸为接头，将多个该氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。
2. 如权利要求1所述的治疗高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病的多 肽药物，其特征在于它的氨基酸序列为
3.如权利要求1所述的治疗高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病的多 肽药物，其特征在于它的氨基酸序列为
4.如权利要求1所述的治疗高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病的多肽药物，其特征在于它的氨基酸序列为l基端-TIGECPKYV-羧基端
全文摘要
一种治疗高致病性禽流感病毒H5N1引发疾病的多肽药物，其特征在于它的氨基酸序列为氨基端-FLNVEWSYI-羧基端；以赖氨酸为接头，将多个该氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。本发明具有便于运输保存和自动化批量生产的优点，它具有激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力，该特异性CTL细胞具有杀伤、溶破具有高致病性禽流感病毒H5N1之H5蛋白的靶细胞，效果明显，而且无毒副作用。
文档编号A61K38/10GK101411866SQ20081023321
公开日2009年4月22日 申请日期2008年12月3日 优先权日2008年12月3日
发明者吕凤林, 一 张, 李元朝, 虎 梅, 田菲菲 申请人:中国人民解放军第三军医大学