专利名称：：高致病性禽流感病毒h5n1-ha基因的改造及其重组腺相关病毒疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物医药领域。本发明涉及一种禽流感病毒重组疫苗，具体而言本发明提供了改造优化的H5m-HA基因，以及在此基础上构建的禽流感病毒H5m的重组疫苗，即含上述两种基因的重组腺病毒及重组腺相关病毒的疫苗。
背景技术：
：禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)属于正粘病毒科、流感病毒属、甲型流感病毒。自然宿主是禽类，对人存在种属屏障。1997年首次在香港报道的人感染禽流感病毒H5W中，18例感染者中有6例死亡。之后病毒感染人数和传播范围不断扩大，截至2009年9月24日，WHO确证了15个国家的人感染H5m病例共442例，其中死亡262例。我国确诊感染38例，死亡25例。虽然感染人数在过去几年里总量相对较低，但不可忽视的是，病毒的致死性仍大于50%。此外，虽然目前仅在少数几个国家发现病毒在家族内部有限的人传人传播，但是禽流感病毒H5W近几年表现出来的基因快速进化和毒力时有改变，以及在野生鸟类和家禽中持续传播，提示病毒对人们健康的威胁不断增大。疫苗一直是抵御病毒感染的最主要的防线之一。病毒的血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用。研究发现，HA可诱导机体产生中和性抗体，是AIV中最为重要的保护性抗原。因而，HA—向是禽流感疫苗研制的热点。另外，国外的禽流感H5m疫苗相关研究大多是以欧美的流行株为基础的。由于流感病毒的高变异性，不同流行株疫苗之间的交叉反应有限，因此本发明选择我国有代表性的禽流感病毒流行株A/Anhui/1/2005的HA基因(GI:87137936)。腺病毒载体具有以下优点(1)宿主范围广范，对人类致病性低；(2)可感染分裂期及静止期细胞并表达外源基因；(3)复制效率高，可达到很高的滴度；(4)外源基因容量大；(5)外源基因产物可进行正确的折叠及翻译后加工；(6)不会产生插入突变，以染色体外形式存在；(7)可同时表达多个基因。腺病毒载体在疫苗方面的应用中，以同时能够诱导体液和细胞免疫为特点。因此，我们考虑将AdV载体和HA基因联合起来同时诱导体液和细胞免疫。我们参照人的优势密码子使用原则对HA基因全长编码区的核苷酸序列进行了优化，明显提高了HA抗原的表达量，并在此基础上构建了AdV疫苗。此外，腺相关病毒(Adeno-associatedVirus,AAV)载体因其本身的特点也越来越受人瞩目。AAV是一种复制缺陷型病毒，在正常细胞中并不发生产毒性感染，只有在与辅助病毒共同感染时才发生产毒性感染。与其他病毒载体相比，这类载体更象DNA载体载体中不含任何AAV的结构基因，载体基因组中含有的唯一病毒序列是非编码的反向末端重复序列(ITR)。因而转导后不合成天然的病毒蛋白，确保免疫反应主要由转移基因引起。另外，AAV载体还具有以下优点①安全性好，在临床前动物模型及人体临床试验研究已经多年；②宿主范围广，不仅可以转染分裂细胞，而且可以转染静止期细胞；③可长期稳定地表达外源基因。AAV载体在疫苗方面的应用中，在刺激机体的体液免疫应答方面已经表现出了独特的优势，已证明多种病毒基因的AAV载体疫苗能够诱导产生更高的和更持久的抗体反应。而HA抗原的特点就是能够刺激机体产生保护性抗原。鉴于此，我们也考虑将AAV载体和HA基因联合来增强疫苗的体液免疫效果。我们在对HA基因进行优化的基础上，又对HA蛋白裂解位点附近的核苷酸序列进行改造来减少连续的碱性氨基酸，从而降低HA抗原的细胞毒性和增加HA疫苗的安全性，并在此基础上构建了AAV疫苗。
发明内容本发明的目的是提供人用的重组禽流感病毒疫苗。另外，研究发现，HA首先是作为单一多肽(HAO)被合成，HAO裂解成HAl和HA2是禽、流感病毒感染的先决条件(KlenkHD,RottR,OrlichM,etal.ActivationofinfluenzaAvirusesbytrypsintreatment.Virology，1975，68:426_439·)。HA对细胞蛋白酶的易感性和这些酶在宿主组织里的分布是病毒泛嗜性的决定因素。低致病力毒株由于HAO裂解位点的氨基酸缺乏精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸的重复，切割率极低，不易裂解。而禽流感病毒H5W的HAO裂解位点含有多个连续的碱性氨基酸，导致可裂解它的蛋白酶种类更多，从而致病性更强。此外，裂解位点的多个连续碱性氨基酸残基还给常规的鸡胚生产疫苗方式带来困难。基于以上的考虑，本发明人通过常规的反向遗传学技术，对来自禽流感病毒H5W的HA裂解位点进行了改造。因此，本发明对经过密码子优化后的HA基因进行了改造。一方面，本发明提供了一种改造后的优化的禽流感病毒HA基因，其编码氨基酸序列中裂解位点附近的连续碱性氨基酸残基数目减少，减小了表达产物的细胞毒性。在本发明的一个优选实施方案中，所述改造后的优化的禽流感病毒HA基因的核苷酸序列如SEQIDNO2所示。将改造后的优化HA基因转染到BHK细胞进行瞬时表达试验，结果发现改造后的优化的HA基因仍可有效表达蛋白，与单纯优化的HA基因相比，切割位点的改造未对蛋白表达量造成明显影响。另一方面，本发明还提供了另一种用于防治高致病性禽流感病毒的疫苗组合物，其中含有本发明所述的重组腺相关病毒和一种或多种药物学上可接受的载体和/或佐剂，该重组腺相关病毒包含腺相关病毒载体和经过改造后的优化的禽流感病毒HA基因。在一个优选实施方案中，所述的腺相关病毒载体为AAV-1，所述的改造后的优化的禽流感病毒HA基因具有如SEQIDNO2所示的核苷酸序列。用本发明所述的含有改造后的禽流感病毒HA基因的重组腺相关病毒免疫小鼠后，通过血凝抑制(HI)实验来监测疫苗的中长期体液免疫效果。结果发现，疫苗能够激发较高的抗体水平，并且抗体维持较长时间。(参见附图3)另一方面，本发明还提供了所述改造优化的HA基因在在制备用于防治高致病性禽流感病毒的药物或疫苗组合物中的用途，其中所述高致病性禽流感病毒优选为禽流感病毒H5m另一方面，本发明提供了本发明所述的重组腺病毒及含有其的疫苗组合物在制备用于防治高致病性禽流感病毒的药物中的用途。本发明中所述的涉及pDC315质粒，用于重组AdV疫苗的包装。该质粒由MCMV启动子、SV40polyA翻译终止信号、氨苄抗性基因、AdV相关序列及真核重组酶等元件组成，共3913bp。该载体和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔEl，3cre均是Microbix公司产品，两者共转染293包装细胞后，可以得到含有目的基因的重组病毒。本发明中所述的还涉及pSNAV质粒，用于重组AAV疫苗的包装。该质粒由CMV启动子、SV40polyA翻译终止信号、氨苄抗性基因、新霉素抗性基因、原核细胞复制起点等常规元件组成，共7015bp。该载体是本元正阳公司产品。该载体可采用新霉素抗性基因来筛选长期表达目的基因的真核细胞克隆。再通过辅助病毒HSV感染的方式，得到含有目的基因的重组病毒。图1为含有优化型HA基因的重组AdV疫苗肌肉免疫BALB/c小鼠后用HI方法检测体液免疫结果。图中各点用HI滴度log2的均值士标准误表示。图2为含有优化型HA基因的重组AdV疫苗肌肉免疫BALB/c小鼠后用ELISPOT方法检测细胞免疫结果。图中各点用IXIO6脾细胞中斑点数的均值士标准误表示。图3所示的是含有改造后优化型HA基因的重组AAV疫苗肌肉免疫BALB/c小鼠后HI滴度的监测结果。图中各点用HI滴度log2的均值士标准误表示。本发明的优势之处在于1.疫苗毒株的选择国外的禽流感H5W疫苗相关研究大多是以欧美的流行株为基础的。由于流感病毒的高变异性，不同流行株疫苗之间的交叉反应有限，因此本发明选择我国有代表性的禽流感病毒流行株A/Anhui/1/2005为疫苗株，该毒株是WHO推荐的唯一来自国内的高致病性禽流感H5W疫苗株。2.HA基因的优化本发明对!《^(Α/ΑηΙη/ΛΟΟδ)的HA基因(GI=87137936)全长编码区的核苷酸序列参照人的优势密码子使用原则进行优化，实验证明，优化后的HA基因在真核细胞中的表达量明显提高，并成功包装出重组AdV病毒。3.含优化型HA基因的AdV疫苗，能够同时激发出较高的体液和细胞免疫反应。4.HA裂解位点的改造本发明对H5m(A/Anhui/1/2005)的HA蛋白裂解位点及其附近的核苷酸序列进行改造，来减少连续的碱性氨基酸，实验证明，改造后的HA基因能够在真核细胞中高效表达，并成功包装出AAV重组病毒。5.由改造后的HA基因构建的AAV疫苗，能够激发出较高效和持久的体液免疫应答。除另有说明外，本申请中的所有科技术语的都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本申请中描述类似或等同的方法及材料都可用于实施或检验本发明，但是下文仍还是对合适的方法和材料进行了描述。本申请中引用的全部出版物、专利申请、专利及其他参考文献其全部内容在此引入作为参考。如有抵触，包括定义，以本申请为准。下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式，而决不构成对本发明的限制。本领域技术人员应该理解的是，在不违背本发明的精神和原则的前提下，对本发明进行改动得到的技术方案都将落入本发明的待批权利要求范围内。实施例在本申请中，如无特别说明，本发明的实施都使用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术都是本领域技术人员所掌握的。这些技术在下列文献中有详细地描述Sambrook等人编著的MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版(1989)；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins编著，1984)；TranscriptionandTranslation(B.D.Hames禾口S.J.Higgins编著，1984)；ImmnochemicalMethodsinCellAndMolecularBiology(AcademicPress,London)。实施例IHA基因的优化1.1HA基因的优化参照人的优势密码子使用原则(http://www.kazusa.or.ip/codon/),在不改变氨基酸序列的前提下，对H5m(A/Anhui/1/2005)(参见,ShuYL,YuHJ,LiDX.LethalavianinfluenzaA(H5N1)infectioninapregnantwomaninAnhuiProvince,China.NEnglJMed2006；354(13)-.1421-1422.)的HA基因全长编码区核苷酸序列(1704bp)(GI=87137936)进行密码子优化，然后利用软件核查设计的序列氨基酸序列比对一致，并确认序列中不含有克隆需要的酶切位点(EcoRI和BamHI)。将最终序列委托北京利嘉富诚生物技术有限公司合成。经TaKaRa公司测序验证正确，最终得到优化后的HA基因序列，命名为Mod.HA，其核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。1.2将船(1.拟基因克隆入？0〇315载体用EcoRI和BamHI双酶切含Mod.HA基因的质粒和pDC315质粒(购自Microbix公司)，回收1.7kb左右Mod.HA片段和3.9kb左右的线性化pDC315片段，将二者连接并转化大肠杆菌DH5α。经酶切和测序鉴定得到含Mod.HA基因的真核表达质粒，命名为pDC315-Mod.HA。1.3质粒pDC315-Mod.HA的体外表达鉴定293T细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，按照4XIO5/孔的细胞量将其接种到六孔板中，每孔含2ml细胞悬液，在37°C的CO2培养箱中培养过夜，使其密度达到70%-90%。按照FuGENEHD(购自罗氏公司)的说明书，将质粒pDC315_Mod.HA和含有野生型HA基因(Wt.HA)的质粒分别转染细胞。质粒和转染试剂的量分别是2yg和6μ1。转染后48-72h，收获细胞。每孔细胞加入100μ1的细胞裂解液(Tris-Cl50mMpH8.0，NaCl150mM,SDS0.1%，NP-401%，去氧胆酸钠0.5%，抑肽酶1μg/ml，苯甲基磺酰氟(PMSF)100μg/ml(临用前加入))冰上5-lOmin裂解细胞，12000r/min离心5min后，取上清加1/2体积的3X加样缓冲液，沸水中煮5-lOmin。取20μ1进行12%SDS-APGE电泳，转PVDF膜后，使用兔抗H5W全病毒多抗(国家流感中心制备，11000稀释)和兔抗β-actin多抗(博奥森生物技术有限公司，1300稀释)为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔多克隆抗体(12000稀释)为二抗，DAB显色。Westernblotting方法来检测和比较HA蛋白表达。结果显示，Wt.HA和Mod.HA基因均可检测到HA蛋白条带(包括HAO和HAl条带)。将Westernblotting结果扫描后使用TotalLab1.0软件进行分析，用β-actin的条带进行上样量的校准后发现，Mod.HA基因比Wt.HA基因的表达量提高了约50倍。说明Mod.HA基因在真核细胞中的表达量明显提高。实施例2含Mod.HA基因的重组AdV病毒的获得构建含优化型HA基因的重组AdV病毒。2.1含Mod.HA基因的重组AdV病毒的包装将293细胞按照4XIO5/孔接种细胞到六孔板中，每孔含2ml细胞悬液，在37°C的CO2培养箱中培养过夜，使其密度达到70%-90%以上。按照FuGENEHD(购自罗氏公司)的说明书，将上述1.2中制备的质粒pDC315-Mod.HA和骨架质粒pBHGloxAEl，3Cre(购自Microbix公司)各2μg和转染试剂12μ1共转染每一孔细胞。转染后7_10天，收获细胞。在-80°C和37°C条件下反复冻融3次。离心后收集上清。取少量上清再感染293细胞，观察细胞出现病变，确认获得重组病毒。2.2重组AdV病毒的鉴定PCR检测Mod.HA基因的插入，PCR检测上游引物5‘-GAATTCGCCGCCACCATGAACCCCAACCAG-3‘，下游引物5‘-GTCGACTTATCACTTGTCGATGGTGAAGG-3‘，扩增的片段大小约1.7kb。同时，取部分病毒感染293细胞，至细胞几乎完全病变时收获。细胞的裂解方法同实施例1中所述。Westernbloting鉴定Mod.HA基因的表达，使用兔抗H5m全病毒多抗(11000稀释)，碱性磷酸酶标记的羊抗兔多抗(11000稀释)为二抗，BCIP/NBT显色。结果显示，包装出的重组AdV病毒PCR能够扩增出约1.7kb的Mod.HA目的基因条带；westernblotting能够检测到HA蛋白(包括HAO和HAl)表达。上述实验说明，我们获得了含有含优化后HA基因的AdV重组病毒，命名为rAdV-Mod.HA。实施例3重组病毒rAdV-Mod.HA免疫小鼠实验3.1小鼠免疫和分组BALB/c小鼠随机分成2组，每组8只，在第0天和第28天免疫两次，肌肉注射。第35天检测免疫反应。具体免疫内容和剂量见表1。表1小鼠分组和免疫剂量组别名称免疫内容和剂量1PBSPBS，100μ1/次2AdVrAdV-Mod.HA,2.5xl08TCID50/100/xl/次3.2免疫小鼠中H5mHA体液免疫反应的检测初免后第35天采集小鼠的静脉血，分离血清。参见人感染高致病性禽流感诊断标准(WS284-2008)中的血凝抑制检测，每份血清取10μ1，加入4倍体积(40μ1)的受体破坏酶(RDE)于37°C水浴中18h，然后再放入56°C水浴中30min灭活RDE。之后加浓马红血球去除血清中的非特异性凝集素，离心后，将上清倍比稀释后依次加入96孔U型板，同时做阴性血清对照和标准诊断血清对照，然后每孔加入等体积灭活的流感病毒A/Anhui/1/2005(H5N1)(来自国家流感中心)(含4个血凝单位)，混勻，室温孵育60min。每孔再加入的马红细胞悬液，混勻后室温孵育60min，观察结果。将抑制红细胞凝集出现时血清的最高稀释度记为结果值。检测结果见图1。rAdV-Mod.HA疫苗的HI滴度的几何均值达到1810。3.3免疫小鼠中Η5^ΗΑ细胞免疫反应的检测初免后第35天颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠脾脏，用淋巴细胞分离液分离小鼠脾淋巴细胞，采用酶联免疫斑点(ELISP0T)方法检测分泌IFN-Y的T淋巴细胞，具体方法如下取50μ14X106/ml的小鼠脾淋巴细胞和等量的4μg/ml肽(HA526_543IGTYQILSIYSTVASSLA，是我们之前实验中筛得的反应最好的肽段)加入已包被抗小鼠IFN-γ抗体并封闭过的ELISPOT板中，每只小鼠做复孔，另外，每只小鼠的阴性对照孔只加等量的细胞不加肽，阳性对照孔加入细胞和终浓度为20μg/ml的刀豆蛋白(ConA)。37°C培养箱孵育3648h，弃掉培养液，PBST洗涤ELISPOT板后分别经过生物素标记的一抗和链霉亲和素HRP的二抗进行反应，最后加入AEC显色液显色。检测结果见图2。rAdV-Mod.HA疫苗免疫后的1XIO6的小鼠脾淋巴细胞中细胞斑点数达到1750。以上试验结果表明，rAdV-Mod.HA疫苗能在BALB/c小鼠体内同时诱导较高的体液和细胞免疫应答。实施例4Mod.HA基因的改造为了进一步降低HA蛋白的细胞毒性，增加疫苗的安全性，本实施例对Mod.HA核苷酸序列进行改造，减少HA蛋白裂解位点及其附近的氨基酸序列中的连续的碱性氨基酸。4.1Mod.HA基因的改造将HA蛋白切割位点附近的氨基酸序列(PLRERRRKR丨GLF)通过缺失和点突变改造成为PQRETR丨GLF。相应区域的核苷酸序列(5'-CTGAGAGAGAGAAGAAGAAAGAGA-3‘)改造成为(5‘-CAGAGAGAGACCAGA-3‘)。具体的改造包括9个核苷酸位点的缺失和3个核苷酸位点的点突变，委托上海生工完成。再由英骏公司进行测序鉴定，得到改造的优化型HA基因，命名为ΔMod.HA，其核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。4.2ΔMod.HA基因构建到pSNAV载体用EcoRI和SalI双酶切含有AMod.HA基因的质粒和pSNAV质粒(购自本元正阳公司)，回收1.7kb的AMod.HA片段和7.Ikb的线性化pSNAV片段，将两者连接并转化大肠杆菌DH5α。经EcoRI和SalI双酶切和测序鉴定后，得到构建正确的pSNAV-ΔMod.HA质粒。4.3质粒pSNAV-ΔMod.HA的体外表达鉴定BHK细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，实验前1天，将细胞按照4XIO5细胞/孔的量接种细胞到六孔板中，每孔含2ml2%胎牛血清的培养基。次日，细胞达到70-90%汇合度，按照FuGENEHD的说明书，将质粒pSNAV-ΔMod.HAl.5μg和转染试剂4μ1转染1孔细胞。同时做Wt.HA和Mod.HA基因的质粒转染作为对照，转染后72h，收获细胞(具体操作同实施例1中所述)。Westernblotting鉴定分别使用兔抗H5W全病毒多抗(11000稀释)及GAPDH单克隆抗体(购自ProteinTech公司，内参抗体，11000稀释)为一抗、碱性磷酸酶标记的羊抗兔多抗(11000稀释)为二抗，BCIP/NBT显色。检测结果发现，Wt.HA、Mod.HA和ΔMod.HA基因均可检测到HAO目的蛋白条带(大小约75kD)，其中Mod.HA和AMod.HA基因还能够检测到HAl蛋白条带(大小约50kD)，两者表达HA水平相近，均明显高于野生型HA基因的表达。说明AMod.HA基因能够有效表达蛋白，切割位点的改造未对蛋白表达量造成明显影响。实验结果表明获得的AMocLHA基因能够在真核细胞中有效表达HA蛋白。实施例5含有AMod.HA基因的重组AAV病毒的获得构建含有改造后HA基因的重组AAV病毒。5.1质粒pSNAV-ΔMod.HA压BHK细胞系及筛选单克隆实验前1天，按照6.5XIO4细胞/孔的量接种BHK细胞到24孔板中，每孔含0.5ml2%胎牛血清的培养基。次日，细胞达到70-90%汇合度，按照FuGENEHD的说明书，将质粒PSNAV-ΔMod.HAO.4μg和转染试剂1.2μ1转染1孔细胞。转染24h，补加G418至终浓度为800μg/ml。转染后14天，收获部分细胞进行PCR检测(具体方法同实施例2中所述)；同时取一部分细胞传到六孔板，次日加丁酸钠至终浓度为20mM，培养72h收获细胞，做westernblotting检测HA蛋白表达，具体操作同实施例1中所述。Westernblotting结果发现，有2个细胞株(细胞株1和2)检测到了与阳性对照(质粒pDC315-Mod.HA瞬时转染的样品)位置一致的HAO目的蛋白，说明筛选到表达HA蛋白的BHK细胞株。将细胞株1进行单克隆筛选，使用96孔板有限稀释的方法。具体来说，先在96孔板的每孔加入100μ1含15%FBS的DMEM培养液，将消化后的细胞株1稀释成103/ml的浓度，使用12孔排枪加入到96孔板的第1排中，每孔加入100μ1，混勻后再吸出100μ1细胞悬液加入第2排，依次加入到96孔的每一排，最后的100μ1悬液弃掉。37°C培养的第710天，取镜下含单个细胞团的孔进行消化，放大到24孔板中继续培养，之后取部分细胞进行PCR鉴定(操作同前)，同时取一部分细胞加丁酸钠刺激，用免疫荧光法(细胞滴片后用丙酮固定，一抗使用兔抗流感病毒H5W多抗，1100稀释，二抗使用FITC标记的羊抗兔二抗，1100稀释)鉴定HA蛋白表达。根据免疫荧光的强弱，我们选择了1C3强表达克隆进行病毒包装。5.2含有AMod.HA基因的重组AAV病毒包装及鉴定使用HSV病毒感染含HA基因的细胞克隆1C3，获得重组AAV病毒。提取病毒DNA，PCR扩增方法来鉴定HA基因(具体操作同实施例2中所述)。另外，将病毒感染BHK细胞，加入丁酸钠刺激基因表达，48-72h后做免疫荧光鉴定HA基因的表达(具体操作同本实施例5.1中所述)。结果证明重组病毒中的HA基因能够有效表达目的蛋白。上述实验说明，我们获得了含有AMod.HA基因的重组AAV病毒，命名为rAAV-ΔMod.HA。实施例6重组病毒rAAV-ΔMod.HA免疫小鼠实验6.1小鼠免疫和分组BALB/c小鼠随机分成2组，每组8只，单次免疫，肌肉注射。具体免疫内容和剂量见表2。表2小鼠分组和免疫剂量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>6.2免疫小鼠中Η5^ΗΑ体液免疫反应的检测初免后第28、42、56和70天从免疫小鼠的眼眶静脉丛取少量血，分离血清。HI检测方法同实施例3中所述。检测结果见图3。由图可见，AAV疫苗在各检测点的HI滴度均明显高于PBS组。免疫后AAV疫苗的HI滴度缓慢升高，在免疫后第56天达到最高值640，之后有所下降，在70天时可检测到HI滴度在190。所有检测点的HI的几何平均滴度均高于80。而研究认为，季节性流感疫苗的HI滴度在40以上时即对免疫人群中的50%个体有保护作用。以上试验结果表明，AAV-HA疫苗能在BALB/c小鼠体内诱导产生较高的抗体水平和较长时间的抗体反应。序列表<110>曾毅马晶张晓光<120>高致病性禽流感病毒H5m_HA基因的改造及其重组腺相关病毒疫苗<130><160>2<170>PatentInversion3.4<210>1<211>1704<212>DNA<213>人工合成<220><221>基因<222>(1)..(1704)<400>1atggagaagatcgtgctgctgctggctatcgtgagcctggtgaagagcgaccagatctgc60atcggataccacgctaacaacagcaccgagcaggtggacaccatcatggagaagaacgtg120accgtgacccacgctcaggacatcctggagaagacccacaacggaaagctgtgcgacctg180gacggagtgaagcctctgatcctgagagactgcagcgtggctggatggctgctgggaaac240cctatgtgcgacgagttcatcaacgtgcctgagtggagctacatcgtggagaaggctaac300cctgctaacgacctgtgctaccctggaaacttcaacgactacgaggagctgaagcacctg360ctgagcagaatcaaccacttcgagaagatccagatcatccctaagagcagctggagcgac420cacgaggctagcagcggagtgagcagcgcttgcccttaccagggaacccctagcttcttc480agaaacgtggtgtggctgatcaagaagaacaacacctaccctaccatcaagagaagctac540aacaacaccaaccaggaggacctgctgatcctgtggggaatccaccacagcaacgacgct600gctgagcagaccaagctgtaccagaaccctaccacctacatcagcgtgggaaccagcacc660ctgaaccagagactggtgcctaagatcgctaccagaagcaaggtgaacggacagagcgga720agaatggacttcttctggaccatcctgaagcctaacgacgctatcaacttcgagagcaac780ggaaacttcatcgctcctgagtacgcttacaagatcgtgaagaagggagacagcgctatc840gtgaagagcgaggtggagtacggaaactgcaacaccaagtgccagacccctatcggagct900atcaacagcagcatgcctttccacaacatccaccctctgaccatcggagagtgccctaag960tacgtgaagagcaacaagctggtgctggctaccggactgagaaacagccctctgagagag1020agaagaagaaagagaggactgttcggagctatcgctggattcatcgagggaggatggcag1080ggaatggtggacggatggtacggataccaccacagcaacgagcagggaagcggatacgct1140gctgacaaggagagcacccagaaggctatcgacggagtgaccaacaaggtgaacagcatc1200atcgacaagatgaacacccagttcgaggctgtgggaagagagttcaacaacctggagaga1260agaatcgagaacctgaacaagaagatggaggacggattcctggacgtgtggacctacaac1320gctgagctgctggtgctgatggagaacgagagaaccctggacttccacgacagcaacgtg1380aagaacctgtacgacaaggtgagactgcagctgagagacaacgctaaggagctgggaaac1440ggatgcttcgagttctaccacaagtgcgacaacgagtgcatggagagcgtgagaaacgga1500acctacgactaccctcagtacagcgaggaggctagactgaagagagaggagatcagcgga1560gtgaagctggagagcatcggaacctaccagatcctgagcatctacagcaccgtg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技术领域：
。本发明提供了一种改造优化的高致病性禽流感病毒HA基因，及含有其的重组腺病毒疫苗。本发明所述改造优化的HA基因不仅显著提供了表达量，而且减少了毒性。实验证明，本发明构建的重组腺病毒疫苗能同时诱导产生很强的体液和细胞免疫应答，可有效防治高致病性禽流感病毒感染。文档编号C12N15/44GK101822842SQ20101010402公开日2010年9月8日申请日期2010年1月29日优先权日2010年1月29日发明者张晓光,曾毅,舒跃龙,马晶申请人:曾毅;马晶;张晓光