专利名称：一种检测高血压易感基因的方法及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属分子生物学和医学领域。涉及一种检测高血压易感基因的方法及检 测试剂盒。更具体地，涉及人线粒体融合基因2 (Mfn2 gene)的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点rs4240897及其与原发性高血压相关性的检测。本 发明还涉及检测这个SNP位点的方法和试剂盒。
背景技术：
原发性高血压(essential hypertension, EH)是一种多因素、多基因疾病，出环 境与遗传因素共同致病的常见而多发的心血管病症，对人类健康造成了极大的影响。随着 分子医学的发展，目前已经发现的高血压相关基因已经有150余种，但足EH的发病机制仍 然不完全清楚，高血压的早期诊断和预防问题仍然未能完全解决。EH是遗传因子和环境共 同作用的结果，血压的变化30% -60%归因于遗传。由于环境因素是可以控制和确认的，而 对高血压遗传学因素却是固定不变的。因此，对可变因素的控制，如对高血压危险因素的预 防，可以在一定程度上延缓和防止高血压的发病，但是对固定不变的遗传因素的认识不足 却在定程度上严重影响着对高血压发病、诊断和治疗。因此对高血压遗传学的研究十分必 要(王佐广，温绍君，吴兆苏.高血压、易感基因与单核苷酸多态性[J].高血压杂志，2001， 9 259-264)。近二十余年来，有关高血压治疗的研究更多地集中在对血压的控制和对靶器官的 保护，并已取得突飞猛进的发展。但是，这些手段并不能从根本上控制血压，目前对人类内 源性抗高血压基因的研究还很少，因此，研究内源性抗高血压机制是今后高血压防治研究 的主要方向之一，具有重要的研究价值和应用前景，如果通过调节内源性抗高血压机制治 疗高血压病，将会促进我国生物医疗技术的发展，并为我国每年节省巨大的医疗费用。目前所发现的高血压相关基因，归结起来可以概括为促高血压基因和抗高血压 基因，Mfn2属于后者。Mfn2的前身是我国学者陈光慧等[Chen GH, Zhang CH, Zhu YQ, et al Expression of anovel gene related to hypertension[J]. NatlMed J China,1997, 77 =823-828.]于1997年对培养的自发性高血压大鼠(SHR)和正常Wistar Kyoto (WKY)大 鼠的血管平滑肌细胞进行差异显示，克隆出一个新基因——增殖抑制基因(hyperplasia suppressor gene, HSG)。它包含有4160bp的碱基对，共编码661个氨基酸(NM_014874， GeneBank Access U41803)。后经一系列体内、体外实验发现[Chen KH,Guo ΧΜ,Dalong Ma, et al. Dysregulationof HSG triggers vascular proliferative disorders[J]Nature Cell Biol，2004，6，872-883]，HSG可以明显地抑制Ras-Raf蛋白丝裂素活化蛋白激酶基 因表达，并且可以激活抗癌基因的表达，有效地阻遏细胞周期和抑制多种细胞的增殖，且 这种抑制作用是通过细胞凋亡的方式实现的。因此HSG基因是原发性高血压的候选基因 之一，后经基因功能研究表明，HSG基因参与线粒体融合，因此正式命名为线粒体融合基因 2 (mitofusin 2，Mfn2)但是目前对Mfn2与EH的研究较少，没有证实rs4240897与EH相关 性的报道。
综上所述，为了最终实现治疗高血压，本领域迫切需要寻求原发性高血压易感基 因，并开发检测原发性高血压易感基因的方法、试剂盒，以及相相关的治疗药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的检测高血压易感基因的方法及检测试剂盒。具体而言，本发明提供了一种高血压易感性基因单核苷酸多态性位点的检测方 法，包括检测Mfπ2基因rs4240897位点的基因型ts4240897带有G基因型的个体，获得所 述基因与原发性高血压的相关性。本发明检测结果显示，携有上述基因的个体其高血压的易感性显著高于普通人 群。所述的rs4240897位于Mfn2的第2号内含子区域中。更好的，所述的rs4240897 位于片段重叠群NT_02193718的6580122位置。本发明提供了一种检测样品Mfn2基因第2号内含子区域的单核苷酸多态性基因 型的方法，该方法包括步骤(a)用Mfn2基因第2号内含子区域的特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩 增产物(b)检测扩增产物中单核苷酸多态性位点rs4240897的基因型。所述的扩增Mfn2基因第2号内含子区域的引物的序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。所述的检测rs4240897的探针的序列如SEQ ID NO 4或者SEQ ID NO 5所示。所述的rs4240897位于片段重叠群NT_021937. 18的6580122位置。本发明还提供了一种检测高血压易感基因的试剂盒，它包括特异性扩增Mfn2基 因第2号内含子区域的引物，其序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID N0:3所示。所述的试剂盒还可以含有与rs4240897结合的探针，其序列如SEQ ID NO 4或者 SEQ ID NO 5 所示。在本发明的一个方面，提供了一种对个体的高血压易感性进行诊断的方法，它包 括步骤检测该个体的Mfn2基因rs4240897位点的基因型，以此判断该个体患高血压的发 病风险是否高于普通人群。在另一优选例中，所述的差异是选自下列的单核苷酸多态性rs4240897 位于 Mfn2，内含子 2 中(片段重叠群 contig :NT_02193718 位置 6580122A/G)其中，脱氧核糖核酸(DNA)序列编号rs4240897位置基于SEQ ID NO 在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在Mfn2基因的单核苷酸多态 性的方法，包括步骤(a)用Mfn2基因内含子2的特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中单核苷酸多态性位点rs4240897的基因型rs4240897 位于 Mfn2，内含子 2 中(片段重叠群 contig :NT_02193718 位置 6580122A/G)
其中，脱氧核糖核酸(DNA)序列编号引物1基于SEQ ID NO 2 ；引物2基于SEQ ID NO 3 ；探针1基于SEQ ID NO 4 ；探针2基于SEQ ID NO 5 扩增产物基于SEQ ID NO 6。所述的样品可以是血液等含有个体基因组的液体、固体或者半固体成分。在一个优选例中，所述的单核苷酸多态性是rs4240897位于Mfn2，内含子2中(片 段重叠群 contig :NT_02193718 位置 6580122A/G)其中，脱氧核糖核酸(DNA)序列编号rs4240897位置基于SEQ ID NOl0在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自下列的试剂Mfn2内含子2特异性引 物、与单核苷酸多态性位点rs4240897结合的探针。其中，脱氧核糖核酸(DNA)序列编号引物1基于SEQ ID NO 2 ；引物2基于SEQ ID NO 3 探针1基于SEQ ID NO 4 探针2基于SEQ ID NO 5 ；扩增产物基于SEQ ID NO 6。在另一优选例中，所述的Mfn2内含子2单核苷酸多态性位点rs4240897 位于 Mfn2，内含子 2 中(片段重叠群 contig :NT_02193718 位置 6580122A/G)其中，脱氧核糖核酸(DNA)序列编号rs4240897位置基于SEQ ID NO 本发明首次发现和证明了 Mfn2基因单核苷酸多态性位点rs4240897 (位于Mfn2 内含子2中，片段重叠群contig :NT_02193718位置6580122A/G)与高血压密切相关，而且 发现了它的新功能Mfn2基因单核苷酸多态性位点rs4240897位于Mfn2，内含子2中(片 段重叠群contig :NT_02193718位置6580122A/G)基因型的改变将导致高血压的发病风险 升高，其中关联研究结果显示，在Mfn2基因rs4240897G — A在病例和对照组中的分布存在 显著性差异(P < 005)，该SNP多态性可改变转录因子结合位点。在此基础上完成了本发 明。Mfn2基因的详细序列可参见登录号为rs4240897的核苷酸序列(可参见网址 http://www. ncbinlm. nih. gov/)。本发明人对Mfn2基因中的内含子2中(片段重叠群contig :NT_02193718位置 6580122)区域进行了测序。Mfn2基因rs4240897位点的多态性可直接用于高血压的个性化治疗。在使用本发 明Mfn2基因rs4240897位点的多态性时，还可同时使用其他治疗高血压的药剂。本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效的本发明Mfn2蛋白以及药学 上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、 乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形 式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂 和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶 囊在无菌条体下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天0. 1微克/千克体重的 10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。使用药物组合物时，是将安全有效量的Mfn2蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于普哺 乳动物，其中该安全有效剂量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过 约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100亳克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内。检测Mfn2基因的rs4240897的基因型也可用于诊断高血压。检测可以针对基因 组DNA，也可以针对Mfn2基因的扩增片段。Mfn2基因的rs4240897的基因型可用已有的技 术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。本发明提供了一种检测原发性高血压易感性的方法，它包括检测个体的线粒体融 合基因2(Mfn2)/增殖抑制基因(HSG) rs4240897位点的基因型，rs4240897带有G基因型 的个体，高血压的易感性显著高于普通人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒 含有扩增Mfn2基因第2号内含子区域的引物。利用本发明检测rs3753579位点的基因型， 方法简单易行，快速高效，成本低廉，为高血压的诊断和治疗提供了一个简捷的新途径。
图1显示了 Mfn2rs4240897位于Mfn2，内含子2中(片段重叠群contig ； NT_021937. 18位置6580122A/G)的一种SNP基因型的测序结果。图2显示了样本766号的基因组DNA抽提检测结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明其体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆；实验室手册(New York =ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1荧光PCR检测一、实验材料7900HT荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，聚合酶链反应液(TaqMan EXPressMaster Mix)由美国应用生物系统公司(ABI)定制合成。 二、引物及探针设计与合成以MFn2基因内含子2的部分序列为模板，使用Primer ExpressTM2. O软件分析 TaqMan引物和探针位点，并由美国应用生物系统公司(ABI)定制合成。检测用引物MFn2基因rs4240897上游引物序列MFn2基因rs4240897下游引物序列荧光探针MFn2 基因 rs4240897 荧光探针 1 :5MFn2 基因 rs4240897 荧光探针 2 5三、样本检测实验共检测920例高血压病例和496例正常对照人群，每例收集血样标本约2ml， 用酚/氯仿抽屉基因组DNA，抽提结果用微量紫外/可见光分光光度计(INFINIGEN公司) 检测。接如下表1所示体系进行荧光PCR扩增，最后用SDS 2. 3扫描并聚类分析5 ‘ -GCTAGGAGTTGCTGTACATAAC-3‘ 5 ‘ -AGGTGGTCAACAGCTTTGGCT-3‘
-VIC-TACTCCTCAACAAATAG-TAMRA-3‘ -FAM-TACTCCTCAACGAATAG-TAMRA-3‘
表1荧光PCR扩增体系 四、型检测结果基因组DNA抽提的检测结果所有样本的基因组DNA符合检测要求(260/280 > 1. 8，浓度> lOng/ul，如图2所示样本766号的检测结果)表2是MFn2基因rs4240897位点基因型的检测结果。表 2
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被单独引 用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以 对本发明做各种改动或修改，这些形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范固。实施例2用测序法检测原发性高血压易感基因MFn2基因的rs4240897位点。挑选上述高 血压病例_对照组样本各10例进行测序判断rs4240897的基因型。一、实验方法PCR测序引物仍采用上述荧光PCR用引物，扩增的产物经纯化后直接测序。测序 的仪器是ABI公司的3130x1遗传分析仪，用sequence analysis 5. 2分析软件进行分析， 结结果用chrromas也η可以查看。二、实验结果测序结果截图如图1所示。最终，20例的测序结果与7900荧光PCR的基因型分析
结果完全一致。三、MFn2基因rs4240897基因型和高血压易感的关联分析MFn2基因rs4240897在高血压病人和对照中分布的比较采用RxCx2检验用SPSS 软件进行统计分析，检测结果及SPSS软件分析结果如图所示表3是MFn2基因rs4240897基因型和高血压易感的关联分析表。表 3 SEQUENCE LISTING
<110>首都医科大学附属北京安贞医院，复旦大学
<120>高血压易感基因单核苷酸多态性位点rs4240897的检测方法及其试剂
<130>1011
<160>6
<170>patentln version 3.1
<210>1
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<221>misc_feature<222>(27). . (27)<223>n = a or g<400>1acccaagata cctaatactc ctcaacnaat agcctaggtc gaggcaaagc tg52<210>2<211>22<212>DNA<213>Artificial<400>2gctaggagtt gctgtacata ac22<210>3<211>21<212>DNA<213>Artificial<400>3aggtggtcaa cagctttgcc t21<210>4<211>17<212>DNA<213>Artificial<400>4tactcctcaa caaatag17<210>5<211>17<212>DNA<213>Artificial<400>5tactcctcaa cgaatag17<210>6<211>170<212>DNA<213>Artificial<400>6gctaggagtt gctgtacata acactgggta aggaggtggt gtggattcag ggactgtgct 60tgggatccaa acacaccttg cagtgaattt tgctactgct gtctctacac ccaagatacc 120taatactcct caacgaatag cctaggttga ggcaaagctg ttgaccacct170
权利要求
一种检测高血压易感基因的方法，其特征在于，对高血压易感性基因单核苷酸多态性位点进行检测，它包括检测Mfn2基因rs4240897位点的基因型；rs4240897带有G基因型的个体，获得所述基因与原发性高血压的相关性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的rs4240897位于Mfn2基因的第2号 内含子区域中。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的rs4240897位于片段重叠群 NT_021937. 18 的 6580122 位置。
4.一种检测样品Mfn2基因第2号内含子区域的单核苷酸多态性基因型的方法，其特征 在于，该方法包括步骤(a)用Mfn2基因第2号内含子区域的特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；(b)检测扩增产物中单核苷酸多态性位点rs4240897的基因型。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，扩增Mfn2基因第2号内含子区域的引物的 序列如 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 所示。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，检测rs4240897的探针的序列如SEQID NO: 4或者SEQ ID NO 5所示。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的rs4240897位于片段重叠群 NT_021937. 18 的 6580122 位置。
8.一种检测高血压易感基因的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增Mfn2基因第2 号内含子区域的引物，其序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID N0:3所示。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，它还含有与rs4240897结合的探针，其序 列如 SEQ ID NO 4 或者 SEQ ID NO 5 所示。
全文摘要
本发明属于分子生物学和医学领域，涉及一种检测原发性高血压易感性的方法及其试剂盒。本发明提供了一种检测原发性高血压易感性的方法，它包括检测个体的线粒体融合基因2(Mfn2)/增殖抑制基因(HSG)rs4240897位点的基因型，rs4240897带有G基因型的个体，高血压的易感性显著高于普通人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒含有扩增Mfn2基因第2号内含子区域的引物。利用本发明检测rs4240897位点的基因型，方法简单易行，快速高效，成本低廉，为高血压的诊断和治疗提供了一个简捷的新途径。
文档编号C12Q1/68GK101892296SQ20101010382
公开日2010年11月24日 申请日期2010年2月1日 优先权日2010年2月1日
发明者刘洁琳, 刘阔, 刘雅, 吴海, 李志忠, 李瑶, 柳景华, 楼煜清, 温绍君, 王佐广, 罗毅, 谢毅 申请人:首都医科大学附属北京安贞医院;复旦大学