专利名称：一种甘蔗黄叶病毒两种基因型的鉴别方法
技术领域：
本发明属植物保护领域，尤其是一种快速、灵敏、特异性鉴别甘蔗黄叶病毒BRA和 CHNl两种基因型的方法。
背景技术：
甘蔗黄叶病毒(Sugarcane Yellow Leaf Virus, SCYLV)侵染甘蔗引起甘蔗黄叶 病，该病毒自1992年首先在夏威夷发现以来，现已蔓延至全球30多个国家和地区，2001年 传至我国台湾地区，研究表明，该病已扩散至我国广东、广西、海南、福建和云南等蔗区。广 西已将该病毒列为检疫对象。甘蔗黄叶病可引起甘蔗减产15% 20% ，糖产量减少6% 14%，该病害已成为甘蔗生产中的重要限制因子之一。SCYLV仅分布于寄主韧皮部伴胞细胞 质中，可通过种茎传播，病毒随带毒甘蔗种质资源的调运实现远距离传播。研究表明，该病 毒不经机械摩擦传播，但可经高粱蚜、玉米蚜、甘蔗绵蚜等以持久性方式传播。在我国蔗区， 甘蔗绵蚜发生普遍，因此该病害有大发生的可能。加强蔗区间引种的检疫，防止该病毒随种 茎传入新的蔗区，可有效防止该病害的扩散、蔓延。 研究表明，甘蔗黄叶病毒存在丰富的遗传多样性，因甘蔗品种、传毒介体、环境条 件及与病毒之间的相互作用，导致许多甘蔗黄叶病毒的分离物核苷酸序列存在很大的差 异。在我国，侵染甘蔗的SCYLV主要以BRA基因型为主，另外也发现存在一个新的基因型 CHN1，利用RT-PCR技术，根据BRA和CHN1基因型分离物序列设计各自基因型的特异引物 对，建立基因型特异引物对RT-PCR技术以鉴别两种基因型，确定两种基因型在我国蔗区的 分布，对病毒的检疫和抗病育种策略有重要指导意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘蔗黄叶病毒BRA和CHNl两种基因型的鉴别方法，快 速、灵敏、特异性的鉴别甘蔗黄叶病毒BRA和CHN1基因型，相比测序可减少实验经费并节省 时间。 本发明包括以下步骤
1) RT-PCR引物设计 根据GenBank数据库中已报道的代表甘蔗黄叶病毒BRA基因型的分离物
SCYLV-A(登录号AF157029)序列和周国辉等在我国蔗区发现的代表CHNl基因型
SCYLV-chnl序列。经序列比对，根据两种基因型代表分离物的序列差异，设计只可扩增BRA
基因型分离物的特异引物对B1/B2，预期扩增片段为766bp ;设计只可扩增CHNl基因型分离
物的特异引物对C1/C2，预期扩增片段为448bp，引物序列如下 BRA基因型特异引物对Bl:5' GAAACCGATTTTGATAATCTGTC 3'B2:5' CGGAGACTCATACACAAAATTA 3'CHNl基因型特异引物对
CI :5' GCTTCTCCCGGAGGTTCACT 3'
C2:5' TCGAGAACAACCTCCGCCTT 3'
2)甘蔗叶组织总RNA的抽提 采用H. Q. &. Q.溶液型RNA抽提试剂盒(安徽优晶生物工程有限公司)抽提新鲜 叶片组织总RNA，具体步骤为 (1)称取60mg新鲜甘蔗叶片放入已灭菌的研钵中，加入液氮研磨成粉末状后，迅 速加入lmL Reagent,充分研磨混匀后，转至1. 5mL灭菌的离心管中； (2)向装有研磨混合液的离心管中加入200iiL的氯仿，剧烈振荡15s，冰浴中放置 lOmin j (3)室温下，12000rpm，离心15min ; (4)取上清液(约400iiL)转移至新的1.5mL灭菌的离心管中，加入500iiL异丙
醇后，漩涡混匀，室温静置lOmin ; (5)室温下，12000rpm，离心lOmin ; (6)弃上清，加入80%乙醇lmL，室温下，7500rpm，离心5min ;
(7)弃上清，加入无水乙醇lmL，室温下，7500rpm，离心5min ;
(8)残液用移液器吸出后，室温下，风干15min ; (9)加入100 ii L DEPC处理的灭菌ddH20，轻弹使充分溶解，稍离心后，置于_20°C 的冰箱中备用，作为RT-PCR扩增的模板。
3) RT-PCR扩增 以抽提的甘蔗叶组织的总RNA为模板，分别用两对引物对RT-PCR进行一步法 RT-PCR扩增，扩增抽提的甘蔗样品RNA， RT-PCR采用TaKaRa PrimeScriptOne St印RT-PCR
Kit Ver.2 (宝生物(大连)工程有限公司)试剂盒进行，具体步骤为
引物对B1/B2反应体系RNase Free dH2020. Oil L2XlSt印Buffer25. Oil LPrimeScript lSt印Enzyme Mix2. Oil LBl(5iiM)1. Oil LB2 (5 ii M)1. Oil LRNA模板1. Oil L总体积50. Oil L引物对C1/C2反应体系RNase Free dH2020. Oil L2XlSt印Buffer25. Oil LPrimeScript lSt印Enzyme Mix2. Oil LBl(5iiM)1. Oil LB2 (5 ii M)1. Oil LRNA模板1. Oil L总体积50. Oil L反应体系在冰浴中配制，反应程序:
5
50 °C 94 °C 94 °C 60 °C 72 。C 72 °C
30min ~^* 2min~^30s ~30s~lmin ~~5min
35cycles 4)电泳观察结果 取5 ii L RT-PCR产物经1. 2 %琼脂糖凝胶，预先加入5 %的GoldenView。在 0. 5XTBE和90V的电压下电泳40min后，用BI0-RAD凝胶成像系统观察引物对B1/B2扩 增BRA基因型分离物可得到预期大小的目的条带，而CHNl基因型分离物、健康的甘蔗植株 及清水对照中未扩增到任何条带；引物对C1/C2扩增CHN1基因型分离物可得到预期大小的 目的条带，而BRA基因型分离物、健康的甘蔗植株及清水对照中未扩增到任何条带。
该发明的有益效果是根据甘蔗黄叶病毒两种基因型BRA和CHNl的分离物的序列 差异，设计BRA基因型的特异性引物Bl/B2和CHNl基因型的特异性引物Cl/C2，提取甘蔗 叶组织的总RNA，采用RT-PCR扩增的方法，分别用两种引物检测甘蔗黄叶病毒，以此检测 SCYLV及确定侵染甘蔗的SCYLV属于哪种种基因型，提供了一种快速、灵敏、特异性的鉴别 甘蔗黄叶病毒两种基因型的方法。
图1是BRA基因型特异引物对B1/B2RT-PCR扩增检测SCYLV基因型分离物电泳结 果图，图中 M :DL 2000DNA Marker ;1 :感染SCYLV BRA基因型的甘蔗叶片；2 :感染SCYLV CHNl 基因型的甘蔗叶片；3 :健康甘蔗叶片；4 :清水对照。 图2是CHNl基因型特异引物对C1/C2RT-PCR扩增检测SCYLV基因型分离物电泳
结果图，图中 M :DL 2000DNA Marker ;1 :感染SCYLV CHN1基因型的甘蔗叶片；2 :感染SCYLV BRA 基因型的甘蔗叶片；3 :健康甘蔗叶片；4 :清水对照。
具体实施例方式
l)RT-PCR引物设计 根据GenBank数据库中已报道的代表甘蔗黄叶病毒BRA基因型的分离物 SCYLV-A(登录号AF157029)序列和周国辉等在我国蔗区发现的代表CHNl基因型 SCYLV-chnl序列。经序列比对，根据两种基因型代表分离物的序列差异，设计只可扩增BRA 基因型分离物的特异引物对B1/B2，预期扩增片段为766bp ;设计只可扩增CHNl基因型分离 物的特异引物对C1/C2，预期扩增片段为448bp，引物序列如下
BRA基因型特异引物对
Bl:5' GAAACCGATTTTGATAATCTGTC 3'
B2:5' CGGAGACTCATACACAAAATTA 3'
CHNl基因型特异引物对
CI :5' GCTTCTCCCGGAGGTTCACT 3'
C2:5' TCGAGAACAACCTCCGCCTT 3'
2)甘蔗叶组织总RNA的抽提 采用H. Q. &. Q.溶液型RNA抽提试剂盒(安徽优晶生物工程有限公司)抽提新鲜 叶片组织总RNA，具体步骤为 (1)称取60mg新鲜甘蔗叶片放入已灭菌的研钵中，加入液氮研磨成粉末状后，迅 速加入lmL Reagent,充分研磨混匀后，转至1. 5mL灭菌的离心管中； (2)向装有研磨混合液的离心管中加入200 L的氯仿，剧烈振荡15s，冰浴中放置 lOmin j (3)室温下，12000rpm，离心15min ; (4)取上清液(约400 L)转移至新的1. 5mL灭菌的离心管中，加入500 y L异丙
醇后，漩涡混匀，室温静置lOmin ; (5)室温下，12000rpm，离心lOmin ; (6)弃上清，加入80%乙醇lmL，室温下，7500rpm，离心5min ;
(7)弃上清，加入无水乙醇lmL，室温下，7500rpm，离心5min ;
(8)残液用移液器吸出后，室温下，风干15min ; (9)加入100 ii L DEPC处理的灭菌ddH20，轻弹使充分溶解，稍离心后，置于_20°C 的冰箱中备用，作为RT-PCR扩增的模板。
3)RT-PCR扩增 分别用两对引物RT-PCR扩增抽提的甘蔗样品RNA， RT-PCR采用 TaKaRaPrimeScript One St印RT-PCR Kit Ver.2(宝生物(大连)工程有限公司)试剂盒 进行，具体步骤为引物对B1/B2反应体系RNase Free dH2020. Oil L2XlSt印Buffer25. Oil LPrimeScript 1St印Enzyme Mix2. Oil LBl(5iiM)1. Oil LB2 (5 ii M)1. Oil LRNA模板1. Oil L总体积50. Oil L引物对C1/C2反应体系RNase Free dH2020. Oil L2XlSt印Buffer25. Oil LPrimeScript lSt印Enzyme Mix2. Oil LCI (5 ii M)1. Oil LC2 (5 ii M)1. Oil LRNA模板1. Oil L总体积50. Oil L反应体系在冰浴中配制，反应程序94 °C 60 °C 72 °C 72 °C
30s 30s lmin ~^ 5min
35cycles
4)电泳观察结果 取5 ii L RT-PCR产物经1. 2 %琼脂糖凝胶(预先加入5 %的GoldenView)在 0. 5XTBE和90V的电压下电泳40min后，用BIO-RAD凝胶成像系统观察引物对B1/B2扩 增BRA基因型分离物可得到预期大小的目的条带，而CHNl基因型分离物、健康的甘蔗植株 及清水对照中未扩增到任何条带；引物对C1/C2扩增CHN1基因型分离物可得到预期大小的 目的条带，而BRA基因型分离物、健康的甘蔗植株及清水对照中未扩增到任何条带。
50 C 94 C
30min ~2min
8
权利要求
一种甘蔗黄叶病毒两种基因型的鉴别方法，其特征在于步骤如下1)RT-PCR引物设计根据GenBank数据库中已报道的代表甘蔗黄叶病毒BRA基因型的分离物SCYLV-A(登录号AF157029)序列和周国辉等在我国蔗区发现的代表CHN1基因型的SCYLV-chn1序列，经序列比对，根据两种基因型代表分离物的序列差异，设计只可扩增BRA基因型分离物的特异引物对B1/B2，预期扩增片段766bp；设计只可扩增CHN1基因型分离物的特异引物对C1/C2，预期扩增片段448bp，引物序列如下BRA基因型特异引物对B15’GAAACCGATTTTGATAATCTGTC 3’，B25’CGGAGACTCATACACAAAATTA 3’，CHN1基因型特异引物对C15’GCTTCTCCCGGAGGTTCACT 3’，C25’TCGAGAACAACCTCCGCCTT 3’，2)甘蔗叶组织总RNA的抽提采用H.Q.&.Q.溶液型RNA抽提试剂盒抽提新鲜叶片组织总RNA，具体步骤为(1)称取60mg新鲜甘蔗叶片放入已灭菌的研钵中，加入液氮研磨成粉末状后，迅速加入1mL Reagent，充分研磨混匀后，转至1.5mL灭菌的离心管中；(2)向装有研磨混合液的离心管中加入200μL的氯仿，剧烈振荡15s，冰浴中放置10min；(3)室温下，12000rpm，离心15min；(4)取上清液(约400μL)转移至新的1.5mL灭菌的离心管中，加入500μL异丙醇后，漩涡混匀，室温静置10min；(5)室温下，12000rpm，离心10min；(6)弃上清，加入80％乙醇1mL，室温下，7500rpm，离心5min；(7)弃上清，加入无水乙醇1mL，室温下，7500rpm，离心5min；(8)残液用移液器吸出后，室温下，风干15min；(9)加入100μL DEPC处理的灭菌ddH2O，轻弹使充分溶解，稍离心后，置于-20℃的冰箱中备用，作为RT-PCR扩增的模板；3)RT-PCR扩增以抽提的甘蔗叶组织的总RNA为模板，分别用两对引物对RT-PCR进行一步法RT-PCR扩增，扩增抽提的甘蔗样品RNA，RT-PCR采用TaKaRa PrimeScript OneStep RT-PCR Kit Ver.2试剂盒进行，具体步骤为引物对B1/B2的反应体系RNase Free dH2O 20.0μL2×1 Step Buffer 25.0μLPrimeScript 1Step Enzyme Mix 2.0μLB1(5μM) 1.0μLB2(5μM) 1.0μLRNA模板 1.0μL总体积50.0μL引物对C1/C2的反应体系RNase Free dH2O 20.0μL2×1 Step Buffer 25.0μLPrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2.0μLC1(5μM) 1.0μLC2(5μM) 1.0μLRNA模板 1.0μL总体积50.0μL所述反应体系在冰浴中配制，反应程序4)电泳观察结果取5μL RT-PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和90V的电压下电泳40min后，用BIO-RAD凝胶成像系统观察引物对B1/B2扩增BRA基因型分离物可得到预期大小的目的条带，而CHN1基因型分离物、健康的甘蔗植株及清水对照中未扩增到任何条带；引物对C1/C2扩增CHN1基因型分离物可得到预期大小的目的条带，而BRA基因型分离物、健康的甘蔗植株及清水对照中未扩增到任何条带。FSA00000019449000021.tif
2. 根据权利要求l所述的甘蔗黄叶病毒两种基因型的鉴别方法，其特征在于BRA基因型的RT-PCR扩增特异引物对为Bl/B2，目的条带为766bp。
3. 根据权利要求1所述的甘蔗黄叶病毒两种基因型的鉴别方法，其特征在于CHN1基因型的RT-PCR扩增特异引物对为Cl/C2，目的条带为448bp。
4. 根据权利要求l所述的甘蔗黄叶病毒两种基因型的鉴别方法，其特征在于RT-PCR扩增中的退火温度为60°C。
全文摘要
一种甘蔗黄叶病毒两种基因型的鉴别方法，根据甘蔗黄叶病毒BRA和CHN1两种基因型分离物的序列差异，设计只可扩增BRA基因型分离物的特异引物对B1/B2和只可扩增CHN1基因型分离物的特异引物对C1/C2，以抽提的甘蔗叶组织的总RNA为模板，分别用两对引物对RT-PCR进行一步法RT-PCR扩增，通过观察检测SCYLV并同时确定侵染甘蔗的SCYLV的基因型；该方法能快速、灵敏、特异性的鉴别甘蔗黄叶病毒BRA和CHN1基因型，相比测序可减少实验经费并节省时间。
文档编号C12Q1/68GK101736093SQ20101010382
公开日2010年6月16日 申请日期2010年2月2日 优先权日2010年2月2日
发明者李文凤, 王明强, 王晓燕, 罗志明, 黄应昆 申请人:云南省农业科学院甘蔗研究所