专利名称：一种耐有机溶剂蛋白酶产生菌及其所产耐有机溶剂蛋白酶的基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种耐有机溶剂蛋白酶产生菌，及其所产的耐有机溶剂蛋白酶的基 因和其在非水相中催化合成小肽的应用，属于微生物学与酶学领域。
背景技术：
蛋白酶是指能催化肽键水解的一类酶，由于其重要的商业价值而被广泛关注并 逐渐成为三大工业用酶之一。当今蛋白酶的产量已经占据商品酶市场的40%以上，被 广泛应用于洗涤剂、食品、医药、皮革、有机合成、废物处理等领域。蛋白酶虽然存在 于几乎所有生物中，但由于微生物生产的蛋白酶主要是胞外酶，与动物、植物来源的蛋 白酶相比更适合工业化，所以微生物来源的蛋白酶的产量占目前蛋白酶总产量的2/3以 上。
通常情况下，蛋白酶催化水解肽键的反应是在特定的pH的缓冲溶液中进行的， 而且蛋白酶对其所催化肽键的氨基酸残基具有特异性要求，即有着高度的区域选择性和 立体选择性。近几年，人们发现蛋白酶在有机溶剂中能够催化一些水溶液中不能进行的 反应，比如在非水条件下，蛋白酶能催化肽键的形成。大量的研究表明，非水相中进 行酶促反应有着许多的优点1)增大各种有机底物的溶解度；2、具有高度的立体选择性 和区域选择性，有机介质可改变选择性；幻控制反应平衡向所需方向移动，如水解酶在 有机介质中能催化脱水缩合反应；4)有效防止微生物污染，产物易于分离纯化等。有机 相生物催化展示了酶类在有机溶剂中应用的具大潜力。蛋白酶在非水相中的优势是能催 化肽键与酯键的形成，从而被应用于一些重要中间体的合成及手性药物的拆分中。
有机溶剂体系中酶催化的诱人前景与酶易失活的矛盾推动了酶的改造与非水酶 学的发展。过去20多年，研究者致力于提高酶在有机溶剂中的稳定性。天然具有有机 溶剂稳定性的蛋白酶是近年来发现的一类新型蛋白酶，具有能稳定存在于有机溶剂中的 天然特性。这类蛋白酶通常由耐有机溶剂极端微生物产生。尽管有机溶剂对微生物细胞 具有极大的毒害，但近年来有关耐有机溶剂的极端微生物成为一个研究热点。由于耐有 机溶剂极端微生物能在富含有机溶剂的环境中生存，因此由这类微生物分泌到胞外的酶 也具有一定的有机溶剂耐受性。
目前已报道的耐有机溶剂蛋白酶产生菌绝大多数集中是假单菌属 (Pseudomonas),然而大多报道的蛋白酶的相关溶剂测定耐受浓度较低(约25%，ν/ν), 并且存在酶产量低、不易纯化、底物选择专一性强等缺点，从而影响其在工业催化中的 应用。发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株产耐有机溶剂蛋白酶的菌株，使得其所产 的耐高浓度有机溶剂的蛋白酶能够成功应用于工业化非水相小肽合成。
为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案为
本发明从油污土样中筛选获得一株耐有机溶剂蛋白酶产生菌，经BIOLOG全自 动细菌鉴定仪鉴定和16SrDNA序列分析表明该菌株该菌为蜡样芽孢杆菌，分类命名为蜡 样芽孢杆菌Bacillus cereus WQ9-2,其保藏号登记号为CCTCC NO M 2010010。
本发明对Bacillus cereus WQ9-2进行了生物特征鉴定，结果表明该菌为革兰氏阳 性菌，有芽孢生成；在有氧条件下生长；在肉汤培养基中生长24h后，菌落直径大小为 3mm 5mm，生长范围为20°C 40°C，最适生长温度为，生长pH为6.0 11.0， 最适生长pH为8.0。Bacillus cereus WQ9-2的生理生化特性表现在氧化酶反应结果为 阴性，葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、以及D-果糖利用的结果为阳性，D-木糖以及乳糖的利 用结果为阴性。
本发明对Bacillus cereus WQ9-2进行了产酶条件优化，优化后产酶量高达 3528U/mL,是优化前 1230U/mL 的 2.9 倍。
本发明对该菌产生的胞外酶进行了纯化，经过两步分离纯化得到电泳纯的蛋白 酶，命名为耐有机溶剂WQ9-2蛋白酶，纯化后其比酶活为78509U/mg。
本发明对耐有机溶剂WQ9-2蛋白酶进行了酶学性质的研究，实验证明该蛋白酶 对多种有机溶剂都具有良好的耐受性，并且耐受浓度高达50% (ν/ν)，大大优于多已报 道的耐有机溶剂蛋白酶耐受浓度(25%，ν/ν)；耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2的最适pH为 8.0，有效作用的pH值范围为7 10，为中性蛋白酶，其最佳反应温度为45°C，5mM的 Ca2+离子对该酶的最适温度和热稳定性有显著的提高作用。
本发明分离克隆到该菌株所产耐有机溶剂蛋白酶的编码基因，通过PCR法分离 克隆了这一耐有机溶剂蛋白酶基因，它具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，DNA全 序列分析结果表明，耐有机溶剂蛋白酶基因WQ9-2全长1701个核苷酸，编码567个氨 基酸，其中成熟肽为317个氨基酸。该基因与Bacillus cereus ATCC 14579编码芽孢菌粘 素的基因同源性为92%，其中成熟肽氨基酸部分同源性为98%。其氨基酸序列示于SEQ ID NO 2。
本发明提供了耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2在有机相中催化小肽合成中的应用。将 纯化的WQ9-2蛋白酶应用到有机相合成不同的小肽合成反应中，结果表明含有50% (ν/ ν)DMSO的Tris-HCl (ρΗ8.5，0.05Μ)溶液是一种优良的合成反应体系，WQ9-2蛋白酶能 够在该体系中催化多种小肽合成并且成功实现了多组反应与分离的耦合。
本发明的有益效果在于
蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus WQ9-2分泌的耐有机溶剂蛋白酶的有机溶剂耐受 性强，产率高、具有高比活、能够识别的底物范畴宽等优点；耐有机溶剂WQ9-2在有机 溶剂中催化小肽前体的成功应用，进一步证明该酶在有机溶剂催化反应中具有优良的性 能，在小肽合成以及制药等行业中具有巨大的应用潜力。
图1为耐有机溶剂WQ9-2蛋白酶的SDS-PAGE电泳图，
其中，泳道I-Marker ；泳道2-粗酶液；泳道3-纯酶液；
图2为耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2的最适反应pH ；
图3为耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2的pH稳定性；
图4为耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2的最适反应温度；
图5为耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2的温度稳定性。
本发明的微生物分类命名为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus WQ9-2,保藏日期为 2010年1月15日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏单位地 址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号CCTCC NO: M 2010010。
具体实施方式
实施例一
本实施例说明产生耐有机溶剂蛋白酶的天然菌株的筛选方法。
采用不同浓度的环己烷、甲苯等有机溶剂作为筛选压力从油污土样中筛选获得 耐有机溶剂极端微生物采用牛奶琼脂平板培养基，具体配方为(g/L)胰蛋白胨5、酵 母粉3、脱脂奶粉25、琼脂12。将所筛选到的耐有机溶剂微生物接种于牛奶琼脂平板， 根据菌落与透明圈大小的比值，初步筛选蛋白酶产量高的菌株。此方法筛选到具有蛋白 酶产量高的耐有机溶剂极端微生物13株。
为了进一步检测初筛得到的蛋白酶的溶剂耐受性，对13株菌的蛋白酶产生能力 和所产蛋白酶的耐有机溶剂性质进行全面的检测。将初筛得到的蛋白酶产生菌株接种到 产酶发酵培养基，具体配方为胰蛋蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 1.0g/L, KH2PO4 0.5g/ L，MgSO4 0.3g/L, CaCl2 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，甘油 6.3g/L，pH7.0。培养温度为 37°C,培养时间为72h，摇床转速为180rmp。发酵结束后，IOOOOrmp于4°C离心15η ι， 取上清为粗酶液。在ImL粗酶液中分别加入等体积(ImL)的甲醇、甲苯、己醇、异 戊醇、丁醇、异丙醇、丙酮、乙醇、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)，在 30°C、150rpm条件下振荡处理24h，以酪蛋白为底物检测蛋白酶剩余酶活；选取具有最 高活力的菌株作为目的有机溶剂蛋白酶生产菌株。
其中，蛋白酶活力检测方法为配制酪蛋白含量为2%的pH 8.0的Tris-HCl缓 冲液作为反应底物。取200 μ L稀释合适倍数的酶液加入200 μ L反应底物，40°C精确反 M IOmin,加入400 μ L TCA反应终止液(0.11M三氯乙酸，0.22Μ醋酸钠，0.33Μ醋酸) 终止反应，4°C放置15η ι，15000rpm离心15η ι，于^Onm下检测紫外吸光值。
蛋白酶活力单位(U)定义为在40°C，pH8.0缓冲液中，每分钟催化产生1 μ g 酪氨酸所需要的酶量(U = ug/mL · min)。通过酶活性检测以及有机溶剂稳定性检 测，其中一株具有优良耐受性的蛋白酶生产菌株所产蛋白酶活力高达1230U/mL，命名为 WQ9-2。
实施例二
本实施例说明耐有机溶剂蛋白酶产生菌WQ9-2的生物学性质、鉴定及其产酶条 件研究。
菌株WQ9-2的生物学性质革兰氏染色表明此菌株为革兰氏阳性菌株，有芽 孢，在有氧条件下生长。在肉汤培养基中生长24h后，菌落大小直径为3_ 5mm， 生长温度范围为20°C 40°C，最适生长温度为35°C，生长pH范围为6.0 11.0，最适生 长pH为8.0，其生理生化特性表现在氧化酶反应阴性，葡萄糖、麦芽糖、蔗糖与D-果糖利用的结果为阳性，D-木糖以及乳糖的利用结果为阴性。
菌株WQ9-2的菌种鉴定经BIOLOG自动细菌鉴定仪鉴定和16SrDNA序列分 析，表明该菌株为蜡样芽孢杆菌属，并命名为Bacillus cereusWQ9-2。
Bacillus cereus WQ9-2产蛋白酶发酵条件研究通过单因素实验与响应面法对发 酵培养基优化后的培养基为(g/L)葡萄糖17.0，酵母粉8.0，KH2PO4 0.5, MgSO4 0.3， CaCl2 0.5，NaCl 1。优化后的培养条件为发酵初始pH 7.5，摇床转速180rpm，接种量 2% (ν/ν),接种龄12h，发酵温度为25°C，装液量为50mL/250mL。在此发酵条件下培 养48小时后蛋白酶酶活力为35^U/mL。
实施例三
本实施例说明耐有机溶剂WQ9-2蛋白酶的纯化程序。
将Bacillus cereus WQ9-2在产酶培养基中培养4Sh后，发酵液在10,000rpm， 4°C离心ΙΟη ι，取上清液作为粗酶液；将粗酶液置于冰浴中，采用乙醇沉淀收集45% 75% (ν/ν)部分沉淀蛋白然后用0.05Μ的ρΗ8.5的Tris-HCl缓冲液溶解，10,000rpm、4°C 离心IOmin去除不能溶解的杂蛋白。将以上处理得到的酶液，采用DEAE-Sepharose FF 离子交换层析柱进行纯化，以0.05M的Tris-HCKpH 8. 缓冲液进行洗脱，收集蛋白酶 活力峰。通过SDS-PAGE电泳图(图1)，发现两步纯化后的耐有机溶剂蛋白酶(命名为 耐有机溶剂WQ9-2蛋白酶)已达电泳纯，该蛋白酶亚基分子量约为37kDa。纯化倍数为 3.8倍，回收率为57%，最终蛋白酶比活达到78509U/mg，汇总见表1。
表1.耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2的纯化步骤及结果
权利要求
1.一种耐有机溶剂蛋白酶产生菌，其分类命名为蜡样芽孢杆菌的一个新菌株，命名 为 Bacillus cereus WQ9-2,其保藏号登记号为 CCTCC NO M 2010010。
2.根据权利要求1所述的耐有机溶剂蛋白酶产生菌，其特征在于其所产耐有机溶剂 WQ9-2蛋白酶具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的耐有机溶剂蛋白酶产生菌，其特征在于耐有机溶剂WQ9-2 蛋白酶的编码基因具有SEQIDNO 1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的耐有机溶剂蛋白酶产生菌产生的耐有机溶剂蛋白酶在非水相 小肽合成体系中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种耐有机溶剂蛋白酶产生菌及其所产耐有机溶剂蛋白酶的基因和应用，具体涉及一种耐有机溶剂蛋白酶产生菌，及其所产的耐有机溶剂蛋白酶的基因和其在非水相中催化合成小肽的应用，属于微生物学与酶学领域。该菌株分类命名为Bacilluscereus WQ9-2，为革兰氏阳性菌株，能耐受一定浓度的多种有机溶剂。本发明分离克隆到该菌所产耐有机溶剂的蛋白酶编码基因，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，它具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。该蛋白酶具有产量高、比活高、耐受性广而强等性质。该蛋白酶具有非水相中催化小肽合成的工业应用价值。
文档编号C12N1/20GK102021125SQ20101010380
公开日2011年4月20日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者何冰芳, 吴斌, 孙洪林, 欧阳平凯, 许家兴 申请人:南京工业大学