专利名称：一种检测禽副粘病毒的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 技术对不同血清型禽副粘病毒进行快速检测的方法。
背景技术：
禽副粘病毒(Avian paramyxovirus, APMV)属于单分子负链RNA病毒目 (Mononegavirales)、苜1J粘病毒禾斗(Paramyxoviridae)、苜1J粘病毒亚禾斗(Paramyxovirinae)、 禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)，它包括9个血清型，S卩APMV-I (Avian paramyxovirus type-1) ~ APMV-9 (Avianparamyxovirus type_9)。胃巾 APMV—l贞__，i 禽类最重要的病原体之一，也是迄今为止研究最为全面深入的一类禽副粘病毒。禽副粘病 毒的基因组为单股负链RNA，大小约为15kb或19kb，编码6种主要的结构蛋白，包括核蛋 白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合糖蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)和多聚 酶蛋白(L)。目前已经获得除APMV-5以外的所有血清型禽副粘病毒的全基因组序列，但对 APMV-2 APMV-9的致病性和基本生物学特性研究尚较为缺乏，给禽副粘病毒的检测和诊 断带来了很大难度。传统的禽副粘病毒抗体检测方法主要有血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)，酶联免 疫吸附试验(ELISA)等，抗原检测方法主要是传统的病原分离方法。确诊通常需要进行病 毒分离，并利用不同血清型特异性单因子血清采用HI试验进行疑似分离物鉴定，有时还要 进行更为复杂的病毒毒力测定以及动物回归实验等。传统的病原分离方法虽然有效，亦在 临床诊断中发挥着重要作用，但也存在确诊耗时较长(通常要一周以上时间)的明显局限 性。生物技术的飞速发展极大地推动了生命科学各个领域的发展，疾病的诊断、病原 的检测已从细胞水平进入分子水平。禽副粘病毒分子结构与致病性关系研究的日益深入为 副粘病毒的特异性诊断技术研究奠定了基础。根据不同致病性毒株存在的分子结构差异， 相继建立了特异、快速的分子诊断技术，包括单克隆抗体技术、核酸探针技术、限制性核酸 内切酶分析、基因片段的体外扩增技术和寡核苷酸指纹图谱技术等。这些技术不仅应用于 副粘病毒的检测、鉴定和特性研究及致病性的检测，还可以追踪病毒的来源及流行情况。聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增特异性基因片段的技术，在疾病的检测方 面有着广阔的应用前景，现已被广泛应用。反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)能够选择性 地将禽副粘病毒基因组的一个特异性短片段放大10万倍以上，极大地增强了检测的敏感 性。1991年Jestin首次发展了新城疫病毒的RT-PCR检测方法，扩增F蛋白基因的238bp 的目的片段。Veronique (1991)等用RT-PCR方法扩增出约275bp的F基因产物并绘制出酶 切图谱，证明这些病毒株都具有NDV的共同抗原表位。Seal等(1995)用PCR扩增M基因 和F基因裂解位点编码片段，通过对病毒分子进行同源进化分析，并预测了每株病毒的可 能致病性。Kant (1998)利用4条引物配成三对，分别对通过勻浆组织提取的NDV-RNA进行 RT-PCR，结果扩增出362、254、254bp的三个片段。该方法不需要鸡胚接种，节省时间，24h之内可以出结果，为NDV毒株的区别诊断提供了依据。Gohm等(2000年)用RT-PCR检测组织 和粪便中的新城疫病毒。大量研究结果证明，利用特异性引物对NDV进行RT-PCR扩增是一 种快速、准确的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有检测方法的不足，提供一种采用反转录聚合酶链式反 应(RT-PCR)技术对不同血清型禽副粘病毒进行快速检测的方法，该法操作简便，并且可以 同时进行大量样本分析。为了实现本发明目的，本发明的一种检测禽副粘病毒的方法，包括如下步骤1) 样本的预处理；2)样本总RNA的提取；3)对步骤2)的总RNA进行RT-PCR，得到样本cDNA ； 4)利用权利要求1的引物，对步骤3)的cDNA进行PCR扩增；5)分析PCR产物，对PCR产物 进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定样品中能否扩增出目的条带。如果扩增出目 的条带则证明为禽副粘病毒检测阳性，否则为禽副粘病毒检测阴性。本发明参照GenBank登录的不同血清型禽副粘病毒(包括鸡源、鸭源和鹅源毒株) NP基因的保守区序列设计特异性检测引物上游引物为5’ -GCGTATGA(G/T)AC(A/T)GC(A/ Τ)G(A/C) (T/G)GAG-3，；下游引物为 5，-GTA(T/C)G(C/G)TGCATT(T/A)TCACCTTT-3，。通过上述特异性检测引物，扩增禽副粘病毒的NP基因中的保守区序列长度约 387bp的核苷酸序列，上游引物在665nt-685nt之间，下游引物在1031nt_1051nt之间。提 取样本总RNA并进行反转录(RT)合成cDNA后，利用上述引物进行聚合酶链式反应(PCR)， 采用下列反应程序94°C 5min，35 个循环(94 °C 45s, 59 °C 45s, 72 °C 30s), 72 °C IOminJi PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，利用紫外凝胶成像仪检测目的条带，如果扩增出目的条 带则证明为禽副粘病毒检测阳性，否则为禽副粘病毒检测阴性。进一步地，本发明提供一种含有如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示序列引物的 禽副粘病毒检测试剂盒。本发明的优点在于，1)扩增的目的片段位于禽副粘病毒的NP蛋白的高度保守 区，且核苷酸序列只有387bp，因而敏感性好、简便易行，对不同血清型的禽副粘病毒均可 较好检出，具有通用性；2)该方法对其它常见禽病病原，如禽流感病毒、鸡传染性支气管炎 病毒、鸡传染性法氏囊病毒以及鸡痘病毒的检测结果皆为阴性，没有交叉反应，表明该方法 具有良好的特异性；3)本发明方法适用于养禽生产中进行禽副粘病毒的检测，具有高特异 性、高灵敏度、高效率、低成本的特点，可在8h内对临床病料进行快速鉴别诊断，克服了传 统检测方法需要多种标准阳性血清、耗时较长等缺点，适合大量样本的分析与检测，对禽副 粘病毒的早期快速诊断与分子流行病学分析均有十分重要的意义，同时为研究禽副粘病毒 的分子变异机制了提供技术手段。
图1为采用本发明方法对鸡副粘病毒I型病毒进行检测的电泳结果，其中，M代表 DNA Maker ；1代表禽副粘病毒I型标准强毒株；2代表禽副粘病毒I型国内分离株1 ；3代 表禽副粘病毒I型国内分离株2 ;4代表禽副粘病毒I型国内分离株3 ;5代表禽副粘病毒I 型国内分离株4。
图2为采用本发明方法对鸭副粘病毒I型病毒进行检测的电泳结果，其中，M代表 DNA Maker ； 1代表鸭副粘病毒I型国内分离株1 ；2代表鸭副粘病毒I型国内分离株2 ;3代 表鸭副粘病毒I型国内分离株3 ;4代表鸭副粘病毒I型国内分离株4。图3为采用本发明方法对鸡副粘病毒II型病毒和鸟源禽副粘病毒II型病毒进行 检测的电泳结果，其中，M代表DNA Maker ；1代表禽副粘病毒II型标准毒株；2代表鸡源禽 副粘病毒II型国内分离株；3代表鸟源禽副粘病毒II型国内分离株1 ；4代表鸟源禽副粘 病毒II型国内分离株2。图4为采用本发明方法对其它常见禽病病原进行检测的电泳结果，其中，M代表 DNA Maker ；1代表禽流感病毒；2代表鸡传染性支气管炎病毒；3代表鸡传染性法氏囊病毒； 4代表鸡痘病毒。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中常规的实验方法，参见Sambrook等编写的分子克隆。仪器的使用参 照仪器操作说明。实施例1样品的预处理1、实验试剂和主要仪器主要试剂灭菌生理盐水主要仪器Centrifuge 5810R低温台式离心机，为德国Eppendorf公司产品；涡旋 振荡器；研磨器2、实验步骤(1)组织样品处理取Img脏器组织样品加入Iml灭菌生理盐水并用研磨器进行 研磨混悬，组织悬液3000rpm离心30min后取上清用于检测。(2)泄殖腔或口咽拭子样品处理将拭子样品加入加入0. 5ml灭菌生理盐水并用 涡旋振荡器振荡混悬，样品悬液3000rpm离心30min后取上清用于检测。实施例2样本总RNA的提取1、实验试剂和主要仪器主要试剂Trizol RNA提取试剂，为Invitrogen产品，购自北京天佑达公司； DEPC处理水，购自北京三泰兴隆科技有限公司；新的氯仿、异丙醇和无水乙醇；75%乙醇； Rnase-free的离心管与枪头主要仪器Centrifuge 5810R低温台式离心机，为德国Eppendorf公司产品；生物 安全柜，为Forma Scientific产品2、实验步骤(1)取待检样品悬液250 μ 1，加入750 μ 1 Trizol，颠倒混勻15s至液体变粘稠，冰 浴 15min ；(2)加入200 μ 1氯仿，颠倒混勻15s，冰浴15min ；(3)混合液以12000rpm，4°C离心15min分为两相；(4)取上层水相加入另一离心管内，加入等体积的异丙醇，颠倒混勻后15-30°C静 置 IOmin ；
(5) 13500rpm, 4°C离心 Ιδπ η，沉淀 RNA ；(6)小心尽弃上清，用DEPC水配制的75%乙醇Iml轻轻漂洗沉淀；(7)将RNA沉淀置超净台内风干，约IOmin ；(8)用DEPC水处理的灭菌水9 μ 1溶解沉淀，并加入1 μ 1核酸酶抑制剂(Rnasin
50υ/μ 1)；(9)提取的RNA样品直接用于反转录或分装后_80°C保存备用。实施例3逆转录生成cDNA1、实验试剂和主要仪器 主要试剂反转录酶(Reverse Transcriptase) 200U/ μ 1 (Promega)；核酸酶 抑制剂(Rnase Inhibitor) 50U/ μ 1 (Takara) ；5 倍体积的反应缓冲液(5 X Reaction Buffer) ；dNTP混合物2. 5mM，购自北京强欣博瑞生物技术有限公司；随机引物(Random Primer) 500 μ g/ml (Promega)，为随机六聚体；DEPC处理水，购自北京三泰兴隆科技有限公司。主要仪器PCR扩增仪(T-Gradient Thermoblock)，购自北京北方华奥贸易有限 责任公司；小型台式离心机(德国Eppendorf公司)；DK-8D型电热恒温水槽(上海森信实 验仪器有限公司)。2、实验步骤(1)在0. 2ml离心管内加入下列成分RNA 溶液6 μ 1随机引物Ιμ 轻轻混勻，70°C水浴5min，冰浴2min，然后依次加入下列成分5X反应缓冲液 4μ1dNTP 混合物2 μ 1核酸酶抑制剂1 μ 1反转录酶0·5μ1DEPC 处理水5. 5 μ 1轻轻混勻，进行如下反应，37°C lh, 95°C 5min，得到样本cDNA。实施例4目的片段的PCR扩增1、实验试剂和主要仪器主要试剂cDNA溶液；2 X Taq mix，购自北京强欣博瑞生物技术有限公司；dNTPs， 购自北京强欣博瑞生物技术有限公司；dd H20 ；特异性引物(上游引物为5’ -GCGTATGA(G/ Τ)AC(A/T)GC(A/T)G(A/C) (T/G)GAG_3，，下游引物为 5，-GTA(T/C)G(C/G)TGCATT(Τ/Α) TCACCTTT-3，) ；DLlOOO DNA marker (Takara)。主要仪器PCR扩增仪(T-Gradient Thermoblock)，购自北京北方华奥贸易有限 责任公司；电泳仪；α凝胶成像仪(上海天能公司)；小型台式离心机(德国Eppendorf公 司)。2、实验步骤在0. 2ml离心管中加入下列成分cDNA4 μ 1
上游引物(20 μ Μ)0. 5μ 1
下游引物(20 μ Μ)0. 5μ 1
2 X PCR Taq mix10 μ 1
dd H2O5 μ 1
轻轻混勻后，进行如下反应94°C预变性5min，94°C 45s, 59°C 45s, 72°C 30s，进行
35个循环，循环结束72°C延伸IOmin。PCR反应结束后，用IXTAE电泳缓冲液制备1. 5%琼脂糖凝胶并按照参考比例 混入荧光染料Goldview。按照比例将5ul PCR产物加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/ cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为40-60分钟，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观 察并拍照，根据电泳结果确定样品中能否扩增出目的条带，如果扩增出目的条带则证明为 禽副粘病毒检测阳性，否则为禽副粘病毒检测阴性。。利用上述方法分别对鸡源禽副粘病毒I型病毒、鸭源禽副粘病毒I型病毒、鸡源禽 副粘病毒II型病毒和鸟源禽副粘病毒II病毒进行检测的电泳结果如图1 图3所示，结 果表明该方法对不同血清型的禽副粘病毒均可较好检出，具有良好的敏感性和通用性。实施例5特异性检测1、实验试剂和主要仪器主要试剂cDNA溶液；2 X Taq mix，购自北京强欣博瑞生物技术有限公司；dNTPs， 购自北京强欣博瑞生物技术有限公司；dd H20 ；特异性引物(上游引物为5’ -GCGTATGA(G/ Τ)AC(A/T)GC(A/T)G(A/C) (T/G)GAG_3，，下游引物为 5，-GTA(T/C)G(C/G)TGCATT(Τ/Α) TCACCTTT-3，) ；DLlOOO DNA marker (Takara)。主要仪器PCR扩增仪(T-Gradient Thermoblock)，购自北京北方华奥贸易有限 责任公司；电泳仪；α凝胶成像仪(上海天能公司)；小型台式离心机(德国Eppendorf公 司广品)O2、实验步骤在0. 2ml离心管中加入下列成分cDNA4 μ 1上游引物(20μ Μ) 0. 5 μ 1下游引物(20μ Μ) 0. 5 μ 12 X PCR Taq 混合液 10 μ 1dd H2O5 μ 1轻轻混勻后，进行如下反应94°C预变性5min，94°C 45s，59°C 45s，72°C 30s，进行 35个循环，循环结束72°C延伸IOmin。PCR反应结束后，用IXTAE电泳缓冲液制备1. 5%琼脂糖凝胶并按照参考比例 混入荧光染料Goldview。按照比例将5ul PCR产物加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/ cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为40-60分钟，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观 察并拍照，根据电泳结果确定样品中能否扩增出目的条带，如果扩增出目的条带则证明为 禽副粘病毒检测阳性，否则为禽副粘病毒检测阴性。。利用上述方法对其它常见的禽病病原，如禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡 传染性法氏囊病毒和鸡痘病毒进行检测，其结果如图4所示，结果皆为阴性，表明本方法具有良好的特异性。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>中国农业大学<120> 一种检测禽副粘病毒的方法<130>KHP10112085. 8<160>2<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222> (9)·· (9)<223>n 是 g 或 t<220><221>misc_feature<222>(12). . (12)<223>n 是 a 或 t<220><221>misc_feature<222>(15). . (15)<223>n 是 a 或 t<220><221>misc_feature<222>(17). . (17)<223>n 是 a 或 c<220><221>misc_feature<222>(18). . (18)<223>n 是 T 或 G<400>1gcgtatgana cngcngnnga g21<210>2<211>21
<212>DNA
<213>人工序列<220><221>misc—feature<222>(4). . (4)<223>n 是 T 或 c<220><221>misc—feature<222>(6). . (6)<223>n 是 C 或 G<220><221>misc—feature<222>(13). . (13)<223>n是T或A<400>2gtangntgca ttntcacctt t2权利要求
禽副粘病毒的检测用引物，其包括上游引物5’ GCGTATGA(G/T)AC(A/T)GC(A/T)G(A/C)(T/G)GAG 3’；以及下游引物5’ GTA(T/C)G(C/G)TGCATT(T/A)TCACCTTT 3’。
2.一种利用权利要求1所述引物检测禽副粘病毒的方法，包括如下步骤1)样本的预处理；2)样本总RNA的提取；3)对步骤2)的总RNA进行RT-PCR，得到样本cDNA；4)利用权利要求1的引物，对步骤3)的cDNA进行PCR扩增；5)分析PCR产物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤4)的PCR反应程序为94°C5min ； 94°C 45s，59°C 45s，72°C 30s, 35 个循环；72°C lOmin。
4.一种含有权利要求1所示序列引物的禽副粘病毒检测试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种检测禽副粘病毒的方法，其是利用特异性引物检测禽副粘病毒(APMV)的RT-PCR方法。包括步骤样本总RNA的提取、反转录得到样本cDNA、使用特异性引物扩增目标片段、凝胶电泳分析、结果判定。根据不同血清型禽副粘病毒NP基因的保守区序列设计1对特异性检测引物，其序列如Seq ID No1和Seq ID No2所示，可扩增387bp的目的基因片段，适用于对不同血清型的禽副粘病毒进行快速检测，具有高特异性、高灵敏度、高效率、低成本的特点，适合大量样本的分析与检测，对禽副粘病毒的早期快速诊断与分子流行病学分析均有十分重要的意义，同时为研究禽副粘病毒的分子变异机制提供了技术手段。
文档编号C12Q1/68GK101892321SQ201010103809
公开日2010年11月24日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者张国中, 张守平, 张蕊, 王晓婷, 赵继勋 申请人:中国农业大学