专利名称：：检测新城疫病毒的引物及其应用方法、试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及禽类感染病毒检测
技术领域：
，特别涉及一种新城疫病毒的检测试剂盒及检测新城疫病毒的方法。
背景技术：
：新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus,NDV)是可引起禽类的一种以呼吸道、消化道粘膜出血为典型症状的急性传染病。新城疫病毒属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、腮腺炎病毒属。禽副粘病毒共有9个血清型，即PMV-l至PMV-9，其中新城疫病毒(NDV)是禽副粘病毒l型(APMV-1)的主要成员。试验表明，有250多种鸟类可净皮NDV感染，其危害和引发的后果极其严重。1999年农业部发布的动物疫病目录中将其列为I类疫病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类疫病。世界动物卫生组织规定对新城疫病毒的检验检疫方法包括病毒的分离鉴定、琼脂凝胶免疫扩散试验、血凝和血凝抑制试验等。病毒的分离与鉴定首先将样品接种至无特定病原的鸡胚，病毒会随着鸡胚的发育而增殖，经一星期后抽取鸡胚的尿嚢液，进行血凝和血凝抑制试验，从而可以判定检测样本中是否含有病毒。该方法的优点是灵敏度高，但是周期长，约需21天，而且工作量大，需要大量的人力物力。琼脂凝胶免疫扩散试验最早由Oudin于1946年进行对抗原混合物进行分析。基本原理是在一定孔径的凝胶中，当抗原与抗体分子相遇时，形成抗原抗体复合物，若两者比例适当，则复合物分子量增大，颗粒增大，不再继续扩散而产生沉淀线。不同的抗原所形成的沉淀有各自的位置，>1人而可以将抗原分开。该方法的优点是简单易行，不需要特殊仪器，但是由于抗体分子与抗原决定簇的结合并不总是——对应的，而且，由于离子强度、pH等因素，致使该方法的特异性较低。血凝和血凝抑制试验其基本原理是某些病毒或者病毒的血凝素，能选择性的使几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝。当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直"l妄接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，成为血凝抑制反应。该方法的优点是快速简单，但是由于它检测的是病毒抗体，而抗体必须在感染后相当一段时间内才能产生，因此，该方法的应用范围受到限制。随着分子生物学的飞速发展，对新城疫病毒的检测手段也有了快速的发展。例如采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时逆转录聚合酶链式反应(real-timeRT-PCR)检测新城疫病毒。这些方法快速简单，灵敏度高，反应时间较以前的方法短，但仍需要较长时间，而且需要使用PCR仪等贵重仪器，对使用范围有限制。因此，需要发明一种新的新城疫病毒的检测引物及其应用方法以解决上述问题。
发明内容本发明的主要目的之一在于基于现有技术的不足而提供一种灵敏度高、特异性强的检测新城疫病毒的引物。本发明的另一个目的是提供一种灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作简单的新城疫病毒的检测方法。本发明的另一个目的在于基于现有技术的不足而提供一种灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作简单的新城疫病毒的检测试剂盒。本发明提供一组用于检测新城疫病毒的引物，所述的引物与新城疫病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增新城疫病毒的核苷酸序列的一部分。作为本发明优选实施方式，本发明用于检测新城疫病毒的引物，为序列号1~序列号6所示的寡核苷酸，或者序列号1~序列号6所示的寡核苷酸的互补链,其中R和Y均为简并碱基,R=G+A,Y=C+T。序列号引物名称序列5'-3'1F3CTGCAGGAATTGTAGTAACAGG2B3ACGTGGACACAGACCCTT3FIPTGGGCATATTCGG及AGCAACTTGCAGTCAATGTiTACACCTCGT4BIPGTGCAAiAGCCCCATTGGAGGAATTCCTTGCGGATiGAGTCGCFLCTATGATTGACCCK3TCTGAG6BLCTACTTTGCTCACTCCTCTTG上述序列号16的引物对应SEQIDNO.lSEQIDN0.6的引物。本发明的检测新城疫病毒引物，灵敏度高、特异性强。6条引物共识别8个区域，充分保证其特异性。其中F3和B3是外引物，在起始扩增反应时起作用；FIP和BIP称为内引物，在整个扩增过程都起作用，是最关键的一对引物，导致产生环状的茎环结构而无限扩增；FL和BL称为环状引物，用于提高反应速率。本发明提供一种才全测新城疫病毒的方法，该方法用于检测样本中是否存在新城疫病毒，所述的方法采用的引物可以与新城疫病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增新城疫病毒的核苷酸序列的一部分；通过环介导等温扩增法，特异性地扩增新城疫病毒的核苷酸序列的一部分，确认是否存在有扩增产物。作为本发明优选实施方式，本发明检测新城疫病毒的方法，所述的方法包括如下步骤(1)准备检测样本；(2)提取样本的总RNA;(3)对步骤(2)的RNA进行逆转录反应，得到cDNA;(4)对步骤(3)的cDNA进行环介导的等温核酸扩增反应，反应温度为60~65°C,反应时间为10~60分钟；(5)终止反应；(6)检测所述扩增引物。作为本发明优选实施方式，本发明4全测新城疫病毒的方法，所述的方法的步骤(3)和步骤(4)合并为步骤(31):对步骤(2)的RNA进行逆转录反应，在同一个反应体系中立即对cDNA产物进行环介导的等温核酸扩增反应，反应温度为60~65°C,反应时间共为10-60分钟。作为本发明优选实施方式，本发明检测新城疫病毒的方法，所述的检测样本选自下列样本中的一种或者组合(1)禽类的气管、脑、肺、脾、肠、肾或胃；(2)禽类的喉头拭子或肛门拭子；或者(3)禽类的胚胎培养物或细胞培养物。作为本发明优选实施方式，本发明检测新城疫病毒的方法，所述的方法的步骤(6)所述的检测是通过扩增产物凝胶电泳、扩增产物浊度观测或扩增产物化学发光检测的方法进行的。本发明提供的新城疫病毒的检测方法，采用的引物灵敏度高、特异性强；采用的环介导等温扩增反应，反应时间短、操作简单。本发明还提供一种检测生物样品中新城疫病毒的试剂盒，所述试剂盒包含有引物，所述的引物与新城疫病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增新城疫病毒的核酸序列的一部分。作为本发明优选实施方式，本发明的检测生物样品中新城疫病毒的试剂盒包含有引物，所述引物为如下序列号1序列号6所示的寡核苷酸，序列号1CTGCAGGAATTGTAGTAACAGG，序列号2ACGTGGACACAGACCCTT,序歹'J号3TGGGCATATTCGGiAGCAACTTGCAGTCAATGTiTACACCTCGT，序歹'J号斗GTGCAAiAGCCCCATTGGAGGAATTCCTTGCGGATiGAGTCGC，序列号5CTATGATTGACCCFGTCTGAG，序歹'J号6CTACTTTGCTCACTCCTCTTG;或者序列号1-序列号6所示的寡核苷酸的互补链。上述序列号1~6的引物对应SEQIDNO.l~SEQIDN0.6的引物。本发明提供的新城疫病毒的检测试剂盒，采用的检测引物灵敏度高、特异性强，检测反应时间短、操作简单，能够满足市场的需求。图1是环介导等温扩增反应产物的特征性梯状条带和酶切鉴定电泳图泳道M:marker;泳道l:扩增产物用限制性内切酶EcoRI酶切产物，得到217bp,252bp大小的两条主带，说明是特异性扩增；泳道2:扩增原始产物，表现出特征性的梯状条带，不能通过片段的大小来鉴别是否为非特异性扩增；图2是等温孵育不同时间的产物含量的电泳图在20分钟时就出现了特征性扩增条带，表明20分钟即可完成反应；泳道M:marker;泳道N:阴性对照；其他泳道为不同时间的产物，数字代表时间，单位分钟；图3是灵敏度实验结果的电泳图泳道M:marker;泳道N:阴性对照；泳道0到-6表示病毒RNA模板按5倍稀释后(标号取5的对数log5，-1即稀释5倍)的扩增产物；图上半部分是利用F3和B3做一步法RT-PCR的电泳结果，产物约210bp;图下半部分是本发明方法的结果，可得该方法比RT-PCR灵壽文25倍左右；图4是肉眼可视观察实验结果，省略电泳所需的时间和设备P1和P2是阳性反应，Nl和N2是阴性反应；其中，N2和P2都加了SYBRGreenI荧光染料；在P1的体系中，可以看见混浊的白色副产物，稍孩i离心，可见沉淀于底部；P2中的染料由N2所显示的橙黄色(染料的本色)变为绿色。具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。实施例1一组用于检测新城疫病毒的引物，所述的引物与新城疫病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增新城疫病毒核苦酸序列的一部分。所述的引物，为序列号1序列号6所示的寡核苷酸,其中R和Y均为简并碱基，R=G+A，Y=C+T。序列号引物名称序列5'-3'<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>上述序列号1~6的引物对应SEQIDNO.1SEQIDNO.6的引物。这里所用的"核酸"或"多核苷酸"是指任何长度的含嘌呤和嘧啶的聚合物，可以是多核糖核苷酸，可以是多脱氧核糖核苷酸，或是混合的多核糖-多脱氧核糖核苦酸。它包括单链和双链分子，例如DNA-DNA,DNA-RNA和RNA-RNA杂合体，以及通过与氨基酸主链共轭碱基形成的"蛋白质核酸"(PNA)。它还包括含有修饰碱基的核酸。这里所用的"引物"是长度约为5个至50个核苷酸的寡核苷酸，优选长度为大约6个至25个核苦酸，特别优选长度为大约6个至18个核苷酸，它与相关的单链核酸序列形成一个双链体，并且可以用例如逆转录酶或DNA聚合酶使互补链发生聚合反应。实施例2一组用于检测新城疫病毒的引物，所述的引物与新;成疫病毒的核酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增新城疫病毒的核酸序列的一部分。所述的引物，为实施例1中序列号1序列号6所示的寡核苷酸的互补链。这里所用的核酸序列的"互补链，，是指参与与原始序列沃森-克里克碱基配对的反义序列。实施例3一种检测新城疫病毒的方法，该方法用于检测样本中是否存在新城疫病毒，其特征在于，所述的方法采用下列的引物组，通过环介导等温扩增法(LAMP)，特异性地扩增新城疫病毒的核苷酸序列的一部分，确认是否存在有扩增产物。序列号引物名称序列5'-3'<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>上述序列号1~6的引物对应SEQIDNO.l~SEQIDN0.6的引物。LAMP扩增主要利用了BstDNA聚合酶大片段的两大特性一是DNA聚合酶具有5'—3'DNA聚合酶活性，能在恒温状态下扩增DNA核酸；二是BstDNA聚合酶不具有5'—3'外切核酸酶活性，能将新合成的核酸单4连从新生成的DNA双链上置换(取代)下来，形成两条独立的核酸单链以开启下一轮的DNA核酸合成；进而免去了每次扩增前的DNA变性环节。在此基础上，巧妙地设计能识别6个(或8个)独立DNA序列的LAMP引物组(4引物组或6引物组)，使得BstDNA聚合酶的两大特性充分发挥。其中，内引物(BIP、FIP)的设计是LAMP$)物设计的亮点、难点。BstDNA聚合酶大片段是BacillusstearothermophilusDNA聚合酶的一部分，来源于E.coli菌抹，此菌林含有来自BacillusstearothermophilusDNA聚合酶的基因，该基因不具有5'—3'外切核酸酶活性。应用基因重组技术，将麦芽糖结合蛋白(MBP)基因与该基因融合表达，纯化后再去除麦芽糖结合蛋白。第一阶段扩增始发物形成l步当双链DNA处于65。C左右的动态平衡中时，引物组中的BIP引物就能通过互补结合到目标DNA双链上，在5^DNA聚合酶作用下，启动DNA合成。2步从BIP的B2区域3，端开始合成DNA模板的互补链至F3C;3步B3引物退火结合到模板DNA的互补区域B3C，启动链取代合成，同时释放由BIP引物引导合成的互补链。4步释放的DNA的B1C区域结合B1区域，形成茎环结构；1.3步释放的DNA链作为FIP引物以及F3引物的模板，按BIP端相同的模式启动DNA的合成及链取代，释放的DNA链在FIP端同样形成茎环结构。进而，形成哑铃形结构扩增始发物。第二阶段延伸5步哑铃结构通过自引导DNA合成迅速转换成茎环结构DNA;6步BIP引物与茎环结构的环状单链区域结合并开始新的DNA合成，由于F1及F1C的互补关系，再次形成茎环结构，先前合成的DNA链得以释放；7步FIP引物同样与对应的茎环结构的环状单链区域结合，由于B1及B1C的互补关系，再次形成茎环结构，先前合成的DNA链得以释放；8步如此周而复始扩增，最终形成不同长度(目的片断长度的自然数倍)花椰菜cauliflower状的反向重复序列。2.引物设计LAMP引物的设计比常规PCR要复杂的多。一个反应至少包括4条引物，包括一对内引物(FIP和BIP,各约40bp)和一对外引物(F3和B3，各约25bp);如果添加一对环引物(loopprimer)，反应便可以加速，反应时间减半，大大增加扩增检测的效率。PrimerExplorerversion3软件可以专门设计各种特异LAMP亏1物，用户只需按要求提交目的片断序列，设置相关参数，系统便能产生多种引物组合供用户选择。此外，LAMP引物可以人工设计，各引物的组成(请见表l)，引物设计的其他技术细节及注意事项可参考相关文献(TsugunoriNotomi等，2000;K.Nagamine等,2002)。表1LAMP引物组成<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>3.反应体系及设备:25ulLAMP反应的基本体系如下内引物FIP、BIP各0.8mM，外引物F3、B3各0.2mM，(需要时，环引物LF、LB各0.4mM),1.6mMdNTPs,1Mbetaine甜菜碱CS&w"),反应緩冲液(20mMTris-HCl(pH8.8)，10mMKC1，10mM(NH4)2S04,4mMMgS04,0.1%TritonX-100),8个单位DNApolymeraselargefragment(JVewEVzg/朋d别o/afo)以及模板DNA。模板DNA在恒温扩增前95。C孵育5mins(TsugunoriNotomi等，2000)，但后续研究表明，未经95。C变性的DNA模板可以直接进入恒温扩增(60~65°Cfor45~60mins)。为防止非特异扩增，须80。C孵育2-5mins。由于LAMP反应无需循环变温，所以仅需水浴锅或其他恒温加热器便可。4.扩增结果判定扩增结果有三种判定方法1)核酸的琼脂糖凝胶电泳，染料可以是EB也可以是SYBRGreenI，琼脂糖凝胶的浓度以2%为宜，緩冲液采用TBE緩冲液。2)肉眼直接观测副产物焦磷酸镁沉淀。产物呈阳性的反应，管内液体浑浊，离心或由白色沉淀集于管底，阴性反应则无此现象。3)SYBRGreenl荧光染料直接对产物进行染色，也可以通过肉眼直接观察。产物呈阳性的反应，加染料后呈绿色，阴性反应则呈橙红色。实施例4一种检测新城疫病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤(1)准备检测样本新鲜或者保存于-8(TC4。C的鸡胚尿嚢液或细胞培养物,解冻后可直接用于总RNA的抽提；新鲜或者用磷酸盐緩冲液保存于-8(TC4。C的禽类组织病津+，充分匀浆后，10000rpm离心1030min，取上清液用于总RNA的抽提；(2)提取样本的总RNA:使用RNAiso抽提试剂(大连宝生物工程公司产品)，按照试剂的说明书才喿作；(3)对步骤(2)的RNA进行逆转录反应，使用AMV逆转录酶(大连宝生物工程公司产品)得到cDNA，反应温度可以在60~65°C;(4)对步骤(3)的cDNA进行环介导的等温核酸扩增反应，使用Bst大片段DNA聚合酶(纽英兰公司产品)，反应温度为60~65°C,反应时间为10-60分钟；其中，(3)和(4)两步可以合并为一步，将逆转录酶和DNA聚合酶加在一个离心管中，逆转录和等温扩增在相同温度下(60~65°C)同时进行，大大缩短了反应时间。即，逆转录和等温扩增两步就可以在20-60分钟完成(图2);(5)终止反应；80。C持续5分钟；(6)检测所迷扩增引物有三种方法可供选择。其一、产物可以通过电泳来观察是否有特征性梯状条带出现(见图i)。其二、产物如果出现混浊、经简短离心有白色沉淀，即可判为阳性；用浊度仪能更方便地判定。其三、力。SYBRGreenl染料到产物中，阴性反应仍然为原本的橙黄色，而阳性则变为绿色(见图4)。为阐明LAMP扩增技术在检测灵敏度方面的优势，特选择灵敏度较高的RT-PCR作为比较对象。病毒RNA模板按5倍稀释后(标号取5的对数log5,-1即稀释5倍)的扩增产物，利用F3和B3做一步法RT-PCR，同时采用本发明的检测方法进行实验。由图3可知，一步法RT-PCR的灵敏度为-4(即稀释54倍)，本发明检测方法的灵敏度为-6(即稀释56倍)，可得该方法比RT-PCR灵敏25倍左右。在本发明的其他实施例中，样本的来源还可以是选自下列样本中的一种或者组合(1)禽类的气管、脑、肺、脾、肠、肾或胃；(2)禽类的喉头拭子或肛门拭子；或者(3)禽类的胚胎培养物或细胞培养物。对样本的准备可以参照美国冷泉港实验室出版社的《分子克隆实验指南》的实—验方法进行准备。实施例5一种检测生物样品中新城疫病毒的试剂盒，所述试剂盒包含有用于检测新城疫病毒的引物，所述引物为实施例1中序列号1序列号6所示的寡核苷酸。实施例6一种检测生物样品中新城疫病毒的试剂盒，所述试剂盒包含有用于检测新城疫病毒的引物，所述引物为实施例1中序列号1序列号6所示的寡核苷酸的互补链。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。SEQUENCELISTING<110>中山大学<120>检测新城疫病毒的引物及其应用方法、试剂盒<160>6<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1ctgcaggaattgtagtaacagg22<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2acgtggacacagaccctt18<210>3<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>3tgggcatattcggragcaacttgcagtcaatgtrtacacctcgt44<210>4<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>4gtgcaaragccccattggaggaattccttgcggatrgagtcgc43<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5ctatgattgacccygtctgag21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>6ctactttgctcactcctcttg2权利要求1.用于检测新城疫病毒的引物，其特征在于，所述的引物与新城疫病毒的核酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增新城疫病毒的核苷酸序列的一部分。2.如权利要求1所述的用于检测新城疫病毒的引物，其特征在于，所述的引物为如下序列号1-序列号6所示的寡核苷酸，序列号1CTGCAGGAATTGTAGTAACAGG<SEQIDNO.1>,序列号2ACGTGGACACAGACCCTT<SEQIDN0.2>，序列号3TGGGCATATTCGG及AGCAACTTGCAGTCAATG17TACACCTCGT<SEQIDNO,3>，序歹'J号4GTGCAARAGCCCCATTGGAGGAATTCCTTGCGGATiGAGTCGC<SEQIDNO,4>，序歹'J号5CTATGATTGACCCTGTCTGAG<SEQIDNO.5>，序歹寸号6CTACTTTGCTCACTCCTCTTG<SEQIDN0.6>;或者序列号1~序列号6所示的寡核苷酸的互补链。3.—种检测新城疫病毒的方法，其特征在于，所述的方法采用如权利要求l所述的引物，通过环介导等温扩增法，特异性地扩增新城疫病毒的核苷酸序列的一部分，确^人是否存在有扩增产物。4.如4又利要求3所述的^r测新i成疫病毒的方法，其特4正在于，所述的方法包括如下步骤(1)准备检测样本；(2)提取样本的总RNA;(3)对步骤(2)的RNA进行逆转录反应，得到cDNA;(4)对步骤(3)的cDNA进行环介导的等温核酸扩增反应，反应温度为60~65°C,反应时间为10~60分钟；(5)终止反应；(6)检测所述扩增引物。5.如权利要求3所述的检测新城疫病毒的方法，其特征在于，所述的方法的步骤(3)和步骤(4)合并为步骤(31):对步骤(2)的RNA进行逆转录反应，得到cDNA后立即在同一个反应体系中对cDNA进行环介导的等温核酸扩增反应，两步的反应温度均为60~65。C,反应时间共为10~60分钟。6.如权利要求3所述的检测新城疫病毒的方法，其特征在于，所述的检测样本选自下列样本中的一种或者组合(1)禽类的气管、脑、肺、脾、肠、肾或胃；(2)禽类的喉头拭子或肛门拭子；或者(3)禽类的胚胎培养物或细胞培养物。7.如权利要求3所述的检测新城疫病毒的方法，其特征在于，所述的方法的步骤(6)所述的检测是通过扩增产物凝胶电泳、扩增产物浊度观测或扩增产物化学发光检测的方法进行的。8.—种检测生物样品中新城疫病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求l所述的引物。9.如权利要求8所述的检测生物样品中新城疫病毒的试剂盒，其特征在于，所述引物为如下序列号1序列号6所示的寡核苷酸，序列号1CTGCAGGAATTGTAGTAACAGG<SEQIDN0.1>，序歹'J号2ACGTGGACACAGACCCTT<SEQIDN0.2>，序歹'J号3TGGGCATATTCGG/AGCAACTTGCAGTCAATGTiTACACCTCGT<SEQIDN0.3>，序列号4<SEQIDNO,4>，序歹寸号5CTATGATTGACCC7GTCTGAG<SEQIDN0.5>，序歹'J号6CTACTTTGCTCACTCCTCTTG<SEQIDNO,6>;或者序列号1序列号6所示的寡核苷酸的互补链。GTGCAAiAGCCCCATTGGAGGAATTCCTTGCGGATiGAGTCGC全文摘要本发明涉及用于检测新城疫病毒的引物，所述的引物与新城疫病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增新城疫病毒的核苷酸序列的一部分。本发明的用于检测新城疫病毒的引物灵敏度高、特异性强。本发明还提供一种新城疫病毒的检测方法和一种新城疫病毒的检测试剂盒。文档编号C12N15/11GK101413035SQ20081021954公开日2009年4月22日申请日期2008年11月28日优先权日2008年11月28日发明者曹永长,强李,薛春宜申请人:中山大学