专利名称：病毒载体的生产方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，具体涉及一种病毒载体的生产方法，尤其涉及慢病毒载体 的生产方法。
背景技术：
病毒载体病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不 易降解；RNA病毒能整合到染色体以及基因水平较高等。因此病毒载体是良好的基因转运 载体。目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关的病毒。疱疹病毒和肝炎病 毒等。逆转录病毒用作载体时需进行几步改造(1)将天然的野生型RNA前病毒转变成DNA 载体，并插入欲转移的相关外源基因。其基本原理是用标记基因和外源基因替代病毒的编 码基因；(2)制备辅助细胞为载体DNA提供其丧失的功能；(3)将载体DNA导入辅助细胞以 产生病毒载体；(4)病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表达。现有的病毒载体生产方法主要有(1)常规的细胞培养方法在培养皿中培养细胞。该方法生产一次病毒载体需要 培养10-20个直径为15cm的培养皿，花费大量的培养基和血清，每次换液需要很长的时间 和精力，由于操作过程中步骤繁多，容易造成细胞的污染。(2)生产病毒载体时需要进行细胞转染，常规的转染方法，需要大量的质粒和转染 试剂，成本相当昂贵，生产工艺不能重复化，不能满足病毒载体大生产量的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，提供一种更利于病毒载体包 装细胞吸附和生长，病毒浓度高，操作简便，低成本、一次性使用，适合于规模化生产的病毒 载体的生产方法。本发明提供了一种病毒载体的生产方法。包括用聚酯纤维纸片方法培养病毒载体 包装细胞和细胞高密度转染技术。本发明利用传统的价格低廉的磷酸钙转染试剂实现对悬 浮细胞的高效转染，细胞转染效率可达90%以上。利用聚酯纤维纸片作为微载体加入到细 胞培养体系中，作为细胞的附着物，细胞不透过缝隙，可固定在纤维的空隙中附着生长。本发明的生产方法包括下列步骤一、聚酯纤维纸片方法培养慢病毒载体包装细胞(1)包装细胞先在细胞培养皿中培养到IO6-IO7个总量；(2)将IO6-IO7个总量的细胞从细胞培养皿中消化下来，并离心收集；(3)将收集的细胞与聚酯纤维纸片混合后铺入细胞培养皿或细胞培养装置，聚酯 纤维纸片的浓度为每30ml培养基中加入0. lg-5g的聚酯纤维纸片；(4)加入含5% -10%胎牛血清的细胞培养基淹没聚酯纤维纸片；(5)放置32-37°C的二氧化碳培养箱中孵育；(6)24小时内进行细胞换液；
(7)连续培养4-10天后，将聚酯纤维纸片收集，用胰酶进行消化，消化时间短于20 分钟，然后低速离心收集细胞；(8)在15ml或50ml离心管中，将细胞重新悬浮于10_30ml的新鲜含0% -2%胎牛 血清培养基中；二、细胞高密度转染(1)取一个试管，将产病毒所需要的各种质粒，包括辅助质粒和目的载体质粒，按 照1 1 2比例混合，总量300-600ug ；(2)向质粒中加入250ul_800ul的0. 5M氯化钙；(3)将上述质粒和氯化钙混合物放置冰上或4°C 10-20分钟；(4)取500ul_2ml的2 X HBS (平衡缓冲液)与上述混合物混勻；(5)混勻后将试管放置室温25°C 10-30分钟后加入到步骤一(8)中得到的细胞悬 浮液中，形成转染体系；(6)将转染体系放置到32_37°C的二氧化碳培养箱中孵育20_60分钟，每5分钟轻 摇管子，避免细胞纠集成团；(7)将离心管中的混合物倒入到预先准备的含有0. 6-10g的聚酯纤维纸片载体的 15cm细胞培养皿或细胞培养设备中，同时再加5%胎牛血清的培养基至总体积30ml ；(8)放入32-37°C二氧化碳培养箱中培养6-12小时后，用新鲜的含有10%胎牛血
清培养基换液；(9)每隔M小时收取病毒上清液，收取4次，获得病毒上清。本发明所述步骤一(1)的细胞培养基为高糖DMEM培养基，含10% Gibco的胎中血 清，抗生素和谷氨酰胺。本发明所述高糖DMEM培养基、5%胎牛血清培养基、10%胎牛血清培养基与0% 2 %胎牛血清培养基通过市售得到。本发明利用聚酯纤维纸片作为微载体加入到细胞培养体系中(0. lg-5g/30ml培 养基的浓度加聚酯纤维载体纸片)，作为细胞的附着物。所述聚酯纤维纸片为市售的的各种聚酯纤维无纺布，具生物兼容性和亲水性(在 使用前可以用1-10%的明胶进行浸泡30分钟)、70-95%致密度(在10倍的显微镜下观察 纤维的致密程度)、适用于充填床式生物反应器(Packing-BedBioreactor)、具有高表面积 /体积比(S/V ratio)等，且结构轻量化，每Ig约20-100片纤维片，可提供500-5000cm2表 面积供细胞生长。使用时以3-150g/lL浓度，装载于吊篮式培养瓶内不锈钢充填隔间内，经 100-12rc, 20-60分湿热灭菌后供培养使用。该聚酯纤维纸片特点1、不溶于水。2、聚酯纤维纸片规格为纸片厚度为小于l_5mm3、纤维直径为l-10uM。4、交叉错集排列密度70% -95%5、在10倍显微镜下观察，细胞不可透过缝隙，可固定在纤维的空隙中开始附着生长。6、每片的大小可自行调节
7、使用前必须经过酒精或者射线消毒处理。本发明适用于腺病毒载体，杆状病毒载体、α逆转录病毒载体、β逆转录病毒属、 Y反转录病毒载体、S反转录病毒载体、ε反转录病毒载体以及慢病毒载体；其中的慢病 毒载体包括牛慢病毒载体、马慢病毒载体、猫慢病毒载体、羊慢病毒载体和人类慢病毒载体 等各类病毒载体的大规模制备，同时适用于蛋白的大规模生产应用。本发明的方法可以大量提高包装细胞的产量与病毒载体的产量。改进的新型磷酸 钙高密度细胞转染法可提高转染效率。传统的磷酸钙转染方法中的细胞数为IO6细胞/ml， 本发明用到的浓缩高密度细胞达到5xl07细胞/ml。
图1-5本发明实施例1每隔M小时聚酯纤维纸片的细胞生长情况(图1为M小 时后、图2为48小时后、图3为72小时后、图4为96小时后、图5为120小时后。)图6为本发明实施例1培养7天后1个15cm直径的培养皿可以生产5X IO8细胞 数，是传统工艺培养的50倍。其中，纵座标为细胞总数，单位为IO7数量级；横坐标中的数字为培养天数图7为本发明实施例2生产的病毒产量，本发明的生产方法是传统工艺的100倍产量。其中，纵座标为10的7次方病毒颗粒(病毒产量)横坐标的1组代表传统的生产工艺，2组代表本发明方法
具体实施例方式实施例1培养生产人类免疫缺陷病毒-1来源的慢病毒载体包装细胞293细胞的 方法(1)先培养人胚肾293细胞2-3盘(IOcm培养皿)，每盘细胞培养基为IOmlsigma 公司的高糖DMEM培养基，含10% Gibco的胎牛血清，1 %抗生素和1 %谷氨酰胺，在37度二 氧化碳培养箱中孵育，每M小时换液，到细胞长满培养皿为止)，养到满为止，吸干培养皿 中的培养基后，加5ml0. 25 %的胰酶在37度二氧化碳培养箱中，孵育10分钟后，用移液枪轻 轻吹打细胞，消化下来细胞后，收集到离心管中低速离心(1000转每分钟的速度离心)，将 上清去掉，再用30ml含10%胎牛血清的DMEM培养基悬浮细胞.(2) 0. 6g聚酯纤维纸片放入15cm细胞培养皿里，将收集的30ml细胞加到15cm培 养皿里(恰好淹没纸片)，放到二氧化碳培养箱中，37°C，5%二氧化碳。(3)每隔M小时换新鲜培养液(含10%胎牛血清的DMEM培养基)，并按照常规的 细胞计数法计数，连续培养7天后，纸片上的细胞已经长满。结果培养7天后1个15cm直径的培养皿可以生产5 X IO8细胞数，是现有技术培 养的50倍。(见图6)实施例2细胞高密度转染法生产人类免疫缺陷病毒-1来源的慢病毒载体(1)按实施例1方法，用聚酯纤维纸片的方法培养慢病毒载体包装细胞，培养7天 后1个15cm直径的培养皿可以生产5 X IO8细胞数；(2)用30ml pH7. 4的磷酸盐缓冲液清洗所有的纸片2次，再用IOml胰酶消化细胞，消化时间10分钟，用力吹打纸片直到细胞全部脱落后，在15ml离心管里1000转每分钟 离心收集细胞；(3)倒掉上清，加入IOml的无血清sigma公司的DMEM(常规培养基，市售)培养 基，得到细胞悬浮液；(4)准备 1. 5ml 管，向管中分别加入质粒 P8. 91 IOOug, PCMV-VSV-G IOOug, Lv-PGK-GFP 250ug。共 450ug 质粒，然后加入 250ul 氯化钙(0. 5Mol/L)；(5)冰上放置10分钟；(6)逐滴加入500ul 2XHBS溶液(Hank' s平衡盐溶液)；(7)室温25度放置15分钟后将混合物逐滴加入步骤(3)中得到的细胞悬浮液中；(8)混合均勻上述质粒细胞混合物，放入37°C，5%二氧化碳培养箱中孵育30分 钟，每5分钟轻微摇动离心管，促使细胞悬浮避免成团；(9)将离心管中的混合物倒入到预先准备的含有Ig的聚酯纤维纸片载体的15cm 细胞培养皿中，同时再加含有5%胎牛血清的sigma公司的DMEM培养基至总体积30ml ；(10)放入37°C二氧化碳培养中培养12小时后，用新鲜的DMEM+10%胎牛血清培养
基换液；(11)每隔M小时收取病毒上清。(12)收取4次后检测病毒总产量为2. 74 X IO9病毒颗粒。本实施例和传统工艺比较，生产的病毒产量，本实施例的生产方法是传统工艺的 100倍产量。(见图7)
权利要求
1.一种病毒载体的生产方法，其特征在于该方法包括下列步骤一、聚酯纤维纸片方法培养慢病毒载体包装细胞(1)包装细胞先在细胞培养皿中培养到IO6-IO7个总量；(2)将106-107个总量的细胞从细胞培养皿中消化下来，并离心收集；(3)将收集的细胞与聚酯纤维纸片混合后铺入细胞培养皿或细胞培养装置，酯纤维纸 片的浓度为每30ml培养基中加入0. lg-5g的聚酯纤维纸片；(4)加入含5%-10%胎牛血清的细胞培养基淹没聚酯纤维纸片；(5)放置32-37°C的二氧化碳培养箱中孵育；(6) 小时内进行细胞换液；(7)连续培养4-10天后，将聚酯纤维纸片收集，用胰酶进行消化，消化时间短于20分 钟，然后低速离心收集细胞；(8)在15ml或50ml离心管中，将细胞重新悬浮于10-30ml的新鲜含0%-2%胎牛血清培养基中；二、细胞高密度转染(1)取一个试管，将产病毒所需要的各种质粒，包括辅助质粒和目的载体质粒，按照 1:1: 2比例混合，总量300-600ug ；(2)向质粒中加入250ul-800ul的0.5M氯化钙；(3)将上述质粒和氯化钙混合物放置冰上或4°C10-20分钟；(4)取500ul-2ml的2X HBS平衡缓冲液与上述混合物混勻；(5)混勻后将试管放置室温25°C10-30分钟后加入到步骤一(8)中得到的细胞悬浮液 中，形成转染体系；(6)将转染体系放置到32-37°C的二氧化碳培养箱中孵育20-60分钟，每5分钟轻摇管 子，避免细胞纠集成团；(7)将离心管中的混合物倒入到预先准备的含有0.6-10g的聚酯纤维纸片载体的15cm 细胞培养皿或细胞培养设备中，同时再加5%胎牛血清的培养基至总体积30ml ；(8)放入32-37°C二氧化碳培养箱中培养6-12小时后，用新鲜的含有10%胎牛血清培 养基换液；(9)每隔M小时收取病毒上清液，收取4次，获得病毒上清。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤一(1)的细胞培养基为高糖DMEM 培养基，含10% Gibco的胎中血清，抗生素和谷氨酰胺。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述聚酯纤维纸片为不溶于水、纸片厚度 为l_5mm、纤维直径为1-lOuM、交叉错集排列密度70% -95%、使用前必须经过酒精或者射 线消毒处理。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述病毒载体为腺病毒载体，杆状病毒载 体、α逆转录病毒载体、β逆转录病毒属、Y反转录病毒载体、δ反转录病毒载体、ε反 转录病毒载体、牛慢病毒载体、马慢病毒载体、猫慢病毒载体、羊慢病毒载体或人类慢病毒 载体。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法适用于蛋白的大规模生产应用。
全文摘要
本发明公开了一种病毒载体的大规模生产方法。包括用聚酯纤维纸片方法培养病毒载体包装细胞和细胞高密度转染技术，本发明方法可以提高包装细胞的产量与病毒载体的产量，提高转染效率，本发明的浓缩高密度转染时的细胞密度达到5×107细胞/ml。本发明适用于腺病毒载体，腺相关病毒载体，杆状病毒载体以及α逆转录病毒载体、β逆转录病毒属、γ反转录病毒载体、δ反转录病毒载体、ε反转录病毒载体、牛慢病毒载体、马慢病毒载体、猫慢病毒载体、羊慢病毒载体或人类慢病毒载体的大规模制备，并适用于蛋白的大规模生产应用。
文档编号C12N15/867GK102140477SQ201010103819
公开日2011年8月3日 申请日期2010年2月1日 优先权日2010年2月1日
发明者张文炜, 杨光华, 王 华 申请人:上海比昂生物医药科技有限公司