专利名称：一种人tshr胞外段融合蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及人TSH受体的重组和生物工程制备，特别涉及一 种人TSHR胞外段融合蛋白及其制备方法。
背景技术：
自身免疫性甲状腺病(Autoimmune thyroid disease, AITD)属于器官特异性疾 病，包括 Graves 病(Graves，disease,GD)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto，sthyroditis,HT) 及特发性黏液性水肿(Primary myxedema，PM)，其发病率占内分泌系统疾病的首位。促甲 状腺激素受体(thyrotropin receptor, TSHR)是诱发AITD的主要抗原。人TSHR分子量为84. 5KD，糖基化后达100KD，与AITD的发病关系密切。人TSHR 主要存在于甲状腺细胞膜上，属于鸟嘌呤核苷酸调节蛋白(G蛋白)耦连受体超家族成员之 一；由膜外区、跨膜区和膜内区三部分组成膜外区有397个氨基酸残基，含有N-端、5个糖 基化位点和两个具有免疫原性的肽段。在生理情况下，促甲状腺激素(TSH)与TSHR结合后，通过腺苷酸环化酶AC_cAMP 通路和磷脂酶C- 二酰甘油及磷酸肌醇通路调节甲状腺细胞的生长、分化和功能。AITD发 病时，免疫功能异常的机体针对TSHR产生了自身抗体(Thyrotropin receptor antibody, TRAb)。TRAb属多克隆抗体，作用于TSHR膜外区(TSHRecd)的不同位点，依其功能的不同分 为三种(1)甲状腺刺激性抗体(Thyroid stimuLating antibodies,TSAb)通过激活腺苷 酸环化酶-cAMP通路，过度刺激甲状腺滤泡的功能和生长，引起甲状腺功能亢进；(2)甲状 腺刺激阻滞抗体(Thyroid-stimuLating blocking antibodies, TSBAb)具有阻滞 TSH 或 TSAb对甲状腺的兴奋作用，抑制甲状腺滤泡细胞的生长，可引起甲状腺功能减低；(3)TSH 结合抑制免疫球蛋白(TSH Binding inhibitorimmunoglobuLin, TBII)与 Graves 病甲状 腺外症状如突眼、胫前粘液性水肿有关。鉴于TSHR在甲状腺滤泡细胞上的生理功能和在AITD发病中的重要作用，获得高 亲和力的TSHR纯化蛋白已成为深入研究TSHR功能及其与TRAb作用的基础。而存在于甲 状腺细胞膜上的TSHR数量少，结构不稳定，且难以纯化，因此对人TSHR基因进行分子克隆， 建立体外表达系统对于AITD发病及临床治疗研究有重要意义。人TSHR基因位于染色体14q31处，由2470bp碱基的开放读码框编码而成；其cDNA 于1989年由Nagayama等成功克隆。目前，原核表达的人TSHR不能形成正确的自然构象及 糖基化，亲和力低，应用受限。哺乳动物细胞可表达有功能的TSHR，但产量低。通过杆状病 毒载体将hTSHR基因转入昆虫细胞可获得毫克数量的TSHR膜外区蛋白，但这些蛋白大部分 不溶于水并且与TSH的结合率较低。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种人TSHR胞外段融合蛋白及其制备方法，利用分 子生物学技术实现人TSHR胞外段融合蛋白在毕赤酵母系统的分泌表达，纯化以及对融合蛋白的活性检测。本发明是通过以下技术方案来实现一种人TSHR胞外段融合蛋白，该融合蛋白是在人TSH受体蛋白胞外段的N端连接 外源性分泌信号肽，在C端连接纯化标记序列。所述的外源性分泌信号肽为酿酒酵母的α -factor因子。所述的纯化标记序列为6XHis的标记序列，通过能够被肠激酶识别的序列与TSH 受体蛋白胞外段连接。所述的肠激酶识别的序列与6 XHis标记序列之间还插入C-myC抗原决定簇序列。所述的切除N端外源性分泌信号肽的人TSHR胞外段融合蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。一种人TSHR胞外段融合蛋白的制备方法，包括以下步骤1)以包含人TSHR基因的载体为模板，以引物对P为引物，PCR扩增人TSHR胞外段 基因；所述的引物对P为上游弓丨物 Pl :ccctcgagaa aagagggtgt tcgtctccac ；下游引物 P2 :gctctagagc atcatcatca tcttttctca ggaacttgta g ；2)将PCR扩增的人TSHR胞外段基因用Xho I, Xba I双酶切得到线性化的 片段；并将该线性化片段与Xho I、Xba I双酶切的PPICZaA载体连接得到表达载体 pPICZαA-hTSHRecd ；3)将表达载体pPICZ α A-hTSHRecd转染到感受态的毕赤酵母，筛选得到目的片段 阳性表达的阳性转化子；4)将阳性转化子在BMGY培养基中28°C、250r/m条件下培养，当0D600达到2 6 时，离心收集菌体，用BMMY培养基重悬至0D_为1. 0诱导表达，每24h补加甲醇至终浓度 为0. 5%,28°C>250r/m条件下继续培养72h ；所述的BMGY培养基为700ml去离子水中加IOg酵母提取物和20g蛋白胨，高压 灭菌冷却至室温后加入100ml IM磷酸缓冲液，100ml IOX酵母氮碱，2ml 500X生物素， 100ml IOX 甘油；所述的BMMY培养基为700ml去离子水中加IOg酵母提取物和20g蛋白胨，高压 灭菌冷却至室温后加入100ml IM磷酸缓冲液，IOOml 10 X酵母氮碱，2ml500 X生物素， 100ml IOX 甲醇；5)培养结束后，将重组酵母培养液室温12000r/m离心lOmin，取上清液于搅拌下 加入硫酸铵至终浓度为50% ；4°C条件下缓慢磁力搅拌4h，然后12000r/m离心30min，弃上 清；所得沉淀物以50mM，PH7. 4的PBS溶解，得到人TSHR胞外段融合蛋白浓缩液；6)利用6XHis标记序列识别的层析柱对人TSHR胞外段融合蛋白浓缩液分离，透 析除盐后得到纯化的人TSHR胞外段融合蛋白。所述的表达载体pPICZ α A-hTSHRecd包含有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。所述的表达载体pPICZ α A-hTSHRecd转化到感受态毕赤酵母的步骤为将酶切线性化的pPICZ α A-hTSHRecd表达载体与感受态毕赤酵母混合后，加于 0. Icm电转杯中，冰水浴5min，于电压1800v，电容25uF，电阻200欧姆条件下电击转化；电击后，立即加入ImL浓度为IM预冷的山梨醇，混勻，30°C条件下静置2h，然后转
5移到含有zeocin的YPDS选择培养板上培养3 7天，待菌落出现后进行PCR鉴定筛选表 达人TSHR阳性表达的阳性转化子。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果1、相比较于甲状腺细胞膜上的TSHR(TSH受体)数量少、难以纯化，以及原核系统 表达和杆状病毒载体在昆虫细胞表达的人TSHR胞外段蛋白亲和力低、与TSH的结合率较低 的缺陷；本发明构建的融合蛋白是在人TSH受体蛋白胞外段的N端连接外源性分泌信号肽， 使得人TSH受体蛋白胞外段经表达后进入分泌途径，使蛋白质在分泌到胞外之后获得准确 的构型；更为重要的是能够通过电击使表达载体pPICZaA-hTSHRecd整合至毕赤酵母基 因组实现该融合蛋白的高效稳定表达；所表达的融合蛋白以可溶性形式分泌，具有良好的 TSH受体抗原性，能够识别Graves病患者血清中的抗体、TSHR的单克隆抗体TSHRmAb ；本发明提供的融合蛋白是一种能够高效稳定表达具有TSH受体抗原性的重组蛋 白，包含PPICZ α A-hTSHRecd表达载体的毕赤酵母表达系统是一种良好的体外表达系统；而且在C端通过肠激酶识别的位点连接标记序列，能够方便地纯化融合蛋白，在 必要的时候通过肠激酶的限制性酶切反应可以去除标记序列。2、鉴于本发明构建的融合蛋白具有TSHR的抗原性，具有以下的用途a、TRAb的检测TRAb的检测有助于GD与其他甲状腺功能亢进性疾病相鉴别；用 于抗甲状腺药物的疗效检测；甲状腺相关性眼病的诊断；GD患者孕期及产后监测等。b、建立TSHR特异性T细胞克隆，制备T细胞疫苗治疗Graves甲亢。C、免疫动物，制造AITD动物模型。d、用于制备TSHR特异性单克隆抗体，进行TSHR抗原表位研究。e、用以诱导可识别天然TSHR的抗体，检测甲状腺癌或甲状腺外组织TSHR的表达寸。
图1为TSHRecd基因的PCR扩增片段电泳图；图2为pPICZaA载体的多克隆位点分布图；图3为表达载体pPICZ α A-hTSHRecd的双酶切鉴定图；图4为本发明的阳性转化子直接菌落PCR鉴定图；图5为诱导表达的人TSHR胞外段融合蛋白SDS-PAGE凝胶电泳后考马斯亮兰染色 图；图6为诱导表达的人TSHR融合蛋白以anti-His抗体作为一抗的WesternBlot结 果图；图7为诱导表达的人TSHR融合蛋白以TSHRmAb抗体作为一抗的Western Blot结 果图。
具体实施例方式本发明提供一种能够高效表达具有TSHR抗原性的重组蛋白，通过建立可分泌表 达人TSHR的毕赤酵母工程菌，在其良好的体外表达系统中得到高表达的具有TSHR抗原性的分泌形式的可溶性重组蛋白。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是 限定。1、表达载体 pPICZ α A-hTSHRecd 的构建a、hTSHRecd胞外段基因的克隆根据GenBank中人TSHR基因序列(NM_000369. 2)，设计并合成一对用于扩增 hTSHRecd cDNA编码区的寡核苷酸特异性引物上游弓I物 Pl :ccctcgagaa aagagggtgt tcgtctccac30;下游弓丨物 P2atcatcatca tcttttctca ggaacttgta g 41;Pl含有Xho I酶切位点(划线部分)，P2含有Xba I酶切位点(划线部分)和肠 激酶识别的序列。以P1、P2作为引物对，以pcDNA3. Ι-hTSHR质粒(由美国加州大学医学院Chen Chun-Rong教授惠赠，长度7700bp)为模板，PCR扩增1227bp的人TSHR基因；PCR 反应条件为94°C预变性 120s，94°C变性 60s、58°C退火 60s、72°C延伸 120s， 35个循环；72 °C终延伸5min ；PCR扩增完成后，用1 %的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物用微量移液器吸取PCR产物5yL，与IyL 6 X上样缓冲液充分混勻，缓慢加入凝 胶上样孔内；以DL1000DNA Marker为分子量标准，上样4 μ L ； 100V电压，电泳30分钟；经Bio-Rad Gel Doc XR凝胶成像分析系统显示电泳条带清晰，结果如图1所示， 可以看到一条清晰的1. 2Kb的条带，扩增出的PCR片段与预期目的片段大小一致；PCR产物 条带与预期片段相符后，对PCR产物进行DNA测序，hTSHRecd胞外段基因的测序结果如SEQ ID NO. 2 所示；应用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物，得到纯化的hTSHRecd胞外段基因。b、hTSHRecd胞外段基因的双酶切将纯化的hTSHRecd胞外段基因用Xho I、Xba I双酶切，20 μ L的酶切体系为5 μ L的hTSHRecd胞外段基因、1 μ L的Xho I限制性内切酶、1 μ L的Xba I限制性 内切酶、2 μ L的IOXM buffer，灭菌去离子水补足20 μ L ；37°C水浴，酶切2h ；对双酶切后的hTSHRecd胞外段基因用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，用吸附柱 CAl纯化包含的hTSHRecd胞外段基因的电泳条带，离心收集；对于得到的带黏性末端的 hTSHRecd 胞外段基因用 Nanodrop SpectrophotometerNd-IOOO 检测其纯度，0D260/0D280 比值为1.8。C、pPICZ α A载体的双酶切将载体质粒pPICZ α A(其多克隆位点图谱如图2所示)转化感受态T0P10F'细 菌，37°C恒温箱培养12h后挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素(Amp) 100mg/L的LB培养 液中，370C，160rpm培养过夜后收集细菌提取质粒pPICZ α A ；将收集的质粒pPICZ α A经Xho I,Xba I双酶切得到线性化片段，用DNA回收试剂 盒进行回收。d、表达载体pPICZ α A-hTSHRecd的连接和提取将同样Xho I.Xba I双酶切的线性化的hTSHRecd胞外段基因片段和pPICZ α A载 体用T4DNA连接酶连接，得到表达载体pPICZ α A-hTSHRecd ；
将重组表达载体pPICZ α A-hTSHRecd转化感受态DH5 α细菌，37°C恒温箱培养12h 后挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素(Amp) 100mg/L的LB培养液中，摇床37°C培养后收 集细菌，应用无内毒素质粒大量提取试剂盒提取重组质粒，Nanodrop Spectrophotometer Nd-IOOO检测其纯度，0D260/0D280比值为1. 86 ；应用限制性内切酶Pme I酶切(pPICZ α A载体中的一个酶切位点)重组质粒使之 线性化，应用乙醇沉淀法浓缩线性化的重组质粒，使之浓度达到1 μ g/μ L，-20°C保存。琼脂糖凝胶电泳显示重组质粒的长度约4800bp，对收集的重组质粒Xho I, Xba I 双酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图3所示其中泳道1在3600bp、1200bp处见两条电泳条 带(其中3600bp片段为载体pPICZ α A, 1200bp片段为hTSHRecd的编码基因)，M为200bp 的DNA ladder ；说明重组质粒经酶切后获得预期大小的插入片段；将重组质粒送北京奥科生物技术有限公司进行DNA测序，结果表明目的基因TSHR 与pPICZ α A载体上的酿酒酵母的α-factor因子(α-交配因子)正确连接，形成新的融 合基因，其核苷酸序列具体如SEQ ID Ν0. 3所示；α -factor因子可引导重组蛋白进入分泌途径，使蛋白质在分泌到胞外之后获得 准确的构型。2、人TSHR胞外段融合蛋白的真核表达载体的构建由于毕赤酵母表达系统是比较完善的外源基因表达系统，其表达外源基因具有以 下优点表达载体特有的醇氧化酶基因启动子(A0X1)具有强诱导性和强启动性，适于外源 基因的高水平诱导表达，已报道的最高表达量分别为22g/L(胞内)和14.8g/L(分泌)；表 达产物可以糖基化且属于分泌型表达，有利于蛋白的分离和纯化，且可以高密度连续发酵 培养，能适应工业化生产的需要；培养基价廉；遗传背景清楚，便于进行遗传操作；外源基 因在宿主细胞中稳定存在。50 % 75 %的毕赤酵母表达系统能以合理的水平表达人们感兴 趣的任何外源性蛋白；一些在杆状病毒表达系统不能表达的蛋白质在毕赤酵母表达系统却 能成功表达。因此，本发明采用毕赤酵母作为宿主细胞。TSHRecd的毕赤酵母高效真核表达系统的建立具体为a、酵母菌株的分离纯化接种酵母菌GSl 15于5mL的YPD (900ml去离子水中加入IOg酵母提取物，20g蛋白 胨后高压灭菌，冷却至室温后加入10XD葡萄糖100ml，4°C存放)液体培养基，30°C，200rpm 振荡过夜，涂布YPD平板，300C培养48h，用YNB基本培养基MD平板和含组氨酸的补充培 养基MDH平板作点种分离纯化，挑选在补充培养基上生长而在基本培养基上不生长的单菌 落，分离纯化出的GSl 15组氨酸营养缺陷株，4°C保存。b、GSl 15感受态细胞的制备挑取经分离纯化的GSl 15组氨酸营养缺陷株单菌落接种于IOmL的YPD培养基中， 30°C振荡过夜；次日将种子液以1 100接种至新鲜200mLYPD培养基中，30°C，200rpm过夜培养 至 0D600 = 1.3;菌液于4°C，1500 X g离心5分钟，弃上清，沉淀重悬于200mL冰预冷的灭菌ddH20 中；于4°C，1500 Xg再次离心5分钟，弃上清，沉淀重悬于IOOmL冰预冷的灭菌ddH20中。然后分别进行2次离心分离沉淀，依次重悬于20mL、ImL冰预冷的IM的冰预冷的
8IM山梨醇液中，终体积约1. 5mL，得到GSl 15感受态细胞。C、重组表达载体电转化毕赤酵母GSl 15感受态细胞分别取80 μ L酵母菌感受态细胞与IOyg经内切酶Pme I线性化的重组表达 质粒或载体质粒混合，用加样器将样品滴加于0. Icm电转杯中，冰水浴5min，用Bio-Rad Gene PuLser II电转仪于电压1800v，电容25uF，电阻200欧姆条件下电转化；电击后，立即加入ImL浓度为IM冰预冷的山梨醇，混勻，转移至15mL离心管中， 30°C，静置2h ；分别取10、25、50、100和200uL菌液涂布于含有100 μ g/mL Zeocin (属于博 来霉素族)的YPDS平板上，30°C孵育3-10天，直至出现菌落。d、毕赤酵母阳性转化子的筛选与鉴定用经高压灭菌的牙签挑取在含有100 μ g/mL Zeocin的YPDS平板上生长良好的单 克隆菌落，接种于YPD培养基中于30°C，200rpm，过夜培养后冻存于_80°C ；将同一菌落的剩余部分挑入相应编号的200 μ L EP管中(已加入12. 5μ L灭菌 去离子水)，加入2. 5 μ L浓度为IOU/ μ L的溶菌酶溶液，混勻，于30°C静置10分钟后放 入-80°C放置10分钟即成直接菌落PCR模板，用5' AOXl引物P3、3' AOXl引物P4进行 PCR扩增鉴定；P3 :gactggttcc aattgacaag c 21 ；P4 :gcaaatggca ttctgacatc c 21 ；直接菌落PCR体系5 X primeSTARTM Buffer (已加 Mg2+) IOuL ；dNTP Mixture (各 2. 5mM)4uL ；5' AOXl primer(lOpmol/μ 1) IuL3' AOXl primer(lOpmol/μ 1) IuLPCR 模板5uL灭菌去离子水补至49. 5uL ；混勻后95°C，孵育 5 分钟；加入 PrimeSTARTMHS DNA PolymeraseO. 5uL,混勻；PCR反应条件为94 V变性60s，58 V退火60s，72°C延伸60s，30个循环后，72°C终 延伸7min。经琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图4 泳道1可见长度约为ISOObp的电泳条带，与 预期片段长度相符(588bp+1227bp，588bp为AOXl的长度，1227为目标片段长度)。3、融合蛋白的诱导表达及纯化接种阳性转化子于IOmL BMGY培养基中，28°C、250rpm培养过夜，同时接种阳性对 照GS115/His+MutS Albumin,阴性对照pPICZ α A转化子和GSl 15空菌进行培养，当OD6tltl达 到2 6时，室温、1500rpm离心集菌，用50mLBMMY培养基重悬至OD6tltl为1. 0继续在28°C、 250rpm诱导培养(BMMY中含有甲醇可以启动AOX1从而诱导蛋白表达)，分别于Oh、6h、12h、 24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h收集菌液各1. 4mL,补足BMMY培养基至50mL，每24h补加甲 醇至终浓度为0. 5% ；将样品离心后上清中加入蛋白酶抑制剂cocktail 20 μ L，于_80°C保 存。对于重组酵母培养液的进一步纯化为室温12000rpm离心10分钟，取上清液于搅拌下加入饱和硫酸铵至终浓度为50%，4°C条件下缓慢磁力搅拌4h，然后12000rpm离心30min，弃上清；所得沉淀物以50mM，PH7. 4 的PBS溶解，得到人TSHR胞外段融合蛋白浓缩液；利用6XHis标记序列识别的层析柱对人TSHR胞外段融合蛋白浓缩液分离，本发 明具体应用TALON Purification Kit (Cat. No. 635515)来纯化，按照其说明书进行人 TSHR胞外段融合蛋白的纯化。4、表达的融合蛋白的鉴定a、融合蛋白的考马斯亮兰染色取1. 4mL酵母诱导上清分装于两个1. 5mlEP管中，加入0. 7mL20%三氯乙酸溶液混 和混勻，冰上放置30min，4°C，12000rpm离心20min ；蛋白质沉淀用0. 8mL冰预冷的80%乙 醇反复振荡洗涤3次，4°C，12000rpm离心5min，去掉上清，自然风干沉淀；用^yLyL灭菌ddH20重悬蛋白质沉淀，取24μ L加入5X电泳缓冲液6yL， 100°C变性IOmin后上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳条件步骤1 :80V，30分钟；步骤2 120V，待溴酚蓝跑出玻璃板即可断电；SDS-PAGE凝胶取出后进行考马斯亮兰染色，图5所示为标记为149号转化子培养 上清经三氯乙酸浓缩后行SDS-PAGE凝胶电泳后考马斯亮兰染色结果其中，M为Maker，泳 道 1 9 分别是 96h、84h、72h、60h、48h、36h、24h、12h、6h、Oh 培养上清浓缩产物，Bio-Rad 凝 胶成像分析系统显示泳道1-7均可以在47KD条带处看到预期的目标蛋白，即149号转化子 于培养12h即有少量蛋白表达；在诱导72h后，目标蛋白表达量达到最大。在申请人构建的 多株阳性转化子中，大部分菌株在诱导36h后有目标蛋白表达。b、表达产物的Western Blot鉴定酵母诱导上清经步骤a的浓缩、电泳后，切除分离胶及多余的部分；取下凝胶，蛋 白质电转印至NC膜上，进行Western Blot鉴定，其中一抗是以TBST 1 200比例稀释 的Anti-His、TSHRmAb(美国加州大学医学院ChenChun-Rong教授惠赠)，二抗是以TBST 1 5000比例配制的辣根过氧化物酶标记的羊抗人或羊抗鼠IgG。Bio-Rad Gel Doc XR凝 胶成像分析系统分析目标条带的分子量和净光密度值；以Anti-His作为一抗的Western Blot结果如图6所示，其中，泳道M为蛋白 Maker，泳道1、2、3分别为编号不同的阳性转化子诱导的人TSHR胞外段融合蛋白，其均可在 目标大小处见清晰条带；以TSHRmAb作为一抗的Western Blot结果如图7所示，其中，泳道M为蛋白Maker， 泳道1为GS115/His+MutS Albumin，泳道2为GSl 15菌体蛋白，泳道3为pPICZ α A转化子 菌体蛋白，泳道4、5、6分别为编号不同的阳性转化子诱导的人TSHR胞外段融合蛋白；作为 对照泳道1、2、3没有显示出相应的条带，而泳道4、5、6均可在目标大小处见清晰条带；以上两组Western Blot检测说明，本发明构建的人TSHR融合蛋白具有TSHR的抗 原性和His纯化标签的特性。5、间接ELSIA法测定融合蛋白的功能测定重组酵母培养液室温12000rpm离心10分钟，取上清液于搅拌下逐滴加入饱和硫 酸铵至硫酸铵终浓度为50%，4°C，缓慢磁力搅拌4h，使其充分沉淀，12000rpm离心30min， 弃上清，所得沉淀物以50mM，PH7. 4的PBS溶解；把溶解好的融合蛋白溶液装入预先处理好的分子量合适的透析卡中，用
10PBS(50mM,PH7. 4)充分透析除盐，缓慢磁力搅拌，每4h换液一次，至萘氏试剂测透析外液为
无黄色；取出透析卡，将其包埋于聚乙二醇20000中，至透析卡中水分完全被吸干，然后向 透析卡中加入配制好的包被液(O. 015MNa2C03，0. 035MNaHC0s,0. 02% NaN3, ρΗ :9· 6)，使融 合蛋白的浓度为10 μ g/ml，每孔加入100 μ 1包被96孔板；分别以Graves病患者阳性血 清、TSHRmAb作为一抗加入不同的孔中，相应孔中加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人或羊 抗鼠IgG，同时以正常人混合血清组作为Graves病患者阳性血清组的对照，以PBS组作为 TSHRmAb组的对照，进行ELSIA检测，结果如表1所示，TSHRmAb组与PBS组、⑶患者混合血 清组与正常人混合血清组OD45tl值存在显著性差异(P < 0. 05)，表明融合蛋白具有很好的抗 原活性。表1人TSHR胞外段融合蛋白抗原活性的ELISA检测 *P < 0. 05vs PBS 组；**P < 0. 05vs 正常人混合血清组6、确定人TSHR胞外段融合蛋白的序列对于上述的具有TSH受体抗原性的融合蛋白的氨基酸序列经过生物公司测序，具 体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其中，第397 401氨基酸残基为肠激酶酶切位点，第 402 418氨基酸残基为c-myc抗原决定簇；第419 424氨基酸残基为6 XHis尾。应用 肠激酶进行酶切可获得长度为396个氨基酸长度的TSH受体蛋白；而Mfa因子作为信号肽 会在融合蛋白穿膜过程中被切除，故在培养上清中的hTSHRecd融合蛋白不含有Mfa因子。
权利要求
一种人TSHR胞外段融合蛋白，其特征在于该融合蛋白是在人TSH受体蛋白胞外段的N端连接外源性分泌信号肽，在C端连接纯化标记序列。
2.如权利要求1所述的人TSHR胞外段融合蛋白，其特征在于所述的外源性分泌信号 肽为酿酒酵母的α -factor因子。
3.如权利要求2所述的人TSHR胞外段融合蛋白，其特征在于所述的纯化标记序列为 6 X Hi s的标记序列，通过能够被肠激酶识别的序列与TSH受体蛋白胞外段连接。
4.如权利要求3所述的人TSHR胞外段融合蛋白，其特征在于在肠激酶识别的序列与 6XHis标记序列之间还插入c-myc抗原决定簇序列。
5.如权利要求4所述的人TSHR胞外段融合蛋白，其特征在于切除N端外源性分泌信 号肽的人TSHR胞外段融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDN0. 1所示。
6.一种人TSHR胞外段融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)以包含人TSHR基因的载体为模板，以引物对P为引物，PCR扩增人TSHR胞外段基 因；所述的引物对P为上游弓I物 Pl :ccctcgagaa aagagggtgt tcgtctccac；下游引物 P2 :gctctagagc atcatcatca tcttttctca ggaacttgta g ；2)将PCR扩增的人TSHR胞外段基因用XhoI、Xba I双酶切得到线性化的片 段；并将该线性化片段与Xho I>Xba I双酶切的PPICZaA载体连接得到表达载体 pPICZαA-hTSHRecd ；3)将表达载体pPICZα A-hTSHRecd转染到感受态的毕赤酵母，筛选得到目的片段阳性 表达的阳性转化子；4)将阳性转化子在BMGY培养基中28°C、250r/m条件下培养，当0D600达到2 6时， 离心收集菌体，用BMMY培养基重悬至0D_为1. O诱导表达，每24h补加甲醇至终浓度为 0. 5%,28°C>250r/m条件下继续培养72h ；所述的BMGY培养基为700ml去离子水中加IOg酵母提取物和20g蛋白胨，高压灭菌 冷却至室温后加入100ml IM磷酸缓冲液，IOOml IOX酵母氮碱，2ml 500X生物素，IOOml IOX甘油；所述的BMMY培养基为700ml去离子水中加IOg酵母提取物和20g蛋白胨，高压灭菌 冷却至室温后加入100ml IM磷酸缓冲液，IOOml 10 X酵母氮碱，2ml500 X生物素，IOOml IOX甲醇；5)培养结束后，将重组酵母培养液室温12000r/m离心lOmin，取上清液于搅拌下加入 硫酸铵至终浓度为50% ；4°C条件下缓慢磁力搅拌4h，然后12000r/m离心30min，弃上清； 所得沉淀物以50mM，PH7. 4的PBS溶解，得到人TSHR胞外段融合蛋白浓缩液；6)利用6X His标记序列识别的层析柱对人TSHR胞外段融合蛋白浓缩液分离，透析除 盐后得到纯化的人TSHR胞外段融合蛋白。
7.如权利要求6所述的人TSHR胞外段融合蛋白的制备方法，其特征在于所述的表达 载体pPICZ α A-hTSHRecd包含有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。
8.如权利要求6所述的人TSHR胞外段融合蛋白的制备方法，其特征在于，表达载体 pPICZ α A-hTSHRecd转染感受态毕赤酵母为将酶切线性化的pPICZ α A-hTSHRecd表达载体与感受态毕赤酵母混合后，滴加于`0. Icm电转杯中，冰水浴5min，于电压1800V，电容25uF，电阻200欧姆条件下电击转化；电击后，立即加入ImL浓度为IM预冷的山梨醇，混勻，30°C条件下静置2h，然后转移到 含有zeocin的YPDS选择培养板上培养3 7d，待菌落出现后进行菌落PCR鉴定、western blot筛选表达人TSHR胞外段融合蛋白的阳性转化子。
全文摘要
本发明公开了一种人TSHR胞外段融合蛋白及其制备方法，所述的人TSH受体蛋白的N端连接外源性分泌信号肽，在C端连接纯化标记序列，当融合蛋白得到表达、纯化后，切除N端连接外源性分泌信号肽的融合蛋白其具体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过构建包含pPICZαA-hTSHRecd表达载体的重组毕赤酵母，在其良好的体外表达系统中得到高表达的具有TSH受体抗原性的分泌形式的可溶性重组蛋白。
文档编号C12R1/84GK101928348SQ201010103870
公开日2010年12月29日 申请日期2010年2月1日 优先权日2010年2月1日
发明者伍丽萍, 徐利, 施秉银, 杨琪, 田竹芳, 高雷 申请人:西安交通大学医学院第一附属医院