专利名称：来源于转基因植物的高致病性禽流感病毒蛋白疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种产生转基因植物的方法、一种自所述转基因植物产生抗原性禽流感病毒的血凝素蛋白的方法和针对禽流感病毒的疫苗组合物，所述转基因植物可以高度有效的方式产生禽流感病毒的表面蛋白血凝素，所述血凝素蛋白可诱导针对禽流感病毒的免疫原性，所述疫苗组合物包含通过所述方法产生的血凝素蛋白。背景领域
禽流感病毒(AIV)为属于正黏病毒的RNA病毒，其传播非常迅速。已知致病性非常多样化，从感染后无临床症状到几乎100%死亡率。所有禽流感病毒属于A型并具有多种血清型根据病毒表面存在的血凝素基因和神经氨酸酶基因，将血凝素(HA)归类为16个亚型，将神经氨酸酶(NA)归类为9个亚型，这潜在地允许A型流感病毒的144种不同的组合。在A型流感病毒的这些不同亚型中，已知H5和H7亚型对鸟致病，已知H1、H2和H3亚型导致人流感。一般已知禽流感病毒并不感染除禽和猪物种之外的任何动物。但是，在1997年香港出现了感染禽流感病毒的患者并且已知H5N1禽流感病毒导致患者的出现，这确认了人被禽流感病毒感染的可能性。人感染被认为由高致病性病毒引起，所述高致病性病毒通过当禽流感病毒和人流感病毒同时感染人时在它们之间的遗传组合而产生。此外，在韩国在2003年12月至2004年3月21日之间出现的高致病性禽流感H5N1的总共19例爆发，不仅影响了国内的家禽养殖产业，而且还因由对人感染的担忧引起的消费者信心缩减所致，影响了相关第二产业，并且导致了非常巨大的经济损失，包括1500亿韩元的仅在用于根除高致病性禽流感的政府花费之中的直接花费，接着该爆发结束。近来，在泰国和越南也不断出现H5N1感染的人病例并引起全世界的关注。但是，禽流感病毒具有如此多种血清型并且血清型相互之间有弱交叉免疫性或无交叉免疫性。因此，很难通过其它血清型来防止感染。因为禽流感病毒非常容易发生突变，故没有防止禽流感的有效疫苗。目前，最有效的防止方法是用抗菌剂洗涤，并用灭活的流感病毒疫苗或重组的禽痘病毒疫苗进行的胃肠外疫苗接种。然而，此类方法仅在禽流感爆发并检查病毒亚型后才使用。因此，对减少或防止禽流感的传播有限。尽管全球已将大量资金投入到禽流感并加速各种治疗剂和疫苗的开发，但尚未达到有效控制H5N1病毒的足够的疫苗生产量。到2008年6月为止，已开发了三种H5N1疫苗，但仍在实验阶段，并且生产量非常小。因此，当需求急剧上升时例如大流行时，供给足量的这些疫苗的可能性非常小。具体而言，限制在于由于各种原因针对H5N1的疫苗的生产困难并且需要大量时间使其商业化。针对H5N1的大多数疫苗是通过代表性方法获得的病毒疫苗，该方法中通常将病毒接种于鸡蛋中，接着扩增。然后分离，然而，该方法有以下限制生产量小；应对需求的急剧上升例如大流行的能力有限；并且需要大量资金和时间安装生产设备。因此，用鸡蛋产生高致病性H5N1疫苗实际上是不可能的。预期的是，并非制自病毒而是制自蛋白抗原的疫苗可有效防止家禽饲养主的经济损失并使家禽和牧场主免受致命病毒。因此，有利用蛋白抗原开发疫苗的需要。同时，近来已开发了利用植物和从植物中产生有用的生理活性物质的技术。从植物中有用的生理活性物质的生产具有以下优点可实质上减少生产的单位成本；可阻止自动物细胞或微生物合成的蛋白的分离和纯化期间可产生的包括病毒、癌基因和肠毒素在内的污染源；当商业化生物活性物质时，有可能长期储存种子，并且若植物容易栽培，则可以种子状态全球传播，并因此比应依赖冷藏和冷冻配送的蛋白更有利；并且若对生物活性物质的需求急剧上升，则大量生产设备所需的技术或成本绝对小于动物细胞系统，并且其可在最短时间内提供视大量需求而定的供应。由于植物具有真核蛋白合成途径，即哺乳动物所必需的翻译后修饰，因此植物能够产生与哺乳动物中表达的那些蛋白类似的蛋白。因此，很多关注已放在来自转基因植物的有用的生理活性物质的产生。然而，至今，自植物有效合成和产生有用的生物活性物质(例如医学上有用的蛋白、疫苗和工业上有价值的酶)的技术还没有变得非常成功。 本发明的公开内容抟术问是页因此，本发明人已研究用植物的所述特性来开发针对禽流感特别是针对高致病性病毒H5N1的蛋白疫苗，并发现通过用包含H5N1病毒血凝素(HA)基因的用于植物转化的重组载体转化植物，可实现自转基因植物的H5N1病毒的抗原性蛋白血凝素(HA)的大量生产。接着，本发明人开发了来源于植物的禽流感疫苗，其比传统疫苗更经济且更安全并且可用作易于给予的可食用疫苗，从而导致本发明的完成。因此，本发明的一个目标为提供制备产生血凝素(HA)的转基因植物的方法，所述血凝素为H5N1病毒的抗原性蛋白。本发明的另一个目标为提供通过所述方法制备的转基因植物，其中所述转基因植物产生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白。本发明的又一个目标是提供从本发明的转基因植物中产生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的方法。本发明的又一个目标是提供通过本发明产生的针对H5N1病毒的疫苗蛋白。本发明的又一个目标是提供针对H5N1病毒的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含本发明的转基因植物、自所述转基因植物产生的H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白或所述转基因植物的蛋白提取物。本发明的又一个目标是提供一种诊断临床样本中的抗体是因H5N1病毒的感染而形成还是因本发明的疫苗给予而形成的方法，其中所述方法包括以下步骤(a)从临床样本中收集血液；(b)从收集的血液中分离血清；和(C)将针对血凝素(HA)的抗体和针对纤维素结合域(CBD)的抗体加至所分离的血清以反应。技术方案为实现所述目标，本发明提供了一种制备产生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的转基因植物的方法，所述方法包括将用于植物转化的载体引入植物中，其中所述载体包含由以下组成的基因构建体(i)由选自SEQ ID NO :1-12的任一个核苷酸序列组成的DNA片段；(ii)具有SEQ ID NO : 13的核苷酸序列的BiP (分子伴侣结合蛋白)基因编码H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白的多核苷酸，其具有SEQ ID NO :14的核苷酸序列，(iv)编码纤维素结合域(CBD)的多核苷酸，其具有SEQ ID NO 15的核苷酸序列；和(v)编码HDEL(His-Asp-Glu-Leu)肽的多核苷酸，其中所述基因构建体与启动子可操作地连接。在本发明的一个实施方案中，将用于植物转化的载体引入植物的方法可为选自以下的任一种农杆菌(Agrobacterium sp.)介导的转化、粒子枪轰击、碳化娃晶须、超声处理、电穿孔和PEG (聚乙二醇)沉淀。在本发明的一个实施方案中，植物可为选自以下的双子叶植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆、烟草、爺子、辣椒、土豆、西红柿、中国白菜、大萝卜(Chinese radishes)、卷心菜、莴苣、桃、梨、草莓、西瓜、甜瓜、黄瓜、胡萝卜和芳:菜；或选自以下的单子叶植物水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦和洋葱。本发明还提供了通过本发明的方法制备的转基因植物，其中所述转基因植物产生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)。
此外，本发明提供了一种从转基因植物中产生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的方法，其中所述方法包括栽培本发明的转基因植物和将自所述转基因植物表达的HA蛋白分离和纯化，其中编码H5N1的血凝素(HA)蛋白的多核苷酸具有SEQ ID N0:14的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，血凝素(HA)蛋白(其为H5N1的抗原性蛋白并从转基因植物中分离和纯化)，可呈与纤维素结合域(CBD)融合的形式。本发明还提供了一种针对H5N1病毒的疫苗蛋白，该疫苗蛋白通过本发明的方法产生。在本发明的一个实施方案中，所述疫苗蛋白可为纤维素结合域(CBD)融合的H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白。此外，本发明提供了一种针对H5N1病毒的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含本发明的转基因植物、产生自所述转基因植物的H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白或所述转基因植物的蛋白提取物。本发明还提供了一种诊断临床样本中的抗体是因H5N1病毒的感染而形成还是因本发明的疫苗给予而形成的方法，其中所述方法包括以下步骤(a)从临床样本中收集血液；(b)从收集的血液中分离血清；和(c)将针对血凝素(HA)的抗体和针对纤维素结合域(CBD)的抗体加至所分离的血清中以反应。在本发明的一个实施方案中，若在步骤(C)的反应中检测到针对血凝素(HA)的抗体和针对纤维素结合域(CBD)的抗体两者，则可确定临床样本中的抗体因所述疫苗组合物的给予而形成；若仅检测到针对血凝素(HA)的抗体，则可确定临床样本中的抗体因H5N1病毒的感染而形成。有利作用依照本发明，从植物中产生抗原性H5N1禽流感病毒的血凝素蛋白的方法能够以低成本大量生产抗原性血凝素蛋白，所述植物用植物转化重组载体转化，其中所述载体可以高度有效的方式表达抗原性H5N1禽流感病毒的血凝素蛋白并能够使蛋白在内质网中保留以完成糖基化，其为抗原活性所必需。本发明所用的重组载体具有其中插入的纤维素结合域以便以快速和容易的方式分离植物中表达的蛋白。此外，本发明的转基因植物可呈饲料添加剂等形式，因此可用作可食用疫苗。此外，通过本发明产生的抗原性血凝素当给予动物模型时诱导免疫应答，因此不仅可用作H5N1禽流感病毒的蛋白疫苗，而且还可用作禽流感病毒感染的诊断试剂。附图简沭图Ia的示意图阐述了本发明中制备的用于植物转化的载体中35Sp-UTR35:Bip:H5N1 (HA) :CBD:HDEL:N0S部分的连接形式。图Ib显示了本发明的一个实施方案中制备的用于植物转化的载体的剪切图谱。图2显示了在自各转基因植物中提取的蛋白的SDS-PAGE电泳后，通过用CBD抗体的蛋白印迹分析转基因植物中H5N1的HA表达程度，所述转基因植物通过利用本发明的用于植物转化的载体产生。
图3的照片显示了通过利用本发明的用于植物转化的载体产生的能够产生H5N1的HA蛋白的拟南芥。图4为通过细胞免疫染色观察到的、本发明的转基因拟南芥中表达的H5N1的HA抗原性蛋白的细胞位置的照片。图5为蛋白印迹分析的结果，所述蛋白印迹分析在从本发明的转基因拟南芥中提取蛋白后，对其中蛋白提取物用降解寡糖的内切糖苷酶H处理的组和其中不用内切糖苷酶H处理的对照组进行，以确定H5N1的HA抗原性蛋白是否糖基化。图6a显示了通过考马斯染色对分离和纯化的蛋白的确认结果。用纤维素从本发明的转基因拟南芥中分离和纯化H5N1的抗原性HA蛋白。接着，进行SDS-PAGE电泳和考马斯染色。图6b显示了从本发明的转基因拟南芥中提取的总水溶性蛋白中检测表达的H5N1抗原性HA蛋白的量的结果。用CBD抗体进行蛋白印迹分析并用多用检测仪表(multigauge)程序检测信号强度。图7显示了通过ELISA用各血清检查针对禽流感抗原的特异性抗体即IgG抗体、IgG2a抗体和IgGl抗体的形成程度的结果。将分离自本发明的转基因拟南芥的H5N1的抗原性HA蛋白注射至小鼠中。对于对照组，使用注射了用TIV代替H5N1的抗原性HA蛋白的小鼠的血清样品。图8的图测量在将依照本发明产生的H5N1的抗原性HA蛋白或TIV(对于对照组)注射至小鼠中并用H5N2病毒诱导感染后各小鼠的体重变化。图9的图显示了在将依照本发明产生的H5N1的抗原性HA蛋白注射至小鼠或TIV(对于对照组)注射至小鼠中并用H5N2病毒诱导感染后，各小鼠的生存率。
图10显示了通过蛋白印迹分析的对用小鼠血清形成针对H5N1HA的抗体和针对CBD的抗体的确认结果。小鼠用依照本发明产生的H5N1的抗原性HA蛋白免疫。
图11显示了通过ELISA法检查针对禽流感抗原的特异性抗体、抗总IgG(鸡)抗体的形成的结果。将分离自本发明的转基因拟南芥的H5N1的抗原性HA蛋白注射至鸡中。分离血清样品并通过ELISA法检查针对禽流感抗原的特异性抗体的形成情况，对于对照组，显示其中将用PBS缓冲液代替H5N1的抗原性HA蛋白注射的鸡血清样品用于进行抗原-抗体反应的结果。
实施本发明的最佳方式本发明涉及用于防止高致病性禽流感H5N1病毒的疫苗的开发，并且特征在于产生H5N1病毒的抗原性蛋白血凝素(HA)的转基因植物的制备。更特别地，本发明提供了一种制备产生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的转基因植物的方法，其中所述方法包括将用于植物转化的载体引入植物中，其中所述载体包含由以下组成的基因构建体(i)由选自SEQ ID NO 1-12的任一个核苷酸序列组成的DNA片段；(ii)具有SEQ ID NO 13的核苷酸序列的BiP(分子伴侣结合蛋白)基因；(iii)编码H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白的多核苷酸，其具有SEQ ID NO: 14的核苷酸序列；(iv)编码纤维素结合域(CBD)的多核苷酸，其具有SEQ ID NO 15的核苷酸序列；和(V)编码HDEL(HiS-ASp-Glu-Leu)肽的多核苷酸，其中所述基因构建体与启动子可操作地连接。为了使来自植物的可用于疫苗的有用蛋白即H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白的产生最大化，本发明人制备了用于植物转化的重组载体，其将编码HA蛋白的基因引入植物中并在该植物中表达。所述重组载体包含5’非翻译区(5’UTR)的核苷酸序列，其可在翻译阶段 调节蛋白的表达。已知mRNA的5’非翻译区(5’ UTR)通常在基因表达的翻译后调节、mRNA转运至核外的调节、蛋白翻译效率的调节和mRNA稳定性的调节中起重要作用。在本发明中，5’非翻译区(5，UTR)可为提高分离自拟南芥的蛋白的翻译效率的DNA片段，并且优选具有选自由下表示出的SEQ ID NO :1-12的任一个核苷酸序列。5’UTR 序列
5，UTR No. 核苷酸序列SEQ ID NO.
UTR IAGAGAAGACGAAACACAAAAGI
UTR 2GAGAGAAGAAAGAAGAAGACG2
UTR 6AAAACTTTGGATCAATCAACA3
UTR 7CTCTAATCACCAGGAGTAAAA4
UTR 24AGAAAAGCTTTGAGCAGAAAC5
UTR 35AACACTAAAAGTAGAAGAAAA6
Ul AMAGAGAAGACGAAACACAAAAA7
Ul CCCAGAGAAGACGAAACACAACCC8
Ul GGGAGAGAAGACGAAACACAAGGG9
Ul(-4，5G)AGAGAAGACGAAACACGGAAG10
Ul(-4,5C)AGAGAAGACGAAACACCCAAGHU AAG AAGAAGAAGAAGMGAAGAAG ~12此外，本发明的用于植物转化的重组载体可包含靶向基因以移动血凝素蛋白至内质网，以便从植物中大量产生抗原性H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白。通常，当异源蛋白在转基因植物或细胞中过表达时，往往发生蛋白水解降解。然而，若外来蛋白靶向各种细胞内细胞器，这些蛋白可更稳定地储存。特别地，当异源蛋白靶向内质网而非存在胞质中时，可使蛋白水解降解最小化。此外，大多数病毒的表面蛋白以糖基化形式存在并且已知病毒的表面蛋白是否糖基化在病毒蛋白的稳定结构的形成、抗体反应的诱导和免疫应答的诱导等中起非常重要的作用(Goffard,A.等.，J. Virol. 79，8400-8409，2005 ；Hebert,D. N.等.,J. Cell Biol. 139，613-623,1997)。文献还已报道当对比糖基化蛋白和非糖基化蛋白时，病毒蛋白的糖基化有助于抗体形成(Ewasyshyn, M.，等.，J. Gen. Virol. 74，2781-2785，1993)。因为内质网包含大量甘露糖并且糖基化在内质网中活跃进行，所以将H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白移动至 内质网可保持蛋白的稳定性并得到大量糖基化形式的HA蛋白。在本发明中，编码Bip(分子伴侣结合蛋白)的多核苷酸可用于将H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白移动至植物内的内质网。优选可使用具有SEQ ID NO 13的核苷酸序列的多核苷酸(包含内含子的Bip的基因组DNA)，代替Bip的cDNA。Bip这种腔内结合蛋白(luminal binding protein)被鉴定为免疫球蛋白重链结合蛋白和葡萄糖调节的蛋白，并且为定位于内质网的HSP70分子伴侣家族的一个成员，且瞬时结合内质网中新合成的蛋白。确定靶向内质网的信号序列包含于Bip的N-端并在靶向靶蛋白至内质网中起作用。用于植物转化的重组载体可包含编码ER保留信号肽例如HDEL的多核苷酸以确保在HDEL信号肽的情况下，将异源蛋白保留于内质网中以增加通过分子伴侣的折叠和装配并随后进一步使蛋白水解降解最小化(Nuttall, J.等.，2002)。例如这样地，已知当异源蛋白保留于内质网而非送至分泌途径时，异源蛋白的产量增加了约10-100倍(Hellwig，S.等.，2004)。此外，本发明的用于植物转化的重组载体可包含编码H5N1病毒表面上存在的血凝素(HA)的基因。通常，流感病毒在其表面上具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原。HA和NA是比较大的糖蛋白。HA为有助于病毒识别和穿透细胞表面的蛋白。NA为病毒在宿主细胞中增殖后有助于病毒脱离宿主细胞的蛋白。已知HA和NA为引起宿主细胞的免疫应答的蛋白。具体而言，HA蛋白具有凝集鸟的红细胞的能力并且已知为引起体内触发的大多数抗体反应的抗原。因此，在本发明中，为了从植物中产生针对H5N1病毒的疫苗，可将编码H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白的多核苷酸，优选具有SEQ ID NO :14的核苷酸序列的H5N1病毒的血凝素(HA)基因包含于用于植物转化的重组载体中。具有SEQ ID NO :14的核苷酸序列的多核苷酸编码包含H5N1型/香港/213/03病毒毒株的血凝素蛋白的一部分的多肽，其中该部分不包含HA蛋白的23个氨基酸。此外，用于植物转化的重组载体可包含编码纤维素结合域(CBD)的多核苷酸。包含于重组载体中的编码CBD的多核苷酸可为在本领域通常用于蛋白纯化的任何核苷酸序列，优选可具有SEQ ID NO 15的核苷酸序列。因此，依照本发明的用于植物转化的重组载体为包含由以下顺次组成的基因构建体的表达载体可提高异源蛋白的翻译效率的DNA片段、Bip基因序列、编码H5N1病毒的HA蛋白的多核苷酸、编码CBD的多核苷酸和编码HDEL肽的多核苷酸；并且所述基因构建体可与启动子可操作地连接。在本发明中，术语“表达载体”是指可通过本发明的DNA片段、基因构建体或多核苷酸的插入或掺入来操纵的质粒、病毒或本领域已知的其它载体。本发明的DNA片段、基因构建体或多核苷酸可与表达控制元件可操作地连接。所述可操作地连接的基因构建体和表达控制元件可一起包含于一个表达载体中，所述载体包含选择标记和复制起点。术语“可操作地连接的”可指以当合适的分子结合表达控制元件时允许基因表达的方式连接的基因和表达控制元件。术语“表达控制元件”是指控制特定的宿主细胞中可操作地连接的多核苷酸的表达的DNA片段。所述控制元件可包括用于进行转录的启动子、用于调节转录的任意操纵基因元件、合适的mRNA核糖体结合位点和用于控制转录和翻译终止的DNA片段。
只要其可在植物中表达插入的基因就可使用任何启动子，并无特别限制。启动子的实例包括但不限于CaMV的35S RNA和19SRNA启动子、来源于玄参花叶病毒(FMV)的全长转录启动子和TMV外壳蛋白的启动子。用于将本发明的DNA片段、基因构建体或多核苷酸掺入植物细胞的合适载体的实例包括Ti质粒、植物病毒载体等。合适载体的优选实例包括但不限于双质粒(binary vector)载体例如pCHF3、pPZP、pGA和pCAMBIA载体。本发明可使用任何载体，只要其可将本发明的所述多核苷酸引入植物细胞中。在本发明的一个实施方案中，如下制备用于H5N1病毒的抗原性血凝素的表达的重组载体用本发明人开发的载体(其可移动异源基因至植物的内质网以表达并保持，即韩国专利申请第2009-0081403号中公开的载体)，作为基础载体，通过用编码具有SEQ IDNO 14的核苷酸序列的H5N1病毒的血凝素蛋白的多核苷酸取代基础载体的异源基因；切割包含35S启动子和NOS终止子部分的区；和利用PstI和EcoRI限制性酶连接该区域至PBI121载体，该载体为用于植物转化的载体。依照本发明制备的载体中的由启动子、UTR序列、Bip序列、H5N1的HA序列、CBD序列和HDEL序列组成的基因构建体的质粒图谱示于图I中。韩国专利申请第2009-0081403号通过引用以其整体结合于本文中。因此，本发明可提供制备产生血凝素这种H5N1病毒的抗原性蛋白的转基因植物的方法，其包括将之前所述的用于植物转化的重组载体引入植物中的步骤。将本发明的重组载体引入植物的方法可为但不限于农杆菌介导的转化、粒子枪轰击、碳化硅晶须、超声处理、电穿孔和PEG(聚乙二醇)沉淀。在本发明的一个实施方案中，拟南芥通过农杆菌介导的转化用本发明的重组载体转化，通过该方法转化的拟南芥的照片在图3中示出。因此，本发明提供了通过本发明的方法制备的转基因植物，其中所述转基因植物产生H5N1病毒的抗原性血凝素蛋白。此外，因为H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白以高度有效的方式翻译并在植物的内质网中累积，所以用本发明的重组载体转化的植物，即可以高度有效的方式产生H5N1的血凝素的植物，可通过有性繁殖或无性繁殖(其为本领域的常规方法)获得。更特别地，本发明的植物可通过有性繁殖获得，有性繁殖是通过经由花的传粉产生的种子来繁殖植物的过程。此外，本发明的植物可通过利用本发明的重组载体转化植物获得，接着进行无性繁殖，其为包括以下的过程依照常规方法诱导愈伤组织、生根和适应土壤。换言之，将用本发明重组载体转化的植物的外植体转移至本领域已知的合适的培养基中，并培养以诱导愈伤组织的形成。当形成芽时，将其转移并培养于无激素的培养基中。约两周后，将芽转移至生根培养基中以诱导根。当诱导出根后，将其转移至土壤中并适应，接着可获得本发明的植物。在本发明中，所述转基因植物不仅可包括整株植物，而且还可包括自整株植物获得的组织、细胞和种子。在本发明中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。双子叶植物的实例可为但不限于拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、土豆、西红柿、中国白菜、大萝卜、卷心菜、莴苣、桃、梨、草莓、西瓜、甜瓜、黄瓜、胡萝卜和芹菜。单子叶植物的实例可为但不限于水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦和洋葱。同时，为了鉴定H5N1的血凝素蛋白是否位于用重组载体转化的植物的细胞内质网中，本发明人在一个实施方案中用细胞免疫染色检查并发现H5N1的血凝素蛋白存在于 植物的内质网中(图4)。 按照本发明的一个实施方案，为了鉴定转基因植物中表达的H5N1的血凝素蛋白是否以糖基化形式存在，本发明人从植物中提取蛋白并用内切糖苷酶H处理，该酶降解寡糖。因此，发现表达的H5N1的血凝素蛋白通过翻译后修饰糖基化(图5)。此外，本发明可提供一种从转化了本发明的重组载体的植物中产生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的方法。所述方法可包括栽培所述转基因植物并分离和纯化从植物中表达的蛋白，所述植物中引入了编码H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO :14的核苷酸序列。更具体地，从转基因植物中产生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的方法可通过以下完成将本发明的重组载体引入植物或用重组的表达载体转化植物细胞，接着栽培植物或植物细胞达合适的时间段以表达血凝素(HA)，并接着从转基因植物或植物细胞中获得血凝素(HA)。可使用表达蛋白的任何方法，只要其在本领域已知。转基因植物或植物细胞中高度表达的蛋白的收集可通过本领域已知的各种分离和纯化方法进行。一般而言，可进行细胞裂解物的离心，随后沉淀例如盐析沉淀(硫酸铵沉淀和磷酸钠沉淀)、溶剂沉淀(用丙酮、乙醇等进行的蛋白级分的沉淀)以移除细胞碎片等。可进行透析、电泳、各种柱层析等。可单独或联合应用离子交换层析、凝胶过滤层析、HPLC、反相HPLC、亲和柱层析、超滤等以纯化本发明的血凝素(HA)蛋白(Maniatis等 ，Molecular Cloning A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982) ；Sambrook等.,Molecular Cloning A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1989) ；Deutscher, M. , Guide to Protein Purification Methods Enzymology,第182 卷 Academic Press. Inc. , San Diego, CA(1990))。此外，在本发明中，为了容易并快速地从转基因植物中分离和纯化血凝素(HA)蛋白，可另外将编码纤维素的纤维素结合域(CBD)的多核苷酸(优选其具有SEQ ID N0:15的核苷酸序列)与前述的本发明重组载体可操作地连接。因此，植物中表达的H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白可呈与纤维素结合域(CBD)的融合形式。因此，使用用纤维素载体作柱的层析可容易地将其分离并纯化。
因此，本发明可提供具有抗原性的H5N1病毒的重组血凝素蛋白，其由以上方法产生。由该方法产生的重组HA蛋白可为针对H5N1病毒的疫苗蛋白。该蛋白可为融合蛋白，其中H5N1病毒的血凝素蛋白与纤维素结合域(CBD)融合。此外，本发明人研究了通过如上所述的本发明方法从植物中产生的H5N1血凝素融合蛋白是否真的作为抗原起作用并且是否可用于H5N1病毒疫苗。换言之，依照本发明的一个实施方案，将通过如上所述的本发明方法分离并纯化的H5N1病毒的抗原性血凝素蛋白肌内注射至小鼠模型，并接着收集血液。分离血清并用ELISA法研究抗原特异性抗体反应。对于对照组，用TIV (三价流感疫苗，H1N1+H3N2+B型HA蛋白)代替血凝素抗原性蛋白。因此，对照组所用TIV不能诱导H5N1-特异性抗体反应，但其中小鼠给予了本发明产生的H5N1的血凝素抗原性蛋白的实验组，具有免疫原性并诱导抗原特异性抗体反应(图8)。
从该结果，本发明人发现产生自植物的本发明H5N1病毒的血凝素蛋白，可在活体内诱导针对HA蛋白的抗体，其随后研究了 H5N1病毒的血凝素蛋白是否真的具有针对禽流感病毒的防御作用。依照本发明的一个实施方案，将注射了产生自植物的本发明H5N1病毒的血凝素蛋白或TIV(对照组)的小鼠用H5N2病毒感染，已知所述H5N2病毒比H5N1具有相对低的风险。检查体重的变化情况和生存率。在给予H5N1血凝素蛋白的组中，小鼠的体重减轻了，但随时间的推移并在15天后，恢复了初始体重的超过90%。然而，在给予TIV的组中，小鼠的体重持续减少(图8)。依据生存率的检测结果，给予TIV的组中，所有小鼠在第6-8天死亡。在给予H5N1血凝素蛋白的组中，一只小鼠在第7天死亡，另一只小鼠在第8天死亡，相比于对照组生存率为67% (图9)。因此，本发明人发现从本发明转基因植物中产生的H5N1病毒的血凝素蛋白不仅可诱导针对H5N1病毒的抗体形成，而且还可具有针对禽流感病毒的防御作用。如上所述，根据对小鼠的实验，本发明人发现通过本发明的方法从植物中产生的H5N1病毒的抗原性血凝素蛋白具有免疫原性并且可诱导抗原特异性抗体反应。基于该结果，本发明人发现本发明中产生的H5N1病毒的血凝素蛋白可用作可应用于包括小鼠和人在内的哺乳动物的疫苗。为了研究通过本发明的方法从植物中产生的H5N1病毒的血凝素蛋白是否可用作不仅可应用于哺乳动物而且还可应用于鸟和家禽的疫苗，本发明人在本发明的一个实施方案中将通过本发明的方法从植物中产生的H5N1病毒的抗原性血凝素蛋白给予鸡。分离血清样品并用ELISA法研究抗原特异性抗体反应。对于对照组，给予PBS缓冲液代替所述抗原性血凝素蛋白。因此，给予了 PBS缓冲液的鸡不能诱导H5N1-特异性抗体反应。但是，无论性别，给予了本发明产生的H5N1的抗原性血凝素蛋白的鸡具有免疫原性并诱导抗原特异性抗体反应(
图11)。因此，发现从本发明转基因植物中产生的H5N1病毒的血凝素蛋白可用作疫苗的生产，该疫苗不仅可应用于哺乳动物而且还可应用于包括鸡在内的鸟和家禽。因此，本发明可提供依照上述本发明的方法的转基因植物、产生自所述转基因植物的H5N1病毒的抗原性血凝素蛋白或包含含有所述转基因植物的蛋白提取物的针对H5N1病毒的疫苗组合物。本发明的疫苗组合物可通过包括以下的各种方式给予有需要的个体口服给药、经皮给药、皮下给药、静脉给药或肌肉给药。组合物的给药剂量可视不同因素例如给药途径、体重、个体年龄等合适地控制。本发明的组合物可与对H5N1病毒的感染具有预防或治疗作用的其它已知的化合物联合给药，并且还可包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形齐U。本发明的疫苗组合物可包含约100-约1000mg/L的H5N1病毒的血凝素蛋白作为活性成分并且给药剂量可为约50-500mg，但不限于此。可另外包含于所述疫苗组合物中的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。此外，可另外包含填充齐U、抗凝血剂、润滑齐U、湿润齐U、芳香齐U、乳化剂、防腐剂等。本发明的组合物可通过本领域已知的方法配制以在给予有需要的个体后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。所述制剂可为但不限于散剂、颗粒剂、片剂、乳剂、糖浆、气雾剂、软明胶胶囊或硬明胶胶囊、无菌注射液和无菌散剂。
本发明的疫苗组合物可给予的个体可包括可为H5N1病毒感染的对象的所有个体，例如哺乳动物，包括人、鸟、家畜、家禽等。此外，本发明的转基因植物可以其本身或通过研磨植物并将其加入动物饲料或饮用水中给予，因此，所述转基因植物可用于用于口服给药的疫苗。因此，本发明可提供本发明的转基因植物，从所述转基因植物中产生的H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白，或包含来自所述转基因植物的蛋白提取物的针对H5N1病毒的用于口服给药的疫苗组合物。当所述转基因植物用作用于口服给药的疫苗组合物时，有以下优点被动物病毒污染的可能性低；因为产生的H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白包含于植物中，长期储存和运输是切实可行的；和可明显减少注射接种的成本。由于有可能从本发明转基因植物中分离和纯化高致病性禽流感H5N1病毒的血凝素(HA)抗原性蛋白，所以本发明可提供用于H5N1病毒感染的诊断试剂。此外，本发明可提供一种H5N1病毒感染的诊断方法，所述方法通过使分离和纯化的H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白与家禽或哺乳动物的血清等反应来进行。此外，从本发明转基因植物中分离并纯化的H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白，具有与纤维素结合域(CBD)融合的融合蛋白的特征，其。因此，本发明人检查了当将通过本发明产生的H5N1病毒的血凝素(HA)抗原性蛋白给予小鼠时，是否形成针对血凝素蛋白融合的CBD蛋白的抗体。因此，发现当给予HA抗原性蛋白时，还形成了针对融合的CBD蛋白的抗体(
图10)。因此，基于该结果，通过检测从个体中获得的血清中针对H5N1病毒的血凝素(HA)的抗体和针对CBD蛋白的抗体的过程，本发明可诊断个体中形成的针对血凝素(HA)的抗体是因H5N1病毒的感染而形成还是因包含本发明H5N1病毒的血凝素(HA)的疫苗而形成。因此，本发明可提供一种诊断临床样本中的抗体是因H5N1病毒的感染而形成还是因疫苗给予而形成的方法，所述方法包括以下步骤(a)从临床样本中收集血液；(b)从收集的血液中分离血清；和(c)将针对血凝素(HA)的抗体和针对纤维素结合域(CBD)的抗体加至所分离的血清以反应。更特别地，血液样品从临床样本中收集，所述临床样本优选为具有被禽流感病毒感染的机会的对象，例如除鸟或人之外的所有类型的动物；血清样品用本领域常规使用的方法从血液中分离；并接着加入针对血凝素(HA)的抗体和针对纤维素结合域(CBD)的抗体以产生免疫反应。接着，通过检测针对血凝素(HA)的抗体和针对纤维素结合域(CBD)的抗体，所述诊断方法可诊断临床样本中形成的血凝素(HA)抗体是因H5N1病毒的感染而形成还是因包含本发明的H5N1病毒血凝素(HA)的疫苗而形成。在根据免疫反应的诊断中，若从临床样本中获得的血清中检测到针对血凝素的抗体和针对纤维素结合域(CBD)的抗体两者，则可确定H5N1病毒的HA抗体因本发明的疫苗给予形成。若仅从临床样本中获得的血清中检测到针对血凝素的抗体，则可确定H5N1病毒的HA抗体因H5N1病毒的感染形成。因此，本发明的诊断方法具有以下作用在给予本发明的疫苗或疫苗组合物后，可确定是否有效形成针对H5N1病毒的抗体；若接种针对禽流感的疫苗并通过该诊断方法诊断出针对H5N1病毒的HA抗体是因H5N1病毒的感染而形成，则可快速采取预防或治疗措 施，并且因此，可防止家禽的不必要毁灭并可减少经济损失；和可预防或治疗人的感染。因此，本发明中产生的呈与CBD融合形式的抗原性H5N1血凝素蛋白可用作标记疫苗。下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。但是，以下实施例仅出于阐述的目的提供，并且本发明的范围不应受其限于此。实施例I包含H5N1病毒的抗原性基因的用于植物转化的载体的制备为了产生包含HPAI (H5N1)病毒表面上的抗原性血凝素(HA)基因的用于植物转化的载体，本发明人使用了包含提高翻译效率的DNA片段的重组载体，该DNA片段提高了异源蛋白的翻译效率，所述载体由本发明人开发并描述于韩国专利申请第2009-0081403号。换言之，对于本发明所用的用于植物转化的重组载体，本发明人用PstI和EcoRI限制性酶将以下序列的区域连接至常规使用的载体PBI121载体，并制备用于植物转化的载体pBI121-35Sp-UTR35: Bip :H5N1 (HA) : CBD: HDEL: NOS，所述序列包含花椰菜花叶病毒35S启动子；提高异源蛋白的翻译效率的DNA片段，其为5’ UTR(5’非翻译区)并为在具有下表I中所示SEQ ID NO :1-12的核苷酸序列的多核苷酸之中的具有SEQ ID NO :6的核苷酸序列的多核苷酸；编码Bip (分子伴侣结合蛋白)的多核苷酸，其具有SEQ ID NO 13的核苷酸序列，其能够在植物细胞中使异源蛋白靶向内质网(ER);编码H5N1病毒的抗原性血凝素蛋白的多核苷酸，其具有SEQ ID NO: 14的核苷酸序列(其为HPAI (H5N1)A型/香港/213/03病毒毒株的部分血凝素蛋白，不含最后的23个氨基酸)；编码纤维素结合域(CBD)的多核苷酸序列，其具有SEQ ID N0:15的核苷酸序列；HDEL(HiS-ASp-Glu-Leu)肽，其为保留异源蛋白于内质网内的信号肽；以及包含35S终止子(NOS)的终止密码子。依照本发明制备的用于植物转化的载体中35Sp-UTR35: Bip: H5N1 (HA) : CBD: HDEL: NOS的基因构建体的图谱在图Ia中示出，该制备载体的质粒图谱在图Ib中示出。[表I]5’UTR 序列
权利要求
1.一种制备产生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的转基因植物的方法，所述方法包括将用于植物转化的载体引入植物中，其中所述载体包含由以下顺次组成的基因构建体⑴具有选自SEQ ID NO 1-12的核苷酸序列的DNA片段；(ii)具有SEQ ID NO 13的核苷酸序列的BiP(分子伴侣结合蛋白)基因；(iii)编码H5N1病毒的血凝素(HA)蛋白的多核苷酸，其具有SEQ ID NO : 14的核苷酸序列；(iv)编码纤维素结合域(CBD)的多核苷酸，其具有SEQ ID NO 15的核苷酸序列；和(V)编码HDEL (His-Asp-Glu-Leu)肽的多核苷酸，其中所述基因构建体与启动子可操作地连接。
2.权利要求I所述的方法，其中将用于植物转化的载体引入植物中的方法可为选自以下的任一种农杆菌介导的转化、粒子枪轰击、碳化硅晶须、超声处理、电穿孔和PEG(聚乙二醇)沉淀。
3.权利要求I所述的方法，其中所述植物可为选自以下的双子叶植物拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、土豆、西红柿、中国白菜、大萝卜、卷心菜、莴苣、桃、梨、草莓、西瓜、甜瓜、黄瓜、胡萝卜和芹菜；或选自以下的单子叶植物水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦和洋葱。
4.一种产生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的转基因植物，其通过权利要求1-3中任一项的方法制备。
5.一种自权利要求4的转基因植物产生H5N1病毒的抗原性血凝素(HA)蛋白的方法，其包括栽培所述转基因植物和从所述转基因植物中分离和纯化HA蛋白。
6.权利要求5所述的方法，其中H5N1的抗原性血凝素(HA)为与纤维素结合域(CBD)的融合形式。
7.一种针对H5N1病毒的疫苗蛋白，其通过权利要求5或权利要求6的方法产生。
8.权利要求7所述的疫苗蛋白，其中所述蛋白为纤维素结合域(CBD)融合的H5N1血凝素(HA)蛋白。
9.一种针对H5N1病毒的疫苗组合物，其包含权利要求5或权利要求6的转基因植物、自所述转基因植物产生的H5N1血凝素(HA)蛋白或所述转基因植物的蛋白提取物。
10.一种诊断临床样本中的抗体是因H5N1病毒的感染而形成还是因疫苗给予而形成的方法，其包括以下步骤(a)从临床样本中收集血液；(b)从收集的血液中分离血清；和(c)将针对血凝素(HA)的抗体和针对纤维素结合域(CBD)的抗体加至所分离的血清以反应。
11.权利要求10所述的方法，其中若在步骤(C)的反应中检测到针对血凝素(HA)的抗体和针对纤维素结合域(CBD)的抗体两者，则确定临床样本中的抗体因权利要求9的疫苗组合物的给予而形成；若仅检测到针对血凝素(HA)的抗体，则确定临床样本中的抗体因H5N1病毒的感染而形成。
全文摘要
本发明涉及一种利用植物转化重组载体产生转基因植物的方法，所述转基因植物涉及以高度有效的方式产生H5N1病毒的血凝素蛋白，其中所述载体可以高度有效的方式表达高致病性禽流感病毒H5N1病毒的血凝素蛋白，并且可将植物中表达的蛋白转运至内质网并能够使蛋白在内质网中保留以完成糖基化，该糖基化为抗原活性所必需。本发明还涉及一种从转基因植物中大量产生抗原性H5N1病毒的血凝素蛋白的方法，以及包含所述转基因植物或自所述植物产生的血凝素蛋白的用于禽流感病毒的疫苗组合物。用本发明的转基因植物产生H5N1病毒的血凝素蛋白的方法能够以低成本大量生产血凝素蛋白。本发明所用的植物转化重组载体具有插入其中的纤维素结合域以便以快速和容易的方式分离植物中表达的蛋白。此外，本发明的转基因植物可呈饲料添加剂等形式，因此可用作可食用疫苗。此外，通过所述方法产生的抗原性血凝素蛋白当给予动物模型时诱导免疫应答，因此不仅可用作H5N1禽流感病毒的蛋白疫苗，而且还可用作禽流感病毒感染的诊断试剂。
文档编号A01H1/00GK102770016SQ201080056346
公开日2012年11月7日 申请日期2010年10月6日 优先权日2009年10月6日
发明者任世镇, 全恩贤, 孙恩珠, 成永喆, 朴基硕, 权恩惠, 罗允贞, 黃仁焕 申请人:螺线有限公司