专利名称：甘露糖特异性凝集素前体中包含的信号肽、编码该信号肽的核酸、以及该信号肽和该核酸 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码具有杀昆虫作用且特异性识别甘露糖的凝集素的基因。具体地，本发明涉及薯蓣(山药(Dioscorea batatas))的甘露糖特异性凝集素的基因的信号肽、编码该信号肽的DNA、和利用它们控制昆虫害虫的方法。
背景技术：
凝集素是特异性地识别糖并与其可逆地结合的蛋白。它们见于宽范围的生物物种，诸如动物、植物、真菌和细菌。还已经研究了凝集素的生理活性。例如，已经研究凝集素与血型、癌细胞、淋巴细胞有丝分裂发生、病毒和细胞毒性有关(非专利文献I)。此外，已经报道了通过向植物引入编码具有针对昆虫害虫的杀昆虫活性的芽孢杆菌属(Bacillus)菌株的凝集素的基因来产生具有增强的抗昆虫性的重组植物的技术(专利文献I)。已知植物来源的凝集素有效地用于昆虫害虫控制。称为甘露糖结合凝集素的GNA从观叶植物诸如雪滴花(雪花莲(Galanthus nivalis))的花球克隆，用于经由引入基因到马铃薯、番茄、稻等等来产生重组植物。已知这些植物具有抗昆虫性(非专利文献2和3)。例如，在植物来源的凝集素的情形，已经报道了编码来自薯蓣的甘露糖特异性凝集素DBl蛋白的总氨基酸序列的DNA序列(专利文献2)。已经报道，这一 DNA序列编码成熟蛋白的总氨基酸序列，且将此前报道的编码DBl基因的DNA序列引入烟草(非专利文献4)。此外，已经报道，将此前报道的编码DBl基因的DNA序列引入稻(非专利文献5和6)。DBl蛋白是贮藏蛋白。因此，预测从mRNA翻译的DBl蛋白前体包括易位信号。然而，这样的易位信号的DNA序列仍未有报道。引用列表专利文献专利文献I JP 专利公布(Kohyo)No. 10-506532A (1998)专利文献2 W02006/030638非专利文献非专利文献I :Lectin, Toshiaki Osawa 和 Ryoich Mori (编著)，KodanshaScientific Ltd.非专利文献2 :Fitches 等，Effect of snowdrop lectin (GNA) delivered viaartificial diet and transgenic plants on the development tomato moth (Lacanobiaoleracea)larvae in laboratory and glasshouse trials, Journal of InsectPhysiology,43(8)，727-739(1997) ·非专利文献3 :Rao 等，Expression of snowdrop lectin (GNA) in transgenicrice plants confers resistance to rice brown planthopper, The Plant Journal,15(4) ,469-477(1998).
非专利文献4 :Tetsuya Kato 等，lBa-01 !Production of transformed tobaccocontaining accumulated yam tuber lectin DBl and evaluation of aphid resistance,日本植物细胞和分子生物学学会第26次年会(大阪研讨会)的报告摘要，p. 64.非专利文献5 :Tetsuya Kato 等，701 !Production of transformed crop withyam tuber lectin DBl and evaluation of insect pest resistance of the crop,日本育种学会第114次会议的报告摘要,第10卷，separate issue 2,2008年10月，ρ· 193.非专利文献6 Tetsuya Kato 等，P144 Production of transgenic riceexpressing yam tuber lectin (DBl) to confer sap-sucking insect—resistance，稻功倉泛基因组学计划的第6次国际研讨会和摘要，p. 285。发明概述技术问题通过克隆编码最初包含在来自薯蓣(山药)(其已经长期用作食物)块茎的DBl基因中的易位信号的区并阐释该区的DNA序列和氨基酸序列，本发明的一个目的是提供一种新型信号肽；和能够利用所述信号肽有效地积累期望蛋白的技术。本发明的另一目的是提供通过利用以上信号肽引起DBl蛋白在转基因植物中的高效积累而具有极佳的昆虫害虫抗性的转基因植物。问题的解决方案作为深入研究的结果，本发明人重新检查了此前报道的薯蓣块茎凝集素(DBl)基因的序列，确定了其新的基因序列，从而发现了编码DBl蛋白前体中包含的信号肽的核酸的存在并确定了其序列。因此，本发明人发现，通过将已向其加入新确定的编码信号肽的区的基因引入不同类型的植物，从而引起DBl蛋白在该植物中的高效积累，可产生被赋予抗昆虫活性或具有增强的抗昆虫活性的转基因植物。这导致完成本发明。具体地，本发明涵盖以下。(I) 一种核酸，所述核酸编码包括SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列或相对于SEQID NO :2所示的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸的缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的肽。(2)根据⑴的核酸，其中所述肽是信号肽。(3)根据(2)的核酸，其中所述信号肽是内质网易位信号肽。(4) 一种基因，所述基因包括根据(I)至(3)任一项的核酸和位于所述核酸下游、编码蛋白成熟区的核酸。(5)根据(4)的基因，其中所述蛋白成熟区是薯蓣(山药)的甘露糖特异性凝集素的成熟区。(6) 一种表达载体,其中根据⑷或(5)的基因位于可在植物中表达的启动子的下游。(7) 一种转化的植物，所述转化的植物包含根据⑷或(5)的基因作为外来基因。(8)根据(7)的转化的植物，所述转化的植物被赋予抗昆虫活性或具有增强的抗昆虫活性。(9)根据(7)的转化的植物，所述转化的植物是禾本科(Poaceae)的植物。(10)根据(7)的转化的植物，所述转化的植物是稻。
(11) 一种赋予或增强抗昆虫活性的方法，所述方法包括向目标植物引入根据(4)或(5)的基因作为外来基因的步骤。(12)根据(11)的方法，其中所述目标植物是禾本科的植物。(13)根据(11)的方法，其中所述目标植物是稻。本说明书包括日本专利申请号2009-237432的说明书和/或附图
中公开的部分或所有内容，其是本申请的优先权文件。发明的有益效果根据本发明，可提供一种新型信号肽和 编码该信号肽的核酸。使用该信号肽或编码本发明的信号肽的核酸使得能够在植物中有效积累期望蛋白。此外，由于使用该信号肽或编码本发明的信号肽的核酸使得能够有效积累DBl蛋白，对植物赋予抗昆虫活性或改进植物的抗昆虫活性变得可能。附图简述图I显示实施例中使用的质粒的产生过程的流程图。图2显示实施例中使用的质粒的产生过程的流程图。图3显示实施例中使用的质粒的产生过程的流程图。实施方式的描述本发明在以下详细描述。新型信号肽本发明的信号肽是包括薯蓣(山药)块茎衍生的DBl蛋白前体的23个氨基酸残基的肽。编码本发明的信号肽的核酸的核苷酸序列和信号肽的氨基酸序列分别显示在SEQID NO 1 和 2。此外，本发明的信号肽不限于包括SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的肽。例如，其包括包含相对于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、添加或插入的氨基酸序列并作为信号肽起作用的肽。本文所用的短语“多个氨基酸残基”是指例如2至5个氨基酸残基、优选地2至3个氨基酸残基、最优选地2个氨基酸残基。任何常规已知的方法可用于证实相对于SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、添加或插入的氨基酸序列是否能够作为信号肽起作用。例如，这样的方法包括诱导其中目标氨基酸序列位于上游区的蛋白表达，并检测内质网部分中包含的蛋白。如果目标氨基酸序列能够作为信号肽起作用，则内质网部分中可明显检测到蛋白。另外，本发明的信号肽作为所谓的内质网信号肽起作用。内质网信号肽是被信号识别颗粒(SRP)识别的肽。结合于被核糖体翻译的内质网信号肽的SRP结合内质网表面上的SRP受体。SRP从内质网上的内质网信号肽解离。之后，内质网信号肽被肽酶裂解，促进随后的翻译。从而合成成熟蛋白。此外，本发明的信号肽可以是作为信号肽起作用并包括与SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列具有例如75%或更大、优选地85%或更大、更优选地90%或更大、最优选地95%或更大的相似性的氨基酸序列的肽。这里，相似性值是指利用实施BLAST(基本局部比对搜索工具)算法的计算机程序基于默认设定可计算的值。另外，本发明的信号肽不限于由包括SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的核酸编码的肽。其可以是能够作为信号肽起作用、由在严格条件下与包括SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的核酸的互补序列杂交的核酸编码的肽。这里，术语"严格条件"是指形成特异性杂合体但决不形成非特异性杂合体的条件。例如，这样的条件包括在45°C以6 X SSC (氯化钠/柠檬酸钠)杂交，随后在50°C至65°C以O. 2至IXSSC和O. 1% SDS洗涤。可选地，这样的条件包括在65°C至70°C以I X SSC杂交，随后在65°C至70°C以O. 3 X SSC洗涤。杂交可通过常规已知方法进行，诸如 J. Sambrook 等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Har`bor Laboratory (1989)中所述的方法。本发明的信号肽偶联于期望蛋白的N-端侧，允许在植物中高度积累该蛋白。此夕卜，当蛋白在植物中表达时，表达蛋白与信号肽的融合蛋白前体，随后信号肽区被信号肽酶从其裂解。从而，蛋白形成为成熟蛋白。通过常规已知的技术将编码包括信号肽的蛋白前体的核酸掺入表达载体，将如此获得的表达载体引入植物。这使得能够在植物中积累蛋白前体。表达载体构建为包括可在植物中表达的启动子和编码以上前体的核酸。作为用作表达载体的基础的载体，可使用多种常规已知的载体。例如，可使用质粒、噬菌体、粘粒或类似物，这样的载体可根据将引入的植物细胞和引入方法适当地选择。这样的载体的具体实例包括 pBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、pBluescriptSK 和 pBI 载体。尤其是当向植物引入载体的方法使用农杆菌(Agrobacterium)时,优选地使用pBI双元载体。pBI双元载体的具体实例包括pBIG、pBIN19、pBI101和pBI121。本文所用的启动子不具体地限制，只要其能够导致编码以上前体的核酸在植物中表达。可适当地使用任何已知启动子。作为启动子，尤其优选地使用可在植物中导致下游基因组成型表达的组成型表达的启动子。这样的启动子的实例包括花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、各种肌动蛋白基因启动子、各种泛素基因启动子、胭脂碱合酶基因启动子、烟草PRla基因启动子、番茄核酮糖1，5_ 二磷酸羧化酶 加氧酶小亚基基因启动子、和油菜籽蛋白基因启动子。其中，可更优选地使用花椰菜花叶病毒35S启动子、肌动蛋白基因启动子或泛素基因启动子。使用选自以上启动子的适当启动子使得能够在向植物细胞引入基因后强表达期望基因。此外，可使用作用以导致在植物中位点特异性基因表达的启动子。任何常规已知的启动子可用作这样的启动子。使用这样的启动子允许位点特异性表达以上前体。此外，除了启动子和编码以上前体的核酸以外，表达载体还可包含其他DNA区段。这样的其他DNA区段不受具体限制，其实例包括终止子、筛选标记、增强子、和用于增强翻译效率的核苷酸序列。而且，以上表达载体还可具有T-DNA区。T-DNA区可增强基因引入的效率，尤其是当利用农杆菌将以上重组表达载体引入植物时。转录终止子不受具体限制，只要其作为转录终止位点起作用，并可以是任何已知转录终止子。例如，具体地，可优选地使用胭脂碱合酶基因的转录终止区(Nos终止子)、花椰菜花叶病毒35S的转录终止区(CaMV35S终止子)、或类似物。其中，可更优选地使用Nos终止子。在以上表达载体的情形，通过在适当位置布置转录终止子，可阻止使得在表达载体引入植物细胞后合成不必要地长的转录子的现象。作为转化体筛选标记，可使用药物抗性基因或类似物。这样的药物抗性基因的具体实例包括针对潮霉素、博来霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素、等等的药物抗性基因。通过选择能够在含有以上抗生素的培养基中生长的植物，可容易地筛选转化的植物。此外，赋予对特定药物的抗性的突变乙酰乳酸合酶基因可用作用于转化体筛选的标记。而且，用于构建表达载体的方法不受具体限制。以上描述的启动子、编码前体的核酸、和如果必要的其他DNA区段可以预定顺序引入用作基础的适当选择的载体。例如，连接以上描述的编码前体的核酸和启动子(如，根据需要的转录终止子)以构建表达盒，随后可将该盒引入载体。例如，构建表达盒时，准备DNA区段的裂解位点以具有彼此互补的凸出端，随后以连接酶进行反应，使得指定DNA区段的顺序成为可能。此外，当表达盒包含终止子时，可以从上游的以下顺序布置DNA区段启动子、编码前体的核酸和终止子。而且，用于构建表达载体的试剂的类型(即，限制性内切酶、连接酶、等等)也不受具体限制。因此，可适当地选择和使用可购买获得的试剂。而且，用于以上表达载体的复制方法(产生方法)不受具体限制，在本文可使用常规已知的复制方法。一般，这样的表达载体可在作为宿主的大肠杆菌 (Escherichia coli)中复制。此时，可根据载体类型选择大肠杆菌的优选类型。通过常规转化方法将以上表达载体弓I入目标植物。用于将表达载体弓I入植物细胞的方法(转化方法)不受具体限制。根据植物细胞，可使用常规已知的适当引入方法。具体地，例如，可使用利用农杆菌的方法或包括直接引入植物细胞的方法。作为向植物细胞直接引入表达载体的方法，可采用微注射、电穿孔、聚乙二醇方法、基因枪方法(particle gunmethod)、原生质体融合、磷酸钙方法、或类似方法。而且，当采用向植物细胞直接引入DNA的方法时，本文可用的DNA包含靶基因表达所需的转录元件，诸如启动子和转录终止子、以及靶基因。在这种情形中，载体功能不是关键。而且，本文可使用含有仅靶基因的蛋白编码区、不具有转录单位的DNA，只要其被整合到宿主的转录单位中，随后可表达靶基因。引入以上表达载体或不含表达载体但含靶基因的表达盒的植物细胞的实例包括植物器官的每种组织的细胞，诸如花、叶和根、愈伤组织、以及悬浮培养的细胞。此时，可根据待产生的植物类型构建适当的表达载体，或可预先构建通用表达载体，然后引入植物细胞。
_5] 赋予的或增强的抗昆虫活性在本发明中，利用本发明的前述信号肽在植物中表达编码薯蓣(山药)的甘露糖特异性凝集素的成熟区的基因。如此，可对植物赋予抗昆虫活性或改进植物的抗昆虫活性。编码薯蓣(山药)的甘露糖特异性凝集素的成熟区的核酸的核苷酸序列和成熟区的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO :3和4。此外，本发明的甘露糖特异性凝集素的成熟区不限于包括SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的区。例如，其包括具有特异性结合甘露糖的活性并包含相对于SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、添加或插入的氨基酸序列的区。这里，短语“多个氨基酸残基”是指例如2至30个氨基酸残基、优选地2至15个氨基酸残基、最优选地2至10个氣基酸残基。任何常规已知的方法可用于证实相对于SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、添加或插入的氨基酸序列是否能够作为甘露糖特异性凝集素起作用。例如，甘露糖特异性结合活性可通过研究包含目标氨基酸序列的蛋白结合甘露糖的活性来评价。此外，本发明的甘露糖特异性凝集素的成熟区可以是具有特异性结合甘露糖的活性并包括与SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列具有例如75%或更大、优选地85%或更大、更优选地90%或更大、最优选地95%或更大的相似性的氨基酸序列的区。这里，相似性值是指利用实施BLAST(基本局部比对搜索工具)算法的计算机程序基于默认设定可计算的值。另外，本发明的甘露糖特异性凝集素的成熟区不限于由包括SEQ IDNO 3所示的核苷酸序列的核酸编码的区。其可以是具有特异性结合甘露糖的活性、由在严格条件下与包括SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的核酸的互补序列杂交的核酸编码的区。这里，术语"严格条件"是指形成特异性杂合体但决不形成非特异性杂合体的条件。例如，这样的条件包括在45°C以6 X SSC (氯化钠/柠檬酸钠)杂交，随后在50°C至65°C以O. 2至I X SSC和0.1% SDS洗涤。可选地，这样的条件包括在65°C至70°C以1父35(杂 交，随后在651至70°C以O. 3X SSC洗漆。杂交可通过常规已知方法进行,诸如J. Sambrook等,MolecularCloning,A Laboratory Manual,第 2 版，ColdSpring Harbor Laboratory (1989)中所述的方法。 对其赋予抗昆虫活性或改进其抗昆虫活性的目标植物；即，利用以上信号肽在其中引起甘露糖特异性凝集素积累的植物，不受具体限制。具体地，通过利用信号肽导致甘露糖特异性凝集素表达，可对任何植物赋予抗昆虫活性或改进其抗昆虫活性。这样的植物的实例包括但不限于，双子叶植物和单子叶植物，诸如属于禾本科(颖花科(Gramineae))或十字花科(Brassicaceae)的植物。属于禾本科的植物的实例包括玉蜀黍(Zea mays)、稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦(Triticum aestivum)、竹(刚竹属(Phyllostachys))、甘鹿(Saccharum officinarum)、象草(Pennisetum pupureum)、鹿茅属(erianthus)(沙生鹿茅(Erianthus ravenae))、芒属(miscanthus)(日本银草)(Miscanthus virgatum)、高粱、和柳枝稷(黍属(Panicum))。属于十字花科的植物的实例包括拟南芥(Arabidopsisthaliana)、芸苔属植物(蔓菁(Brassica rapa)、欧洲油菜(Brassica napus)、和油菜(Brassica campestris))、甘蓝(Brassica oleracea var. capitata) > 中国大白菜(Brassica rapa var. pekinensis)、青梗菜(Brassica rapa var. chinensis)、完善(Brassica rapa var. rapa)、叶用完善(Brassica rapa var. hakabura)、雪里蓮(Brassicarapa var. lancinifolia)、芸笞(Brassica rapa var. peruviridis)、青菜(Brassica rapavar. chinensis)、萝卜(Raphanus sativus)、和山葵(ffasabia japonica)。本文所用的术语“抗昆虫活性”是指尤其是针对刺吸昆虫害虫的杀昆虫活性或驱昆虫活性。刺吸昆虫害虫的实例包括但不具体限于属于半翅目(Hemiptera)的以下昆虫害虫蝶科(Cicadidae)的Mogannia minuta ;尖胸沫蝶科(Aphrophoridae)的柳沫虫单(Aphrophora intermedia);角蝶科(Membracidae)的西伯利亚脊角蝶(Machaerotypussibiricus);大叶蝶科(Cicadellidae)的葡萄阿小叶蝶(Arboridia apicalis)、大贯小绿叶蝶(Empoasca onukii)、黑尾叶虫单(Nephotettix cincticeps)、和电光叶虫单(Reciliadorsalis);菱腊蝶科(Cixiidae)的端斑五胸脊菱腊蝶(Pentastiridius apicalis);飞風科(Delphacidae)的灰飞風(Laodelphax striatellus)、褐飞風(Nilaparvata Iugens)、和白背飞風(Sogatella furcifera);粒脉腊 单科(Meenoplidae)的 Nisia nervosa ；袖錯蜂科(Derbidae)的 Kamendaka saccharivora ;颖錯蜂科(Achilidae)的 Achilusflammeus ;广翅錯蜂科(Ricaniidae)的 Orosanga japonicus ;蛾錯蜂科(Flatidae)的蛾錯蜂(Mimophantia maritima);木風科(Psyllidae)的梨木風(Cacopsyllapyrisuga) 木風科(Calophyidae)的芒果_木風(Calophya mangiferae);根瘤虫牙科(Phylloxerdae)的葡萄根瘤虫牙(Daktulosphaira vitifoliae);球虫牙科(Adelgidae)的落叶松球虫牙(Adelges Iaricis)和铁杉球虫牙(Adelges tsugae);虫牙科(Aphididae)的豌豆虫牙(Acyrthosiphon pisum)、棉姆(Aphis gossypii)、绣线菊姆(Aphis spiraecola)、萝卜虫牙(Lipaphis erysimi)、相匕虫牙(Myzus persicae)、麦二叉虫牙(Schizaphis graminum)、矛口禾谷纟益管姆(Rhopalosiphum padi);粉風科(Aleyrodidae)的黑剌粉風(Aleurocanthusspiniferus)、烟粉風(Bemisia tabaci)、银叶粉風(Bemisia argentifolii)、和温室白粉風(Trialeurodes vaporariorum);绵阶科(Margarodidae)的草履阶(Drosichacorpulenta)和吹绵阶(Icerya purchasi);粉阶科(Pseudococcidae)的菠萝粉阶(Dysmicoccus brevipes)、柑桔粉阶(Planococcus citri)、和康氏粉阶(Pseudococcuscomstocki);阶科(Coccidae)的角錯阶(Ceroplastes ceriferus);仁阶科(Aclerdidae)`的高桥仁阶(Aclerda takahashii);盾阶科(Diaspididae)的红圆阶(Aonidiellaaurantii)、梨枝圆盾阶(Diaspidiotus perniciosus)、和矢尖阶(Unaspis yanonensis)；盲鋳科(Miridae)的显荚草盲鋳(Lygus hesperus)和赤须盲鋳(Trigonotyluscaelestialium);网鋳科(Tingidae)的杜鹽冠网鋳(Stephanitis pyrioides)和梨冠网虫舂(Stephanitis nashi);鋳科(Pentatomidae)的北二星鋳(Eysarcoris aeneus)、稻褐虫舂(Lagynotomus elongatus)、稻绿鋳(Nezara viridula)、和朱绿鋳(Plautia crossota)；圆鋳科(Plataspidae)的筛显龟鋳(Megacopta cribraria);长鋳总科(Lygaeoidea)的甘鹿异背长鋳(Cavelerius saccharivorus) ；Maicidae 的日本束长鋳(Malcusjaponicus);红鋳科(Pyrrhocoridae)的棉红椿(Dysdercus cingulatus);蛛缘鋳科(Alydidae)的大稻缘鋳(Leptocorisa acuta)和华稻缘鋳(Leptocorisa chinensis)；缘鋳科(Coreidae)的 Anacanthocoris striicornis ;姬缘鋳科(Rhopalidae)的黄伊缘虫舂(Rhopalus maculatus);以及臭虫科(Cimicidae)的温带臭虫(Cimex Iectularis)。此外，剌吸昆虫害虫的实例包括但不具体限于属于缨翅目(Thysanoptera)的以下昆虫害虫蓟马科(Thripidae)的花蓟马(Frankliniella intonsa)、西花蓟马(Frankliniellaoccidentalis)、正荼黄蓟马(Scirtothrips dorsalis)、掠榈蓟马(Thrips palmi)、和烟蓟马(Thrips tabaci)；以及管蓟马科(Phlaeothripidae)的 Ponticulothripsdiospyrosi和稻简管蓟马(Haplothrips aculeatus)。另外，剌吸昆虫害虫的实例包括但不具体限于以下植物寄生螨类真足螨科(Eupodidae)的麦圆叶爪螨(Penthaleusmajor);跑线螨科(Tarsonemidae)的樓草植食螨(Phytonemus pallidus)和侧多食跑■线螨(Polyphagotarsonemus Iatus);蒲螨科(Pyemotidae)的蒲螨(正穗螨属(Siteroptessp.));细须螨科(Tenuipalpidae)的刘氏短须螨(Brevipalpus Iewisi);杜克螨科(Tuckerellidae)的 Tuckerella pavoniformis ；叶螨科(Tetranychidae)的北始叶螨(Eotetranychus boreus)、桔全爪螨(Panonychus citri)、苹果全爪螨(Panonychusulmi)、二斑叶螨(Tetranychus urticae)、和神泽叶螨(Tetranychus kanzawai)；Phytopidae的松三毛瘦螨(Trisetacus pini);瘦螨科(Eriophyidae)的皮氏剌皮瘦螨(Aculops pelekassi)、梨上瘦螨(Epitrimerus pyri)、和柑桔镑螨(Phyllocoptrutaoleivora);羽爪瘦螨科(Diptilomiopidae)的冻绿双羽爪瘦螨(Diptacus crenatae)；以及螨科(Acaridae)的椭圆食粉螨(Aleuroglyphus ovatus)、腐食酪螨(Tyrophagusputrescentiae)、和罗宾根螨(Rhizoglyphus robini)。此外,抗昆虫活性可通过允许植物与雌性成虫接触某一时间段并检查生长的下一代幼虫的数目来评价。此外，其可通过允许幼虫与植物接触并确定生长为成虫的比例来评价。这里，术语“赋予的抗昆虫活性”是指由于使用以上信号肽积累甘露糖特异性凝集素而对野生型植物(不具有抗昆虫活性)赋予的抗昆虫活性。术语“增强的抗昆虫活性”是指已经利用以上信号肽诱导甘露糖特异性凝集素积累的重组植物的抗昆虫活性，其显著大于原始野生型植物的抗昆虫活性。具体地，在本发明中，使用本发明的信号肽在作为有用作物的稻中表达编码薯蓣(山药)的甘露糖特异性凝集素的成熟区的基因，诱导该基因在稻中积累。从而，可对稻赋予抗昆虫活性。
实施例本发明参考以下实施例更详细地在以下描述，但本发明的技术范围不限于这些实施例。(I)薯蓣凝集素DBl基因的核苷酸测序利用Concert植物RNA试剂(Invitrogen)按照制造商的实验方案从薯菌块莖提取总RNA。随后,利用Micro-FAST Track mRNA分离试剂盒(Invitrogen)按照制造商的实验方案纯化聚(A)+RNA。利用Marathon cDNA 扩增试剂盒(BD Biosciences Clontech)合成已在 5’ 端加入Marathon cDNA接头的cDNA。使用该cDNA作为模板和与此前报道的DBl (DDBJ登录号AB178475)序列互补的一组以下引物，在表I和表2所列的条件下进行PCR XB/DB1F(5/ -TCTAGAGGATCCATGGCCGATTTCATACTT~3/ (SEQ ID NO :5) (Xba I 和 Bam HI 识别位点加下划线))JPS/DBIRC -GAGCTCTCACTTGTTGACGACC-3' (SEQ ID NO :6) (Sac I 识别位点加下划线))。如此，确定PCR产物的核苷酸序列。所获得的DNA序列显示在SEQ ID NO :3。进一步，将PCR产物TA克隆到pGEM-T载体(Invitrogen)中。利用QIAprep Spin微量制备试剂盒(QIAGEN)从包括掺入有此前报道的DB1(DDBJ登录号AB178475)基因的质粒的大肠杆菌菌落分离质粒I。图I显示以上方案的概述。[表 I]PCR反应条件
权利要求
1.一种核酸，所述核酸编码由SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸的缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列组成的肽
2.如权利要求I所述的核酸，其中所述肽是信号肽。
3.如权利要求2所述的核酸，其中所述信号肽是内质网易位信号肽。
4.一种基因，所述基因包括根据权利要求I至3任一项的核酸和位于所述核酸下游、编码蛋白成熟区的核酸。
5.如权利要求4所述的基因，其中所述蛋白成熟区是薯蓣(山药(Dioscoreabatatas))的甘露糖特异性凝集素的成熟区。
6.—种表达载体,其中根据权利要求4或5的基因位于可在植物中表达的启动子的下游。
7.一种转化的植物，所述转化的植物包含根据权利要求4或5的基因作为外来基因。
8.如权利要求7所述的转化的植物，所述转化的植物被赋予抗昆虫活性或具有增强的抗昆虫活性。
9.如权利要求7所述的转化的植物,所述转化的植物是禾本科(Poaceae)的植物。
10.如权利要求7所述的转化的植物，所述转化的植物是稻。
11.一种赋予或增强抗昆虫活性的方法，所述方法包括向目标植物引入根据权利要求4或5的基因作为外来基因的步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述目标植物是禾本科的植物。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述目标植物是稻。
全文摘要
本发明的一个目的是提供新型信号肽以及利用所述信号肽有效地积累期望蛋白的技术。还提供编码包括SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸的缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的肽的核酸。
文档编号A01H1/00GK102959079SQ20108005610
公开日2013年3月6日 申请日期2010年10月14日 优先权日2009年10月14日
发明者小松正明, 角康一郎, 鸟山钦哉, 小川智久, 村本光二, 堀雅敏, 加藤哲也 申请人:组合化学工业株式会社, 国立大学法人东北大学