一种细胞支架聚集酶及其制备方法和应用与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种细胞支架聚集酶及其制备方法和应用。
背景技术：
：赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用，在饲料添加剂、食品强化剂和制药有着广泛的应用。现有技术中，l-赖氨酸的生产方法主要有四种，分别是提取法、化学合成法、酶法和微生物发酵法，前三种方法由于前体物成本高、工艺复杂等缺点，难以达到工业化生产的目的，生物发酵法为制备l-赖氨酸是当前的主要生产方式。目前生产l-赖氨酸的常用菌株包括大肠杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌，具体发酵法为：先使用大肠杆菌的赖氨酸缺陷性菌株发酵培养产生大量二氨基庚二酸，然后在选用二氨基庚二酸脱羧酶的产气杆菌或大肠杆菌，进行酶法脱羧生成l-赖氨酸。但是，利用上述发酵过程获得l-赖氨酸的产酸水平和转化率较低，无法满足现有产业对l-赖氨酸的需求。技术实现要素：针对现有技术中存在发酵过程获得l-赖氨酸的产酸水平和转化率较低，无法满足现有产业对l-赖氨酸的需求的技术问题，本发明所提供的技术方案是：一种细胞支架聚集酶，所述细胞支架聚合酶由以下方法制得，具体包括：以大肠杆菌基因为模板，在预先设定的扩增体系中进行pcr扩增，获得壳蛋白基因、两个互补的螺旋肽基因和天冬氨酸激酶基因；将所述壳蛋白基因和两个互补的螺旋肽基因通过重叠pcr方法进行扩增，获得细胞支架基因；将所述细胞支架基因和质粒载体通过酶切、连接反应获得细胞支架基因重组载体；将所述细胞支架基因重组载体和天冬氨酸激酶基因通过酶切、连接反应获得细胞支架聚合酶基因重组载体；将所述细胞支架聚合酶基因重组载体通过热激法转化至大肠杆菌感受态细胞中，并进行阳性筛选获得大肠杆菌工程菌；培养所述大肠杆菌工程菌并通过提取法获得细胞支架聚合酶。一种细胞支架聚合酶的制备方法，包括如下步骤：以大肠杆菌基因为模板，在预先设定的扩增体系中进行pcr扩增，获得壳蛋白基因、两个互补的螺旋肽基因和天冬氨酸激酶基因；将所述壳蛋白基因和两个互补的螺旋肽基因通过重叠pcr方法进行扩增，获得细胞支架基因；将所述细胞支架基因和质粒载体通过酶切、连接反应获得细胞支架基因重组载体；将所述细胞支架基因重组载体和天冬氨酸激酶基因通过酶切、连接反应获得细胞支架聚合酶基因重组载体；将所述细胞支架聚合酶基因重组载体通过热激法转化至大肠杆菌感受态细胞中，并进行阳性筛选获得大肠杆菌工程菌；培养所述大肠杆菌工程菌并通过提取法获得细胞支架聚合酶。所述的细胞支架聚集酶制备方法获得的大肠杆菌工程菌在提高赖氨酸产率的应用。有益效果：本发明通过基因改造，获得了一种细胞支架聚合酶基因，通过扩增技术对该基因进行扩增，构建了含有该基因的重组载体，并通过热激法转化至大肠杆菌感受态细胞中获得大肠杆菌工程菌，该细胞支架能够充满整个细胞质，能够改善大肠杆菌的代谢过程，能够显著提高产物中赖氨酸的浓度，提高糖酸转化率。附图说明图1为赖氨酸含量-诱导时间图。具体实施方式为了更加清楚阐述本发明的技术内容，在此结合具体实施例予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，本领域的技术人员可以根据所公开的技术内容显而易见地得出的其他技术方案仍属于本发明的保护范围。本发明实施例提供了一种细胞支架聚集酶，所述细胞支架聚合酶由以下方法制得，具体包括：以大肠杆菌基因为模板，在预先设定的扩增体系中进行pcr扩增，获得壳蛋白基因、两个互补的螺旋肽基因和天冬氨酸激酶基因；将所述壳蛋白基因和两个互补的螺旋肽基因通过重叠pcr方法进行扩增，获得细胞支架基因；将所述细胞支架基因和质粒载体通过酶切、连接反应获得细胞支架基因重组载体；将所述细胞支架基因重组载体和天冬氨酸激酶基因通过酶切、连接反应获得细胞支架聚合酶基因重组载体；将所述细胞支架聚合酶基因重组载体通过热激法转化至大肠杆菌感受态细胞中，并进行阳性筛选获得大肠杆菌工程菌；培养所述大肠杆菌工程菌并通过提取法获得细胞支架聚合酶。本发明实施例提供了一种细胞支架聚合酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以大肠杆菌基因为模板，在预先设定的扩增体系中进行pcr扩增，获得壳蛋白基因、两个互补的螺旋肽基因和天冬氨酸激酶基因；将所述壳蛋白基因和两个互补的螺旋肽基因通过重叠pcr方法进行扩增，获得细胞支架基因；将所述细胞支架基因和质粒载体通过酶切、连接反应获得细胞支架基因重组载体；将所述细胞支架基因重组载体和天冬氨酸激酶基因通过酶切、连接反应获得细胞支架聚合酶基因重组载体；将所述细胞支架聚合酶基因重组载体通过热激法转化至大肠杆菌感受态细胞中，并进行阳性筛选获得大肠杆菌工程菌；培养所述大肠杆菌工程菌并通过提取法获得细胞支架聚合酶。其中所述获得壳蛋白基因、两个互补的螺旋肽基因和天冬氨酸激酶基因的扩增引物的基因序列分别为：seqidno.1和seqidno2、seqidno.3和seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8。其中所述将所述壳蛋白基因和两个互补的螺旋肽基因通过重叠pcr方法进行扩增，获得细胞支架基因的步骤具体包括：将所述壳蛋白基因和两个互补的螺旋肽基因中的任意一个基因基因ⅰ中引入酶切位点，并进行扩增，获得组合基因ⅰ；将所属组合基因ⅰ和两个互补的螺旋肽基因除基因ⅰ外的基因ⅱ引入酶切位点，并进行扩增，获得细胞支架基因。其中所述将所述细胞支架基因和质粒载体通过酶切、连接反应获得细胞支架基因重组载体步骤中酶切过程中的酶切体系为：限制性内切酶bamhii和scai、内切酶缓冲溶液，双蒸水。其中所述将所述细胞支架基因重组载体和天冬氨酸激酶基因通过酶切、连接反应获得细胞支架聚合酶基因重组载体步骤中酶切过程中的酶切体系为：限制性内切酶hindiii和noti、内切酶缓冲溶液，双蒸水。其中所述阳性筛选具体包括以下步骤：将所述感受细胞涂布在含有100μg/ml含卡那霉素的平板培养基上进行培养，获得单菌落即为细胞支架聚合酶基因的大肠杆菌工程菌。本发明实施例提供了所述的细胞支架聚集酶制备方法获得的大肠杆菌工程菌在提高赖氨酸产率的应用。其中所述应用方法具体包括：将所述大肠杆菌工程菌进行发酵至对数期，添加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷进行诱导发酵。实施例1扩增引物设计：通过引物设计原则和多种计算机程序，设计大肠杆菌基因组中壳蛋白pdua基因、两个互补的螺旋肽cc-di-a、cc-di-b基因和天冬氨酸激酶lysc基因的扩增引物，并通过大量实验筛选出特异性高的引物序列，其中壳蛋白pdua基因扩增引物为引物1pdua-up，seqidno.1和引物2pdua-down，seqidno.2；螺旋肽cc-di-a基因扩增引物为引物3cc-di-a-up，seqidno.3和引物4cc-di-a-down，seqidno.4；螺旋肽cc-di-b基因扩增引物为引物5cc-di-b-up，seqidno.5和引物6cc-di-b-down，seqidno.6；天冬氨酸激酶lysc基因扩增引物为引物7lysc-up，seqidno.7和引物8lysc-down，seqidno.8，详见表1。表1扩增引物核苷酸序列引物名称引物序列(方向由5’→3’)pdua-upggcggtatgagagaagcgcpdua-downtttgcttcaggcctcatgctttatgctcc-di-a-upcgcggatccggcgaaatcgccgcgctcc-di-a-downttctctcataccgccctgcc-di-b-upcataaagcatgaggcctgaagcaacc-di-b-downcgagctcgccgccctgtttcaglysc-upccaagcttatgtctgaaattgttgtctlysc-downtaaagcggccgcttactcaaacaaattactatgcagtt天冬氨酸激酶lysc基因的扩增：在lysc基因设计的扩增引物中引入了酶切位点，其中引物7lysc-up中含有hindiii酶切位点，引物8lysc-down中含有noti酶切位点，以大肠杆菌基因组为模板，在扩增体系为：引物7lysc-up2.5μl，引物8lysc-down2.5μl，基因模板2.5μl，2×hifi-pcrmaster25μl，ddh2o补齐至50μl；并在扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；10min的条件下进行pcr扩增，并通过胶回收试剂盒(购置于北京索莱宝科技有限公司)回收纯化过程，获得5-端引入hindiii和3-端引入noti酶切位点的天冬氨酸激酶lysc基因扩增产物，-20℃保存。细胞支架基因的构建：在cc-di-a基因、cc-di-b基因的扩增引物中引入了酶切位点，其中引物3cc-di-a-up中含有bamhi酶切位点，引物6cc-di-b-down中含有scai酶切位点，分别通过两次重叠pcr的方式进行扩增。第一次重叠pcr以大肠杆菌基因组为模板，在扩增体系为：引物3cc-di-a-up2μl，引物2pdua-down2μl，2×taqpcrmastermix12.5μl(高保真dna聚合酶)，ddh2o补齐至50μl；并在扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，进行pcr扩增获得片段cc-di-a-pdua，-20℃保存。第二次重叠pcr以大肠杆菌基因组为模板，通过pcr扩增方式将cc-di-a-pdua片段和cc-di-b片段重叠得到片段cc-di-a-pdua-cc-di-b，在扩增体系为：引物3cc-di-a-up2μl，6cc-di-b-down2μl，2×taqpcrmastermix12.5μl(高保真dna聚合酶)，ddh2o补齐至50μl；并在扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，进行pcr扩增获得片段细胞支架基因cc-di-a-pdua-cc-di-b，-20℃保存。实施例2将实施例1获得的细胞支架基因cc-di-a-pdua-cc-di-b和大肠杆菌表达质粒pet-24a分别利用bamhi和scai限制性内切酶进行双酶切，酶切体系为：10x酶切缓冲液2.5μl，限制性内切酶各1μl，质粒/细胞支架基因16μl，ddh2o4.5μl，37℃水浴加热反应30min，酶切片段切胶回收，并在-20℃保存。将上述酶切胶回收后的细胞支架基因cc-di-a-pdua-cc-di-b和表达质粒pet-24a使用t4dna连接酶进行表达载体与目的片段连接，连接体系为：双酶切后片段c-di-a-pdua-cc-di-b5μl，双酶切后质粒pet-24a3μl，t4dnaligase(dna连接酶)1μl，10xt4dnaligasebuffer(dna连接缓冲液)1μl，在室温条件下链接反应10min，获得细胞支架基因重组载体pet-24a-cc-di-a-pdua-cc-di-b。将上述获得的细胞支架基因重组载体pet-24a-cc-di-a-pdua-cc-di-b，通过热激法转化至大肠杆菌感受态细胞中，具体操作如下：从-80℃超低温冰箱取出一支100μl感受态细胞，放置于冰上，等完全溶解后轻弹几次将细胞悬浮混匀，然后取10μl的载体连接液加入到感受态细胞中，用移液枪吸吹几次使其混匀，放置于冰上冰浴30min；在42℃水浴锅中热激90s后立即放置于冰上5-10min；然后加入400μl的不含抗生素的lb培养基，37℃200rpm振荡培养60min，为了保证阳性克隆子数量，经4000rpm，1min离心菌体后，吸除部分培养液，留下100μl上清液重悬菌体制成悬浮液，将所有的菌体悬浮液涂布在含有氨苄青霉素(100μg/ml)抗生素的平板上；平板在37℃的培养箱中正向放置于1h吸收过多的液体，然后倒置培养过夜，获得含有细胞支架基因重组载体pet-24a-cc-di-a-pdua-cc-di-b的阳性大肠杆菌，并采用质粒提取试剂盒(购自于赛默飞世尔科技有限公司)提取含有细胞支架基因重组质粒。应当理解的是，当获得的细胞支架基因重组载体pet-24a-cc-di-a-pdua-cc-di-b也可以不进行阳性筛选，在后续过程中进行统一的阳性筛选。将上述获得的细胞支架重组质粒与实施例1获得的天冬氨酸激酶lysc基因分别利用hindiii和noti限制性内切酶进行双酶切，酶切体系为：10x酶切缓冲液2.5μl，限制性内切酶各1μl，质粒/lysc基因16μl，ddh2o4.5μl，37℃水浴加热反应30min，酶切片段切胶回收，并在-20℃保存。然后将上述酶切后的细胞支架重组质粒和天冬氨酸激酶lysc基因使用t4dna连接酶进行链接反应获得细胞支架聚合酶基因重组载体pet-24a-cc-di-a-pdua-cc-di-b-lysc，连接体系为：双酶切后片段lysc5μl，双酶切后质粒pet-24a-cc-di-a-pdua-cc-di-b3μl，t4dnaligase(dna连接酶)1μl，10xt4dnaligasebuffer(dna连接缓冲液)1μl，在室温条件下链接反应10min。实施例3将实施例2构建好的细胞支架聚合酶基因重组载体pet-24a-cc-di-a-pdua-cc-di-b-lysc转化到大肠杆菌感受态细胞中，其转化过程如下：取50ul制备好的ecoli-bl21(大肠杆菌bl21)感受态细胞悬液，在冰浴中使其解冻，加入10ul连接好的表达质粒，轻轻摇匀，冰上30-40min，42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却2min，向管中加入400ullb液体培养基(不含卡那霉素)，混匀后37℃，180rpm振荡培养40min，将上述菌液摇匀后取80ul涂布于含卡那霉素(100μg/ml)的筛选平板上，在菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12-18h获得含有细胞支架聚合酶基因重组载体的大肠杆菌工程菌，并提取细胞支架聚合酶。实施例4含有细胞支架聚合酶基因重组载体的大肠杆菌工程菌发酵验证：发酵配方为：葡萄糖4g/l、玉米浆10g/l、磷酸二氢钾1g/l、磷酸氢二钾1g/l、硫酸亚铁0.2g/l、硫酸镁0.2g/l，生物素5mg/l、维生素b12mg/l，溶剂为水。将大肠杆菌工程菌接种至上述发酵配方中进行发酵，在发酵对数期od600＝0.4-0.6，添加诱导剂1mm的iptg(异丙基硫代半乳糖苷)诱导，在温度为30℃条件下诱导20h，检测发酵液中赖氨酸的含量。以不含细胞支架聚合酶基因重组载体的大肠杆菌(常规菌株)作为对照，同样的发酵和诱导过程进行发酵，测定赖氨酸的含量，并计算糖类物质转化率，结果如表2所示，同时在发酵过程中定时检测赖氨酸的含量，赖氨酸含量-诱导时间图如图1所示。表2发酵结果对比菌株赖氨酸浓度(g/l)转化率(％)常规菌株13035大肠杆菌工程菌16556由表2和图1可知，含有细胞支架聚合酶基因重组载体的大肠杆菌工程菌代谢产生的赖氨酸浓度和转化率明显增高，其转化率提高了21％，说明通过构建细胞支架，将天冬氨酸激酶锚定在细胞质的壳蛋白上，充斥着整个细胞，能够改善大肠杆菌的代谢过程，能够显著提高产物中赖氨酸的浓度，提高糖酸转化率。根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。序列表<110>山东寿光巨能金玉米开发有限公司、寿光金远东变性淀粉有限公司、寿光金玉米生物科技有限公司、临清德能金玉米生物有限公司<120>一种细胞支架聚集酶及其制备方法和应用<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ggcggtatgagagaagcgc19<210>2<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tttgcttcaggcctcatgctttatgct27<210>3<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cgcggatccggcgaaatcgccgcgct26<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ttctctcataccgccctg18<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5cataaagcatgaggcctgaagcaa24<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cgagctcgccgccctgtttcag22<210>7<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ccaagcttatgtctgaaattgttgtct27<210>8<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8taaagcggccgcttactcaaacaaattactatgcagtt38当前第1页1 2 3